豬amy2基因的一個可用于溯源的snp分子標記及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬AMY2基因的一個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法。所述的SNP分子標記是通過DNA池測序獲得，共1060bp，其包含部分第五外顯子，部分第七外顯子和完整的第五內含子，第六外顯子和第六內含子序列，且第104位堿基處有一個堿基突變104C→104T，其DNA序列如SEQ?ID?NO?1所示，編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?2所示。該SNP分子標記在商品豬培育中，可以廣泛用于豬肉產品DNA溯源及其檢測，特別是用于豬肉產品的安全性溯源。
【專利說明】豬AMY2基因的一個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬食品安全領域，涉及豬AMY2基因的ー個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]豬肉制品作為人膳食中重要的蛋白質來源，如何確保其安全衛生，保障消費者的身體健康和生命安全已成為全球性的熱點問題。世界各國政府紛紛采取一系列的技術措施來強化對肉產品的安全管理，以期最大程度上減少食品安全事件的發生。我國各大城市也紛紛建立了肉產品的追溯系統，通過肉制品的溯源管理，能夠為消費者提供準確而詳細的有關產品的信息，有利于生產經營者及時發現各環節中存在的不安全隱患，為消費者提供一個獲取有效可靠信息的途徑。更為重要的是，大大加強了政府部門對肉質品質量安全的監管，為國家迅速建立食品安全風險的應對機制提供有效信息，將有助于社會的安定。
[0003]但是我國肉產品追溯系統所采用的標簽技術存在標簽丟失、記錄出差、標記圖案模糊不清以及標簽容易人為改換等缺點；而國外發達國家所采用的DNA溯源技術是基于個體DNA指紋圖譜的生物學技術，有著絕對的不可更改性和唯一性，不受人為因素影響。而且因為DNA溯源技術容易分型、重復性好、檢測手段簡單快捷、成本低廉等成為目前國際上被公認為最具發展潛力和應用價值的快速溯源技木。
[0004]DNA溯源技術的產生源于DNA的遺傳與變異，用于構建個體DNA指紋圖譜的分子標記有AFLP標記(擴增片段長度多態性)、SSR標記(微衛星標記)和SNP標記(單核苷酸多態性)。
[0005]AFLP具有的高度可靠·性和操作簡便性，但是AFLP存在著對模板反應表現遲鈍、譜帶可能發生錯配與缺失、成本相對比較高等缺點。相比SNP標記，微衛星標記的等位基因眾多，多態豐富，但也正因如此，使得SSR標記的帶型復雜，給DNA指紋識別自動化和規模化帶來困難。SNP標記是第三代分子遺傳標記，是指基因組同一位點上單個核苷酸的變異，一般表現為二等位基因，非常適宜高通量自動化分析，所以日益成為動物身份識別最受關注的分子標記。
[0006]但是用于肉產品溯源的SNP標記不同于一般的SNP標記，對于單個的SNP標記，它必須至少具有以下特征:(1)變異度高，在品種或品系中等位基因頻率接近；(2)品種間等位基因分布頻率差異小；(3)雜合度大于等于0.3。
[0007]在長期的育種工作中，研究者積累了大量的SNP標記，但是這些SNP標記往往集中分布在某些染色體上，如I號染色體，12號染色體等，而另外部分染色體，如4號，8號，14號，18號染色體等則缺乏SNP標記，因此為了滿足對豬肉產品進行DNA溯源的要求，我們進行新SNP標記的研究工作。
[0008]豬AMY2 (amylase, alpha 2B)基因稱為胰腺淀粉酶基因，位于豬的第4號染色體上。AMY2基因在人類，羊和雞中已有研究，該基因跟代謝途徑存在關聯。
【發明內容】
[0009]本發明所要解決的技術問題在于提供豬AMY2基因的ー個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法，該SNP分子標記在商品豬培育中，可以廣泛用于豬肉產品DNA溯源及其檢測，特別是用于豬肉產品的安全性溯源。
[0010]為實現上述目的，本發明采用以下技術方案。
[0011]所述的豬AMY2基因的ー個可用于溯源的SNP分子標記，共1060bp，包含部分第五外顯子，部分第七外顯子和完整的第五內含子，第六外顯子和第六內含子序列，且第104位堿基處有ー個堿基突變104C — 104T，其DNA序列具體如SEQ ID NO I所示。
[0012]所述的SNP分子標記編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0013]所述的SNP分子標記是通過DNA池(pool)測序獲得，并在包括10個豬品種或品系的試驗群體(共計235個個體)中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發現該分子標記在不同的品種和品系中的等位基因頻率接近，多態性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，初歩判定該SNP標記可用作豬肉產品DNA溯源。
