專利名稱：食品及飲料中芒果源性成分快速篩查試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬于食品及飲料中植物源性成分芒果DNA檢測技術，具體地說是使用實時熒光PCR反應技術對食品及飲料中芒果進行快速篩選與檢測的方法，方法包括DNA的提取、實時熒光PCR擴增和結果判定。其優點是快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、重復性好。
背景技術：
芒果mango,學名Mangifera indica Linn.,別名檬果、潘果、悶果、蜜望、望果、面果和庵波羅果，屬漆樹科(Anacardiaceae)芒果屬。芒果不僅果肉豐厚甜美，而且有助于美容養顏和減肥，有“熱帶果王”之譽稱。全世界約有1000多個芒果品種，而且芒果經常被加工成芒果汁、食品、雪糕、酸奶、糖等。芒果肉質香甜可ロ是深受人們喜愛的熱帶水果。芒果雖然味美營養豐富，但因其性濕熱，多食不但無益反而有害，尤其是有些人對芒果會有敏感癥狀，因此芒果也是常見的水果過敏原之一。近年來因芒果過敏的患者越來越多，出現ロ 瘡，水果疹，口腔麻癢，嚴重的會出現哮喘和過敏性休克等癥狀。芒果食品加工品在進行加エ處理后中，往往失去芒果可鑒別的形態特征，為芒果食品鑒別帶來不便。隨著芒果制品及飲料不斷擴大，不法制造商為節約成本，采用食品添加原料以次充好，冒充純天然果汁制造水果加工品，擾亂加工市場。為了保護公眾權益，建立可靠的芒果的檢測方法迫在眉睫。食品中是否混有芒果源性成分，尚沒有ー個快速的判定方法。大部分消費者需求判斷含有芒果源性成分的方法，少數消費者由于對芒果過敏需求不含芒果成分的食品加工品。消費者的生活質量需要過硬的檢測方法和依據來保證。
發明內容
本發明的目的是針對芒果ITS2基因設計ー組特異性引物，建立ー種在食品及飲料中快速篩選和檢測芒果源性成分實時熒光PCR檢測方法，以克服基于外部形態檢測方法在食品加工產品檢測中的局限性，為食品及飲料中芒果產品檢測提供快速檢測的方法。本發明的主要原理為設計ー組可以特異地識別芒果序列的引物對和探針，完善實驗體系和反應條件，通過實時熒光PCR反應使靶DNA快速累積到IO9 101°拷貝，經過熒光擴增曲線、Ct值判別擴增結果。本發明中建立的成熟的實驗方法可保證在食品、飲料等加工制品中檢出芒果源性成分。該方法省略了瓊脂糖電泳等過程，可以直接用熒光PCR觀察擴增曲線進行判讀，簡單而快速特別適用于ー些檢測ー線的單位。快速檢測芒果源性成分的試劑盒包括PCR擴增反應液、陽性對照DNA兩種特征性部分；反應體系總體積為25 μ L，其中含樣品DNA(10yg/mL-100yg/mL)2yL，芒果引物對(10ymol/L)各 O. 5 μ L，芒果探針(10ymol/L) I μ L，Taq DNA聚合酶(5U/ μ L) 0. 5 μ 1，dNTP (10 μ mol/L) 2 μ L，10 X PCR緩沖液2. 5 μ L,水補足至總體積25 μし也可采用商品化的實時熒光PCR擴增體系，反應預混液Real time Mix 10 μ L、10 Ii mol/L上游引物0. 5 u L>10 u mol/L下游引物0. 5 u L>10 u mol/L探針I u L和模板成分2 U I,加ddH20 (滅菌雙蒸水)補足至25 ii I。本發明涉及的實時熒光PCR擴增檢測用的引物和探針，其序列如下(I)上游引物5’ -TCTGAGTTCTCGGTGACGCTTTC-3 ；(2)下游引物5’ -CCGGTCTCTAGGGTCGAAGAGC-3’ ；(3)探針序列5’ -FAM-ATCCTGTCGTGCGGTTGCGITCTCC-TAMRA-3’。在實際應用中，上游引物、下游引物和探針的體積比為1 : I : 2。陽性對照DNA為含有芒果源性成分的DNA提取液。 實時熒光PCR檢測食品加工產品中芒果成分的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)(I)待檢樣品DNA的提取A.稱取0. Ig樣品，轉至I. 5mL離心管中。加入600 U L預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 u L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60 ii L RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L緩沖液,上下顛倒混勻10次；E.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加A 200 u L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；G.在離心柱中加入200ii L70%こ醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟ー次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個新的I. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 ii L洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應的模板。(2) PCR 擴增A.在擴增反應管中加入 Real time Mix 10 ii L、10 ii mol/L 上游引物 0. 5 ii L、10 V- mol/L下游引物0. 5 ii L、10 ii mol/L探針I ii L、ddH20(滅菌雙蒸水)補足至25 ii I,混勻；B.在擴增反應管中加入待檢樣品DNA2 ii L (約200ng)，混勻；C.在熒光PCR儀中進行PCR反應40-45個循環，程序為預變性95°C 3min，40-45 個循環95°C 15s，60°C 30s。(3)結果檢測實時熒光PCR反應結束后，儀器自動分析數據，得出Ct值和擴增曲線。總體看曲線拐點清楚，指數其明顯，擴增曲線整體平行性好，基線無上揚現象，方由Ct值判斷結果。根據熒光信號的Ct值進行判斷，當待測樣品的基因檢測Ct值大于或等于45，陽性對照和空白對照結果正常，則可判斷為樣品中未檢出芒果基因，樣品中不含有芒果源性成分。
