專利名稱：一種多重巢式甲基化特異性pcr檢測試劑盒及其使用方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多重巢式甲基化特異性PCR (MN-MSP)檢測試劑盒及其使用方法，以及在檢測卵巢癌，特別是早期卵巢癌中的應用。
背景技術：
目前，卵巢癌發病率位居女性生殖系統惡性腫瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌癥死亡女性患者3%。卵巢癌90%以上為上皮性卵巢癌，發病隱匿，臨床確診時約80%患者疾病已為晚期，預后差。晚期卵巢癌(FIGO II -IV期)患者5年生存率僅為30 45%，而早期卵巢癌(FIG0 I期)患者5年生存率高達90%以上。因此，除積極尋找新的有效的治療方式外，探討卵巢癌發生發展的生物學機制，研發新型卵巢癌早期診斷技術迫在眉睫。
現有技術中尚無簡便有效的、精確的、可常規用于卵巢癌早期診斷的檢測方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌標志物，但僅有50 60%的I期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病如卵巢子宮內膜異位囊腫等亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特異性較差，卵巢癌陽性預測值僅有109^35%。總體而言，對于血清CA125檢測、經陰道超聲探查等傳統的早期診斷方法單一或聯合應用，目前均無證據顯示可降低人群的卵巢癌發病率和(或)病死率。其主要原因在于這些方法的假陰性或假陽性率均過高，敏感性和特異性達不到臨床需要。DNA甲基化即未甲基化胞卩密唳-憐酸-鳥嘌呤(Cytosine-phosphate-Guanosine，CpG) 二核苷酸發生甲基化，是重要的表觀遺傳學機制，是腫瘤抑制基因失活的關鍵機制之一，在某些情況下可能是唯一的機制。目前研究已證實原發性卵巢癌可有多種抑癌基因的甲基化，提示卵巢癌顯示出CpG島甲基化表型。作為癌癥發生的早期事件，抑癌基因DNA異常甲基化檢測可以在患者出現臨床表現或者影像學證據之前做到分子診斷，為卵巢癌的早期診斷提供了新的途徑。目前，研究已證實癌癥患者血清富含腫瘤DNA (Serum free circulating DNA,SfcDNA)，可用于癌癥分子生物學診斷。使用體液標本(血清、尿液等)檢測其中游離腫瘤特異DNA在其他癌癥如肺癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌等已被證實可行。更為重要的是，腫瘤游離DNA不僅在晚期轉移癌癥患者血清內存在，對于早期患者，血清內同樣可檢測到腫瘤游離DNA，研究認為其來源于侵入體內循環但無浸潤機體實質器官能力的腫瘤細胞，或是由凋亡腫瘤細胞釋放進入體內循環。因此，利用血清游離DNA (SfcDNA)進行癌癥的早期分子生物學診斷是當前研究的一大熱點。雖然國內外研究者利用卵巢癌患者血清游離DNA甲基化檢測，在卵巢癌早期診斷中的研究取得了令人振奮的進步，但是在實際操作過程中存在以下局限性1、血清游離DNA微量(正常人濃度平均為0. 03ug/ml，腫瘤患者濃度平均為0. 18ug/ml )，并且多以小片段形式存在，大大增加了提取的難度，降低了臨床檢測的敏感性和特異性；2、目前DNA甲基化的主要研究方法為甲基化特異性PCR (Methylation Specific PCR，MSP)，其操作繁瑣，DNA經亞硫酸氫鹽修飾后丟失嚴重，一般只用于單個基因檢測，特異性和敏感性均較低；3、卵巢癌抑癌基因失活的不確定性及血清游離DNA的局限性，導致單一卵巢癌甲基化標記物檢測無法滿足臨床要求。
發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一種多重巢式甲基化特異性PCR (MN-MSP)檢測試劑盒及其使用方法，以及其在檢測卵巢癌，特別是早期卵巢癌中的應用。本發明的多重巢式甲基化特異性PCR (MN-MSP)檢測技術，在國內外首次將多重PCR (Multiplex PCR)、巢式PCR (Nested PCR)與甲基化特異性PCR (MSP)相結合，利用課題組開發的引物設計軟件設計全新的PCR引物，并模擬整個PCR過程，避免PCR過程中引物二聚體、發卡結構等的形成，同時創新性的應用兩步爬坡緩慢退火(Ramping anneal)的方法,保證引物與模板結合的特異性，最大限度地克服了血清游離DNA微量及單一甲基化標記物敏感性、特異性不高的缺點，可實現最低達l/8000ug DNA (約相當于19個基因組DNA)中7個目的基因甲基化狀態的高效檢測，并經臨床標本反復驗證，對現有檢測技術提供了有力補充，成為一種有效的早期卵巢癌診斷檢測手段。 