[0014]所述的豬AMY2基因的ー個可用于溯源的SNP分子標記的檢測方法，采用PCR-Eco911-RFLP方法進行，包括以下步驟:
[0015](I)構建豬的 DNA 池(pool);
[0016](2)設計正、反向引物分離AMY2基因的DNA片段，測序并分析；
[0017](3)PCR-Eco911-RFLP檢測方法的建立及突變位點的檢測；
[0018](4)采集10個品種和品系的耳組織樣，共計235個個體；
[0019](5)檢測SNP分子標記在試驗群體的分布，統計分析，并進ー步試驗驗證是否適用于豬肉產品溯源。
[0020]其中，上述檢測方法中，分離AMY2基因的DNA片段的正、反向引物序列如下:
[0021]正向引物:5’-GCAAGTGGAGTGGAGAGAAG-3’(序列SEQ ID No 3)
[0022]反向引物:5’-ACTCGTGTGAATCCGTAAGG-3’(序列SEQ ID No 4)
[0023]本發明采用DNA池檢測到豬AMY2基因存在的ー個SNP分子標記，在包括10個豬品種或品系的試驗群體中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發現該SNP分子標記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，并且雜合度都大于0.3，初歩判定該SNP分子標記可用作豬肉產品DNA溯源以及豬肉產品的安全性溯源中。
[0024]由于單個SNP分子標記是無法完成溯源的，因此在溯源模擬試驗中，將本發明獲得該AMY2基因的SNP分子標記的位點與其它現有已公開的SNP分子標記位點結合在一起進行溯源實驗(共計12個SNP位點)，在屠宰場隨機挑選的100個個體中，檢測每個個體12個SNP位點的基因型，統計每個個體的基因型結果，發現100個個體均擁有各自不通的基因型，能實現個體區分；同時，隨機在這100個個體中挑取20份肌肉樣，同樣檢測統計12個SNP分子標記位點的基因型，然后跟100個個體的基因型進行比對分析，發現均能找到與20份肌肉樣品基因型完全一致的個體，即通過溯源在100個個體中找到20份豬肌肉的來源個體，因此判定本發明的該SNP分子標記可以用于豬肉產品溯源。【具體實施方式】
[0025]以下結合具體實施例進ー步詳細描述本發明的技術方案。
[0026]實施例1分子標記的查找
[0027](1)DNA 池(pool)的構建
[0028]分別隨機采集杜洛克豬、梅山豬個體各2頭(不分性別)的耳組織，提取DNA后，等量吸取4個個體的DNA放入同一離心管中，混勻待用。
[0029](2)引物設計
[0030]以豬AMY2基因的DNA序列(Genbank:NC_010446)為模板，設計引物分離豬AMY2基因(以ー頭申農豬的DNA為PCR擴增的模板)，引物如下:
[0031]正向引物:5’-GCAAGTGGAGTGGAGAGAAG-3’(SEQ ID No 3)
[0032]反向引物:5，-ACTCGTGTGAATCCGTAAGG-3’(SEQ ID No 4)
[0033]PCR反應總體積為 20 μ1，其中豬 AMY2 基因組DNA約 lOOng，含 1 Xbuffer(Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2, dNTP (上海生工生物公司)終濃度為150 y mol/L，引物終濃度為
0.2 u mol/L, 2U Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)。
[0034]PCR 擴增程序為:94°C 4min, (94°C 30s，62°C退火 40s，72°C 40s)循環 30 次，最后72°C延伸 lOmin。
[0035]PCR反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0036](3)克隆測序分析
[0037]將得到的豬AMY2基因PCR產物按照下述方法進行克隆。
[0038]PCR產物的純化:在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，用PCR產物純化試劑盒(天根生化科技有限公司)純化。
[0039]連接反應:將純化的PCR產物與pMD 18-T載體(大連寶生物公司)連接，連接反應總體積是1Oul，其中包括5 μl solution I (大連寶生物公司)，0.5 μl的T載體(大連寶生物公司)，2.5μI的純化PCR產物，最后加入2 μl滅菌水置4°C水浴過夜。