當待測樣品的結構特異性基因檢測Ct值小于或等于36，陽性對照和空白對照結果正常，則可判斷為樣品中檢出芒果基因，樣品中含有芒果源性成分。當待檢測樣品結構特異性基因檢測Ct值大于36小于45，應重做實時熒光PCR檢測，若重做后Ct值仍小于45，陽性對照和空白對照結果正常，則可判斷為樣品中檢出芒果基因；若重做后Ct值大于45，且陽性對照和空白對照結果正常，則可判斷為樣品中未檢出芒果基因。
圖I多個品種芒果的ITS2基因片段實時熒光PCR圖譜。圖2不同稀釋度臺芒DNA溶液的實時熒光PCR擴增圖及2種未知濃度芒果果汁飲料擴增圖。·
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進ー步說明。實施例I按照以下程序進行檢測(I)待測可能含芒果成分樣品DNA的提取A.稱取O. Ig樣品，轉至I. 5mL離心管中。加入600 μ L預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 μ L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60yL RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 μ L緩沖液,上下顛倒混勻10次；Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加Λ 200 μ L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；G.在離心柱中加入200μ L70%こ醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟ー次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個新的I. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 μ L洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應的模板。(2)待測含芒果成分飲料PCR擴增A.在擴增反應管中加入熒光PCR反應預混液Real time Mix 10 μ L、10 μ mol/L上游引物O. 5 μ L、10 μ mol/L下游引物O. 5 μ L、10 μ mol/L探針I μ L、ddH20(滅菌雙蒸水)補足至25 μ 1，混勻；B.在擴增反應管中加入待檢樣品DNA 2 μ L (約200ng)，混勻；C.在ABI 7900熒光PCR儀中進行PCR反應，程序為
95°C 3min，45 個循環95で 15s,60°C 30s。(3)結果檢測實時熒光PCR反應結束后，儀器自動分析數據，得出Ct值和擴增曲線。總體看曲線拐點清楚，指數其明顯，擴增曲線整體平行性好，基線無上揚現象，由Ct值判斷結果。 根據熒光信號的Ct值進行判斷，待測樣品的基因檢測Ct值位于20-36之間，陽性對照和空白對照結果正常，判斷為樣品中檢出芒果基因。
權利要求
1.快速檢測芒果源性成分的試劑盒包括Pc R擴增反應液、陽性對照D N A兩種特征性部分 P C R擴增反應液總體積為25iiL，其中含樣品DNA(10iig/mL-100iig/mL)2iiL，芒果引物對(10iimol/L)liiL，芒果探針(10umol/L)luL, Taq DNA 聚合酶(5U/u L) 0. 5 U I,dNTP(10umol/L)2u L, 10 XPCR緩沖液2. 5 y L，水補足至總體積25 yし也可采用商品化的實時熒光PCR擴增體系，反應預混液Real time Mix 10 y L、10 y mol/L上游引物0. 5 y L、10 u mol/L下游引物0. 5 u L>10 u mol/L探針I ii L和模板成分2 ii I,加ddH20(滅菌雙蒸水)補足至25u I0 本發明涉及的實時熒光PCR擴增檢測用的引物和探針，其序列如下 (1)上游引物5’-TCTGAGTTCTCGGTGACGCTTTC-3 ；· (2)下游引物5’-CCGGTCTCTAGGGTCGAAGAGC-3’ ； (3)探針序列5’-FAM-ATCCTGTCGTGCGGTTGCGITCTCC-TAMRA-3’。
在實際應用中，上游引物、下游引物和探針的體積比為1 : I : 2。
陽性對照DNA為含有芒果源性成分的DNA提取液。
2.芒果源性成分快速檢測方法包括食品DN A的提取、實時熒光P C R擴增和結果判定。
食品DNA提取 采用酚-氯仿DNA提取方法或等同采用相同方法的DNA提取試劑盒。
PCR擴增 在熒光PCR儀中進行PCR反應40-45個循環，程序為 預變性 950C 3min, 40-45 個循環95°C 15s，60。。30s。
結果判定 實時熒光PCR反應結束后，儀器自動分析數據，得出Ct值和擴增曲線。總體看曲線拐點清楚，指數其明顯，擴增曲線整體平行性好，基線無上揚現象，方由Ct值判斷結果。
當待測樣品的基因檢測Ct值大于或等于45，陽性對照和空白對照結果正常，則可判斷為樣品中未檢出芒果基因，樣品中不含有芒果源性成分。
當待測樣品的結構特異性基因檢測Ct值小于或等于36，陽性對照和空白對照結果正常，則可判斷為樣品中檢出芒果基因，樣品中含有芒果源性成分。
當待檢測樣品結構特異性基因檢測Ct值大于36小于45，應重做實時熒光PCR檢測，若重做后Ct值仍小于45，陽性對照和空白對照結果正常，則可判斷為樣品中檢出芒果基因；若重做后Ct值大于45，且陽性對照和空白對照結果正常，則可判斷為樣品中未檢出芒果基因。
全文摘要
本發明屬于食品及飲料中芒果源性成分的快速篩查試劑盒與檢測技術，具體是使用實時熒光PCR技術檢測芒果的ITS2基因基因片段。本發明針對芒果源性成分采用實時熒光PCR技術，快速、靈敏、特異地檢測內含基因，從而篩選食品及飲料中是否含芒果源性成分。該快速篩查試劑盒及檢測技術用于檢測混合樣品中可能含有過敏原芒果成分，也可以用于檢測樣品中是否不含有芒果成分。該方法快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、重復性好。
文檔編號C12Q1/68GK102839212SQ20121026857
公開日2012年12月26日 申請日期2012年7月18日 優先權日2012年7月18日
發明者劉彩霞, 高宏偉, 孫敏, 龔方, 徐彪, 梁成珠 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心