專利名稱：一種培養基及其應用與賴氨酸搖瓶發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種特別適用于賴氨酸搖瓶發酵的培養基及其在賴氨酸搖瓶發酵中的應用以及使用該培養基進行賴氨酸搖瓶發酵的方法。
背景技術：
在賴氨酸發酵過程中，隨著營養物質的消耗，發酵液pH值會不斷下降，因此需要定時添加氨水或液氨來控制PH值以保證菌種的正常生長代謝，獲得高含量的賴氨酸。尤其在進行賴氨酸的搖瓶發酵以獲得賴氨酸產量高的菌株時，目前一般通過人工定時取樣檢測pH值并滴加氨水或液氨來調節pH值。但是人工調節pH值不好把握分寸，每次添加氨水或液氨至少需要進行2次pH值的測定，調節PH值耗費的時間較長且很容易添加過量，從而影響發酵結果。而且頻繁取樣檢測會加大染菌的幾率。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種培養基及其在賴氨酸搖瓶發酵中的應用以及使用該培養基進行賴氨酸搖瓶發酵的方法。為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種培養基，該培養基含有碳源、氮源、無機鹽和水，其特征在于，該培養基還含有指示劑，所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8。另一方面,本發明提供一種上述培養基在賴氨酸搖瓶發酵中的應用。再一方面，本發明提供一種賴氨酸搖瓶發酵方法，該方法包括將賴氨酸發酵菌種接種到培養基中進行搖瓶發酵，其特征在于，所述培養基為上述培養基。通過上述技術方案，操作人員不需要進行取樣檢測pH值即可以直接根據培養基的顏色變化確定補加氨水或液氨的時間和加量，簡化了發酵操作過程，縮短了調節pH值耗費的時間，降低了操作人員的勞動強度，進而降低了染菌幾率。另外，添加的指示劑不會對發酵產生負面影響。因此，使用本發明的培養基進行賴氨酸搖瓶發酵時，發酵的穩定性明顯增強。本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細說明。
具體實施例方式以下對本發明的具體實施方式
進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。本發明中，術語“波美度”是表示溶液濃度的一種方法，是通過波美比重計檢測溶液得到的度數；“發酵液”是指接種了微生物菌種的液體發酵培養基，經過一段時間的培養后所得產物；“指示劑的變色pH范圍”指的是指示劑的變色pH點所在的范圍。本發明的培養基含有碳源、氮源、無機鹽和水，其特征在于，該培養基還含有指示齊U，所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8。
本領域技術人員所公知的是指示劑一般以溶液的形式使用，可以直接商購獲得，也可以購買粉末狀產品再配制成溶液使用，且配制時使用的溶劑和配制方法為常規試劑與方法，例如，中性紅一般以0. 1-0. 3重量％濃度的溶液形式使用，配制方法包括先將0. 1-0. 3克中性紅溶于60ml濃度為100%的乙醇中，再加水至100ml。根據本發明，相對于每升培養基，所述指示劑的添加量優選為0. 002-0. 012克。當指示劑的添加量在上述優選范圍內時，顯色明顯且不會對賴氨酸發酵產生影響。需要說明的是，本發明中，指示劑的添加量以指示劑的干重計，即當所述指示劑以溶液形式使用時，指示劑的添加量不包括其中溶劑的量。根據本發明，只要所述指示劑的變色pH范圍在上述范圍內即可實現本發明的目 的，優選地，所述指示劑的變色pH范圍為6. 5-8。優選地，所述指示劑為中性紅、溴百里酚藍、酚紅、苯酚紅和石蕊中的一種。根據本發明，所述培養基可以作為種子培養基，也可以作為發酵培養基，所述種子培養基與發酵培養基可以相同或不同。根據本發明，只要往培養基中添加指示劑即可實現本發明的目的，對培養基的其他成分(碳源、氮源和無機鹽)無特殊要求，可以采用本領域常規使用的物質，例如，可以用淀粉質原料糖化清液、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、蘇氨酸和蛋氨酸等配制種子培養基。根據本發明，每升種子培養基中各原料的用量可以在很大范圍內改變，優選情況下，相對于每升種子培養基，淀粉質原料糖化清液的用量可以為30-40克，玉米漿(干重為20-50重量％)的用量可以為70-90克，磷酸氫二鉀的用量可以為0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-1. I克,硫酸銨的用量可以為5-15克,蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 6克,蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克。