[0040]轉化:無菌狀態下取100-120 μl感受態細胞(天根生化科技有限公司)于1.5mlEpendorff管中，將5yl的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3_4min，加入400 μl無抗生素的LB液體培養基，37°C平放1h后倒置培養。
[0041]菌落PCR鑒定:經菌落PCR鑒定后的菌株在LB培養基37°C培養過夜，隨即挑取多個克隆子送到上海生工生物有限公司測序。
[0042]經測試，該經拼接后的豬AMY2基因的DNA序列共1060bp，包含部分第五外顯子，部分第七外顯子和完整的第五內含子，第六外顯子和第六內含子序列，其DNA序列如SEQ IDNo 1所示。且分析發現該DNA序列的第104堿基處存在ー個堿基突變(104C — 104T)，通過分子生物學軟件分析，發現該第104堿基處的堿基突變導致Eco911-RFLP (RestrictionFragment Length Polymorphism,即Eco91I_RFLP位點)多態性。該DNA序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0043](4) PCR-Eco91IRFLP檢測方法的建立及突變位點的檢測
[0044]酶切反應總體積lOμl，其中IXbuffer 1Ou l, PCR產物3-5 yl，限制性內切酶Eco91I 為 0.5μl (5U)，用 H2O 補足 10 yl，37 °C 水浴 4h，稱取 0.6g 瓊脂糖溶于 15.75mlDEPC (上海生エ生物公司)處理水中，稍冷卻(60°C)，加入5ml的5X甲醛凝膠電泳緩沖液和4.25ml的37%甲醛溶液，混勻制膠，電泳后檢測酶切結果。結果發現:SEQ ID No I序列中T等位基因只有1060bp —個片段，C等位基因有98bp和962bp兩個片段，這兩個等位基因可組成三種基因型:CC，CT, TT。且該序列的第984位堿基，發生C — T的替代。
[0045]實施例2等位基因的分布情況
[0046]( I)試驗群體的設計
[0047]試驗組:采集皮特蘭(21頭)、申農(17頭)、大白(43頭)、大申(52頭)、長申(16頭)、杜申(23頭)、皮大申(11頭)、長大申(25頭)、杜大申(7頭)和杜皮大申(20頭)個體的耳組織，提取DNA，共計235個DNA樣本。
[0048]試驗群體的目的在于檢測SNP標記在不同品種中的分布情況。
[0049](2)基因型檢測
[0050]正向引物:5’-GCAAGTGGAGTGGAGAGAAG-3’(序列SEQ ID No 3)
[0051]反向引物:5’-ACTCGTGTGAATCCGTAAGG-3’(序列SEQ ID No 4)
[0052]進行擴增(條件如實施例1)，用相同的RFLP方法檢測試驗群體所有的個體基因型。
[0053](3)統計分析
[0054]記錄所有個體的基因型，并計算等位基因頻率和雜合度，結果如下表1所示。
[0055]表1
[0056]
【權利要求】
1.豬AMY2基因的ー個可用于溯源的SNP分子標記，其特征在于，所述SNP分子標記是通過DNA池測序獲得，共1060bp，其包含部分第五外顯子，部分第七外顯子和完整的第五內含子，第六外顯子和第六內含子序列，且第104位堿基處有ー個堿基突變104C— 104T。
2.根據權利要求1所述的SNP分子標記，其DNA序列如SEQID NO I所示。
3.根據權利要求1或2所述的SNP分子標記，其編碼的氨基酸序列如SEQID NO 2所/Jn o
4.權利要求1或2所述的豬AMY2基因的ー個可用于溯源的SNP分子標記的檢測方法，其特征在于，采用PCR-Eco911-RFLP方法進行，包括以下步驟: (1)構建豬的DNA池； (2)設計正、反引物分離豬AMY2基因的DNA片段，測序并分析； (3)PCR-Eco911-RFLP檢測方法的建立及突變位點的檢測； (4)采集豬的10個品種或品系的耳組織樣，共計235個個體； (5)檢測SNP分子標記在試驗群體的分布，統計分析，并進ー步試驗驗證是否適用于豬肉產品溯源。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在干，分離豬AMY2基因的DNA片段的正、反向引物的序列分別如SE Q ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。
6.權利要求1或2所述的豬AMY2基因的SNP分子標記在豬肉產品的DNA溯源中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589715SQ201210295558
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月17日 優先權日:2012年8月17日
【發明者】吳瀟, 唐雪明, 楊世方, 趙凱, 王金斌, 劉華, 蔣瑋, 何建華 申請人:上海市農業科學院