專利名稱：單核苷多態性rs3888188在檢測結核病易感性中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及單核苷多態性rs3888188在檢測結核病易感性中的應用。
背景技術：
結核病(Tuberculosis, TB)是當今全球關注的三大傳染病之一,嚴重威脅著民眾的健康。我國結核病患者數量居世界第二位，開展結核病的遺傳易感研究對消除結核病、降低死亡率、保障人民健康以及推動首都經濟、衛生事業健康持續發展有重要科學價值和社會效益。結核病主要的致病菌為結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB),而結核病的發病是一個多因素綜合作用的結果。結核病的發生、發展和臨床結局，不僅受環境和MTB毒力的控制，而且受到宿主遺傳免疫的影響。研究顯示感染了 MTB的個體中僅有10%最 終進展為結核病，這提示宿主遺傳差異在結核病的發病中起主導作用。在以病例-對照研究為基礎的基因相關性分析和全基因組關聯分析，都已取得了令人信服的證據，即個體對結核病易感的差異性部分是由宿主基因決定的。目前，尚沒有研究證明干擾素誘導的跨膜蛋白3(IFITM3)及其基因IFITM3與結核病易感關聯。由于基因的啟動子序列能夠結合轉錄因子或調控因子，因而其對基因自身的轉錄、表達至關重要。啟動子區域的單核苷酸多態性(SNP)可能通過改變啟動子與轉錄因子或調控因子的結合能力影響著基因的轉錄活性。
發明內容
本發明的目的是提供單核苷多態性rs3888188在結核病方面的新用途。所述新用途為檢測人基因組中rs3888188多態性或基因型的物質在制備如下I) -4)中任一所述產品中的應用I)檢測與結核病相關的單核苷酸多態性的產品；2)檢測結核病易感性或患有結核病風險的廣品；3)鑒定或輔助鑒定結核病易感基因的產品；4)篩查結核病患者的產品。本發明保護含有用于檢測人基因組中rs3888188多態性或基因型的物質的上述O-4)中的任一所述產品。所述用于檢測人基因組中rs3888188多態性或基因型的物質含有擴增包括rs3888188在內的人基因組DNA片段的PCR引物對。所述PCR引物對具體可由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成。本發明保護檢測人基因組中rs3888188、rs7478728和rs6598045多態性或基因型的物質在制備上述I) -4)中任一所述產品中的應用。本發明還提供一種檢測結核病易感性或患有結核病風險的產品，所述產品為一比對卡，所述比對卡上設置如下序列人IFITM3基因啟動子區域中包括rs3888188、rs6598045 和 rs7478728 的任意一段 DNA 序列，所述 DNA 序列中 rs3888188、rs6598045和rs7478728的堿基分別為G、T和T，或分別為C、A和A。若待測個體的在rs3888188、rs6598045和rs7478728三個位點的堿基與比對卡的相同或互補，則判定該待測個體結核病易感性或患有結核病風險增高。本發明保護所述比對卡在制備篩查結核病產品中的應用。在本發明的實施例中，所述結核病具體為中國北方漢族兒童結核病。所述rs3888188為refSNP ID，是人IFITM3基因(位于染色體11ρ15. 5)核心啟動子區域轉錄起始位點上游103bp處或翻譯起始位點ATG上游204bp處的T/G 二等位多態性的SNP位點。所述rs3888188的基因型是GG、GT或TT。所述GG是rs3888188位點為G的純合型，所述TT是rs3888188位點為T的純合型，所述GT是rs3888188位點為T和G的雜合型。所述檢測人基因組中rs3888188的多態性或基因型具體可為檢測rs3888188的核苷酸種類。
所述rs6598045為refSNP ID，是人IFITM3基因(位于染色體11ρ15. 5)核心啟動子區域翻譯起始位點ATG上游188bp處的C/T 二等位多態性的SNP位點。所述rs7478728為refSNP ID，是人IFITM3基因(位于染色體11ρ15. 5)核心啟動子區域翻譯起始位點ATG上游181bp處的C/T 二等位多態性的SNP位點。實驗證明，rs3888188 (_204T/G)SNP位點的G等位基因在中國北方漢族兒童結核病患兒中所占比例顯著高于正常對照(66. 2%vs. 60. 5%, P=O. 007)，即rs3888188G為結核病易感的風險因素，rs3888188的多態性與結核病具有很高的相關性。因此，通過檢測該位點的核苷酸種類、判斷該位點的基因型可用于檢測結核病的易感性或患有結核病風險，如檢測得到的rs3888188基因型為GG的個體與TT個體相比，更容易患有結核病或患有結核病的風險聞。實驗證明，不同rs3888188基因型(GG、GT、TT)的正常人外周淋巴細胞經IFN-Y誘導后，GG個體的IFITM3基因mRNA表達水平最低，未受干擾素IFN- Y誘導而明顯增高，說明IFITM3基因表達量不足為結核病發病風險因素，即IFITM3基因為結核病易感基因。因此，通過檢測該位點的核苷酸種類，判斷該位點的基因型，可用于鑒定或輔助鑒定與該位點相關的基因是否為結核病易感基因。實驗證明，rs3888188的G等位基因在結核病患兒中所占比例顯著增加(66. 2%vs. 60. 5%, P=O. 007)。因此，在實際應用中，可將檢測該位點多態性的物質與其它物質(如檢測其它的與結核病相關的單核苷酸多態性的物質)聯合在一起制備篩查結核病患者的廣品。其中，檢測人基因組中rs3888188的多態性的物質可為通過下述至少一種方法確定rs3888188的多態性所需的試劑和/或儀器DNA測序、限制性酶切片段長度多態性、單鏈構象多態性、變性高效液相色譜和SNP芯片。所述產品可為試劑或試劑盒，還可為試劑或試劑盒和儀器的組合產品，如由引物和DNA測序儀組成的組合產品，由PCR試劑和DNA測序試劑和DNA測序儀組成的組合產品。本發明實施例采用PCR引物擴增包括rs3888188在內的基因組DNA片段，對得到的346bp的PCR產物進行序列檢測，確定rs3888188的多態性和基因型。所述PCR引物在序列上沒有特殊要求，只要能擴增出包括rs3888188在內的基因組DNA片段即可，具體可為序列表序列I和序列2所示的單鏈DNA。本發明所提供的應用和產品在診斷并治療結核病，從而在合理預防結核病方面具有重要意義和價值。