可以用淀粉質原料糖化清液、糖蜜、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制發酵培養基。根據本發明，每升發酵培養基中各原料的用量可以在很大范圍內改變，優選情況下，相對于每升發酵培養基，淀粉質原料糖化清液的用量可以為40-60克，糖蜜的用量可以為30-50克，玉米漿(干重為20-50重量％)的用量可以為20-40克，硫酸銨的用量可以為20-40克，磷酸氫二鉀的用量可以為0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-0. 6克,蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克,蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克,谷氨酸的用量可以為0. 2-0. 4克。所述淀粉質原料糖化清液既可以采用干法制糖工藝制備，也可以采用濕法制糖工藝制備。從工藝簡單、設備投資少，生產成本較低的方面考慮，優選通過干法制糖工藝制備。干法制糖工藝是指淀粉質原料不經浸泡直接進行破碎和酶解。干法制糖工藝可以包括將淀粉質原料粉碎，將淀粉質原料粉碎后的產物調漿，并加入淀粉酶對淀粉進行第一次水解；對第一次水解產物進行固液分離，并在得到的液相組分中加入糖化酶進行第二次水解，得到淀粉質原料糖化清液。其中，所述調漿的方法為本領域技術人員所熟知，優選地，調漿的方法可以包括將淀粉質原料粉碎后的產物加入到水中混合均勻，水的加入量使得到的漿液的波美度可以為9-17B6。；所述淀粉質原料可以為本領域公知的各種可以用于酶解、發酵制備賴氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以為選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種。本發明中，所述淀粉質原料糖化清液中的葡萄糖含量為96-98重量％。上述種子培養基或發酵培養基中，所述淀粉質原料糖化清液可以由葡萄糖代替，相對于每升種子培養基，葡萄糖的添加量為28-39. 5克；相對于每升發酵培養基，葡萄糖的添加量為38-60克。本發明還提供一種上述的培養基在賴氨酸搖瓶發酵中的應用。本發明的賴氨酸搖瓶發酵方法包括將賴氨酸發酵菌種接種到培養基中進行搖瓶發酵，其特征在于，所述培養基為上述的培養基。本發明的發明人發現，隨著發酵過程中硫酸銨等營養物質的消耗，發酵液的pH值逐漸下降，當PH值降至5. 4時，菌種代謝活動基本停止且不再產酸，但只要在pH降至5. 4后的3h內將發酵液的pH值調節到6. 8-7. 4，菌種又可以基本恢復產酸能力。因此，選用變色PH范圍為5. 5-8的指示劑即可實現本發明的目的，優選情況下，選用變色pH范圍為6. 5-8的指示劑。
本發明中，所述賴氨酸發酵菌種可以為本領域常規使用的賴氨酸發酵菌種，例如可以為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(Escherichia Coli)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的至少一種。本發明中，對所述賴氨酸搖瓶發酵的條件沒有特殊限定，優選情況下，所述發酵的條件包括溫度為30-38°C，pH值為6. 8-7. 4，時間為28_36h，搖床的轉速為180_210rpm。本發明中，在搖瓶發酵過程中，可以通過添加氨水和/或液氨的方式調節pH值為6. 8-7. 4。本發明的發明人發現，使用上述發酵培養基進行賴氨酸搖瓶發酵時，每2小時觀察發酵液的顏色變化并補加氨水和/或液氨時(本文中的每2小時表示如果8:00am觀察發酵液的顏色變化并補加了氨水和/或液氨，那么等到10:00am時再觀察發酵液的顏色變化并補加氨水和/或液氨，依此類推)，可以獲得較佳的發酵結果并在最大程度上減輕操作人員的勞動強度。本領域技術人員應該理解的是，賴氨酸發酵菌種在被接種至培養基中之前，采用常規方法將賴氨酸發酵菌種依次經過菌種活化和種子培養。種子培養的培養程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、OD (optical density)值測定對產賴氨酸微生物的生長進行觀察，當通過上述方法觀察菌體形態正常、測定OD值達到0. 08以上時停止培養，將此時的種子液稱為成熟種子液。然后再將成熟種子液接入培養基中。因此，本發明中，賴氨酸發酵菌種的接種量為12-18體積％，指的是接入發酵培養基中的成熟種子液的體積占接入成熟種子液后發酵培養基體積的12-18%。