本發明是通過以下技術方案實現的一種多重巢式甲基化特異性PCR檢測試劑盒，由以下物質組成①針對7 種目的基因 APC, RASSF1A, CDHl, RUNX3, TFPI2, SFRP5 和 OPCML 的引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 42所示，如表I所示；每條引物的濃度為lmmol/L，用量為Iul ；②常規PCR 工作液，比如PCR 工作液 2X(MIX):2U AmpliTaqt 360DNA Polymerase ；40mM Tris-HCL (pH8. 8) ；20mM KCL ；20mM (NH4)2SO4 ；4mM MgSO4 ；1. 6mM dNTPs。表I.多重巢式甲基化特異性PCR (MN-MSP)檢測引物(說明引物中存在簡并位點(degeneration)，即Y=C/T,R=G/A)
權利要求
1.ー種多重巢式甲基化特異性PCR檢測試劑盒，其特征在于由以下物質組成 ①針對7種目的基因APC,RASSF1A, CDHl, RUNX3, TFPI2, SFRP5和OPCML的引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 42所示； ②常規PCR工作液。
2.根據權利要求I所述的ー種多重巢式甲基化特異性PCR檢測試劑盒，其特征在干所述每條引物的濃度為lmmol/L，用量為Iul ;所述PCR工作液為PCR工作液2X:·2U AmpIiTaq* 360DNA Polymerase ；40mM Tris-HCL ；20mMKCL ；20mM(NH4)2SO4 ；4mM MgSO4 ；·I.6mM dNTPs。
3.權利要求I或2所述的多重巢式甲基化特異性PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于 步驟如下 (1)血清游離DNA的提取取患者血清，提取DNA，得DNA溶液； (2)血清游離DNA甲基化修飾取DNA溶液，進行甲基化修飾，得修飾后DNA溶液； (3)PCR 檢測 Stepl PCR 反應體系------Outside 模板lul------修飾后DNA溶液； 引物lul------7種目的基因Outside Primer按照等比例混合；MIX 10ul ；Enhancer 2ul ；ddH20 6ul ； PCR反應條件------Outside · 95 °CSmin·95 0C30sI ·50*0Imin·50*C-60pC0.2*C/s V 35 循環·60V10s··72 °C45s j ·ITCIOmin ·4°CForever St印2 PCR反應體系------Inside 模板lul------取St印I產物DNAlul ； 引物lul------7種目的基因Inside Primer按照等比例混合；MIX 10ul ；Enhancer 2ul ；ddH20 6ul ； PCR反應條件------Inside ·95 °CSmin ·95 0C30s、 ·50 °CImin ·50V-60V O.rC/s I 25 循環 ·60 0C15s ·72 "C30sj ·72 °CIOmin ·4°CForever； (4)PCR結果判斷取St印2所得產物10ul，4%瓊脂糖凝膠中150v電泳90min，凝膠放置凝膠成像系統進行拍照分析，肉眼判斷反應結果 ①若M體系中出現任ー陽性條帶，判定結果為陽性； ②若M體系中無陽性條帶，U體系中出現任ー陽性條帶，判定結果為陰性； ③若M、U體系中均無陽性條帶，判定送檢血清不合格，重新送檢。
4.權利要求I或2所述的多重巢式甲基化特異性PCR檢測試劑盒在早期上皮性卵巣癌診斷中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種多重巢式甲基化特異性PCR檢測試劑盒，由以下物質組成①核苷酸序列如SEQ ID NO.1～42所示的引物；②PCR工作液。所述多重巢式甲基化特異性PCR檢測試劑盒的使用方法，步驟如下(1)取患者血清提取DNA；(2)取DNA溶液，進行甲基化修飾；(3)使用試劑盒進行PCR檢測；(4)結果判斷取所得產物，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠放置凝膠成像系統進行拍照分析，肉眼判斷反應結果。本發明的多重巢式甲基化特異性PCR(MN-MSP)檢測技術，最大限度地克服了血清游離DNA微量及單一甲基化標記物敏感性、特異性不高的缺點，實現了對7個目的基因甲基化狀態的高效檢測，具有特異性強、準確性高等優點，可作為一種有效的早期上皮性卵巢癌診斷檢測手段。
文檔編號C12Q1/68GK102732637SQ20121024864
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月17日 優先權日2012年7月17日
發明者孔北華, 張青 申請人:山東大學齊魯醫院