圖I為三種單體型啟動子對螢光素酶活性的影響。圖2為IFN-Y誘導下rs3888188基因型不同的外周淋巴細胞中IFIT M3基因mRNA表達水平。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、rs3888188的單核苷酸多態性與結核病相關(病例-對照分析)對來自中國北方漢族兒童的951例正常對照(即正常對照組)和368例結核病(SP結核病例組)DNA樣本的IFITM3基因核心啟動子序列(如序列表序列3所示)進行PCR擴增，將擴增獲得的PCR產物在I. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，回收并純化346bp的條帶進行測序。使用在線Shesis 軟件(http://analysis. bio_x. cn/SHEsisMain. htm)對測序所見SNP位點進行等位基因頻率和基因型頻率的統計、針對等位基因和基因型分別進行結核病例組和正常對照組的卡方檢測和odds ratio (優勢比)的計算、位點間連鎖分析、單倍體分析等遺傳學統計分析，共獲得2個與結核病顯著相關的SNP位點rs3888188和rs7478728，及I個與結核病不相關的SNP位點rs6598045，對這三個SNP位點進行基因分型的結果如表I所示。其中，rs3888188 (-204T/G) SNP位點的G等位基因以及rs7478728(-181C/T)的T等位基因在結核病患兒中所占比例顯著增加(66. 2%vs. 60. 5%, P=O. 007 ；82. 6%vs. 77. 9%, P=O. 008)，即rs3888188G和rs7478728T為兒童結核病易感的風險因素。由上述三個SNP構成的單倍體分析顯示(表2)，人群中存在三個主要的單體型(>10%)，分別為GTT、TTC和TCT，其中，GTT單體型在結核病人中顯著增加(63. 6%vs. 56. 6%，P=O. 002，OR=L 32)，而 TTC 單體型在對照組中顯著增加(21. 8%vs. 17. 0%, P=O. 005，OR=O. 73)。表I.基因分型結果
權利要求
1.檢測人基因組中rs3888188多態性或基因型的物質在制備如下1)_4)中任一所述產品中的應用 1)檢測與結核病相關的單核苷酸多態性的產品； 2)檢測結核病易感性或患有結核病風險的產品； 3)鑒定或輔助鑒定結核病易感基因的產品； 4)篩查結核病患者的產品。
2.一種檢測與結核病相關的單核苷酸多態性的產品，其特征在于所述產品中含有用于檢測人基因組中rs3888188多態性或基因型的物質。
3.—種檢測結核病易感性或患有結核病風險的產品，其特征在于所述產品中含有用于檢測人基因組中rs3888188多態性或基因型的物質。
4.一種鑒定或輔助鑒定結核病易感基因的產品，其特征在于所述產品中含有用于檢測人基因組中rs3888188多態性或基因型的物質。
5.一種篩查結核病患者的產品，其特征在于所述產品中含有用于檢測人基因組中rs3888188多態性或基因型的物質。
6.根據權利要求1-5中任一所述的應用或產品，其特征在于所述用于檢測人基因組中rs3888188多態性或基因型的物質含有擴增包括rs3888188在內的人基因組DNA片段的PCR引物對。
7.根據權利要求6所述的應用或產品，其特征在于所述PCR引物對由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成。
8.檢測人基因組中rs3888188、rs6598045和rs7478728多態性或基因型的物質在制備權利要求I中所述的I) -4)中任一所述產品中的應用。
9.一種檢測結核病易感性或患有結核病風險的產品，其特征在于所述產品為一比對卡，所述比對卡上設置如下序列人IFITM3基因啟動子區域中包括rs3888188、rs6598045和 rs7478728 的任意一段 DNA 序列，所述 DNA 序列中 rs3888188、rs6598045 和 rs7478728的堿基分別為G、T和T，或分別為C、A和A。
10.權利要求9所述產品在制備篩查結核病患者產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了單核苷多態性rs3888188在檢測結核病易感性中的應用。所述SNP為rs3888188，位于人IFITM3基因核心啟動子區域(即轉錄起始位點上游103bp處/翻譯起始位點ATG上游204bp處)，rs3888188G為結核病易感的風險因素，rs3888188的多態性與結核病具有很高的相關性。當該位點的基因型為GG時，待測個體的結核病易感性或患有結核病的風險增高。本發明在診斷并治療結核病，從而為合理預防結核病方面重要意義和價值。
文檔編號C12Q1/68GK102808030SQ20121029895
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月21日 優先權日2012年8月21日
發明者申阿東, 申晨, 吳喜蓉, 孫琳, 焦偉偉, 綦輝 申請人:首都醫科大學附屬北京兒童醫院