以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。以下實施例中，成熟種子液的培養方法包括配制種子培養基(具體組成為相對于每升培養基，葡萄糖的用量為35克，玉米漿(干重為35重量％)的用量為80克，磷酸氫二鉀的用量為I. 0克，硫酸鎂的用量為0. 5克，硫酸銨的用量為10克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克)，121°C、102. 9kPa滅菌30分鐘，將活化后的黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購自江南大學)接入冷卻后的種子培養基中進行培養，培養過程中120分鐘后，根據菌體生長情況每隔60分鐘取樣鏡檢并測定OD值，當鏡檢菌體形態正常且OD值達到0. 8時停止培養，得到成熟種子液。以下實施例中，發酵培養基的配方為相對于每升發酵培養基，葡萄糖的用量為50克，糖蜜(產地新疆)的用量為40克，玉米漿(干重為35重量％)的用量為30克，硫酸銨的用量為30克,磷酸氫二鉀的用量為I. 0克,硫酸鎂的用量為0. 5克,蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克，谷氨酸的用量為0. 3克，適量的指示劑，調節pH值為6. 8。以下實施例中，按照GB10794-89標準檢測發酵液中的賴氨酸含量(以賴氨酸鹽酸鹽計);按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發酵液中還原性糖的濃度；pH值的檢測使用梅特勒DeLTA320pH計；轉化率(％)=產酸量/耗糖量X 100%，其中，產酸量等于發酵終點發酵液中的賴氨酸含量X發酵終點體積；耗糖量等于發酵培養基中還原性糖質量減去發酵終點發酵液中還原性糖質量；賴氨酸搖瓶發酵的穩定性通過計算發酵結束后三個500ml三角燒瓶中發酵液中賴氨酸含量的標準差來判斷，標準差值越小，表明搖瓶發酵的穩定性越高，標
準差的計算公式為
權利要求
1.一種培養基，該培養基含有碳源、氮源、無機鹽和水，其特征在于，該培養基還含有指示劑，所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8O
2.根據權利要求I所述的培養基，其中，所述指示劑的變色pH范圍為6.5-8。
3.根據權利要求I所述的培養基，其中，相對于每升培養基，所述指示劑的添加量為O. 002-0. 012 克。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的培養基，其中，所述指示劑為中性紅、溴百里酚藍、酚紅、苯酚紅和石蕊中的一種。
5.權利要求1-4中任意一項所述的培養基在賴氨酸搖瓶發酵中的應用。
6.一種賴氨酸搖瓶發酵方法，該方法包括將賴氨酸發酵菌種接種到培養基中進行搖瓶發酵，其特征在于，所述培養基為權利要求1-4中任意一項所述的培養基。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述賴氨酸發酵菌種為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(Escherichia Coli)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的至少一種。
8.根據權利要求6所述的方法，其中，所述搖瓶發酵的條件包括溫度為30-38°C，pH值為6. 8-7. 4，時間為28-36h，搖床的轉速為180_210rpm。
9.根據權利要求6所述的方法，其中，在所述搖瓶發酵過程中，通過添加氨水和/或液氨的方式調節PH值為6. 8-7. 4。
全文摘要
本發明公開了一種培養基及其在賴氨酸搖瓶發酵中的應用與利用該培養基的賴氨酸搖瓶發酵方法，該培養基含有碳源、氮源、無機鹽和水，其特征在于，該培養基還含有指示劑，所述指示劑的變色pH范圍為5.5-8。通過上述技術方案，操作人員不需要進行取樣檢測pH值即可以直接根據培養基的顏色變化確定補加氨水或液氨的時間和加量，簡化了發酵操作過程，縮短了調節pH值耗費的時間，降低了操作人員的勞動強度，進而降低了染菌幾率。另外，添加的指示劑不會對發酵產生負面影響。因此，使用本發明的培養基進行賴氨酸搖瓶發酵時，發酵的穩定性明顯增強。
文檔編號C12R1/19GK102766662SQ20121026847
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月30日 優先權日2012年7月30日
發明者馮志菲, 盧宗梅, 吳曉艷, 張軍華, 熊結青 申請人:中糧生物化學(安徽)股份有限公司