專利名稱：一種多孔單細胞觀測板及其應用的制作方法
技術領域：
微流控芯片(Microfluidic chip)技術是近幾年飛速發展的領域，其特征主要是其容納流體的有效結構(通道、反應室和其它某些功能部件)至少在ー個緯度上為微米級尺度。微流控芯片把生物、化學、醫學分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作単元集成到一塊厘米尺度的芯片上，由于它可實現高通量的細胞陣列，精確的控制細胞培養環境，快速的進行分析，大量的減少試劑的消耗，而成為現在做細胞分析的最有力的工具。但之前的大多數研究工作都需要借助自動注射泵系統，例如Luo等人(C. Luo, X. Zhu, T. Yu, etal. ， A fast cell loading and high-tnroughput microfluidic system for long-termcell culture in zero—ilow environments, Biotechnology and Bioengineering, 2 008,101，190-195.)和 Wang 等人(L. Wang，X. Ni，C. Luo，et al.，Self-loading and cellculture in one layer microfluidic devices,Biomedical Microdevices, 2009,11，679-684.)的研究，其與現行的排槍或者自動點液系統不能兼容，難以做到真正意義上的高通量(48個不同樣品及以上)，而現有的商用多孔板并不適合做實時的酵母單細胞跟足示。最近，有報道(G.Yang, Quan, Y.，Wang, W.，et al. , Dynamic equilibrium betweencancer stem cells and non-stem cancer ceils m human b#620 and MCF-7 cancer cel丄populations, BRITISH JOURNAL OF CANCER, 2012, 106，1512-1519.)利用小孔和微流道結合的方式，利用聚合物PDMS材料的特殊吸氣性質，在去氣后導入癌細胞，而后更替小孔中的癌細胞溶液為培養液，此操作杜絕了傳統多孔板換液操作對細胞的影響，適合用以作癌細胞的染色和實時觀測。該技術對于高通量的酵母細胞研究仍不適用。
發明內容
針對研究細胞領域的不足之處，本發明提出ー種多孔單細胞觀測板。本發明另一目的是提出應用所述多孔單細胞觀測板的方法。實現本發明上述目的的具體技術方案為ー種多孔單細胞觀測板，包括多個小孔単元，每個小孔單元包括一個小孔、多個重復的細胞培養室和擴散通道，每個細胞培養室通過擴散通道與小孔連接。其中，小孔單元的數目為1-1000個,小孔的直徑為2-4mm,小孔的孔間距為4_10mm且孔間距均相等。孔間距均等，使得該多孔單細胞觀測板可以與本領域常用的排槍和自動點樣儀所適配。所述擴散通道的高度、寬度或直徑均大于細胞的特征尺寸。通道的尺寸大于細胞的直徑，可以讓細胞或細菌通過。例如，芽殖酵母細胞對于不同的突變株一般大小范圍為3-7 u m,裂殖酵母直徑為3. 5 ii m，桿菌尺度1-3 u m。其中，細胞培養室的高度為細胞最小特征尺寸的1-2倍。細胞培養室的高度不超過所研究的細胞最小特征尺寸的兩倍，細胞在培養室為單層生長。所述的多孔單細胞觀測板是用聚ニ甲基硅氧烷(PDMS)制成。
一種制備本發明提出的多孔單細胞觀測板的方法，是使用軟光刻和打孔的方法制備所述多孔單細胞觀測板。應用本發明提出的多孔單細胞觀測板觀測細胞的方法，包括步驟I)等離子處理所述多孔單細胞觀測板，然后把所述多孔單細胞觀測板置于一平面上；2)將含有細胞的溶液均勻加入所述多個小孔中；3)當所述小孔、細胞培養室、擴散通道均被含有細胞的溶液充滿后，去除小孔內的殘留的含有細胞的溶液。由于PDMS在等離子體處理后對液體的浸潤性和對氣體吸收的特性，細胞溶液自動被吸收入細胞(微生物)培養室，當細胞培養室被液體填充完成，細胞培養室內液體流速降為零。由于細胞培養腔室吸滿后為死區，更替小孔內溶液時，細胞培養室液體不會流動， 只通過擴散交換營養。其中，所述步驟3)中，去除小孔內的殘留的含有細胞的溶液后，還包括用不含細胞的溶液充滿小孔的步驟。通過排槍或者液體點樣機更替小孔內的液體實現去除小孔內的細胞溶液并實現對細胞培養室內細胞(微生物)的環境更替。所述不含細胞的溶液優選使用細胞培養液。其中，所述步驟3)中，還包括覆蓋所述多孔單細胞觀測板的步驟。這樣可防止液體蒸發。所述含有細胞的溶液可以是多種細胞溶液，例如，將不同的突變細菌菌株采用排槍或者點樣儀分別加入不同的小孔中。本發明的有益效果在于本發明提出的多孔單細胞觀測板主要應用的方向為細胞生物學、高通量基因表型篩選等。本發明的裝置采用小孔與細胞培養室結合的方式，可針對不同的酵母細胞菌群進行高通量的研究，I)采用小孔和為酵母細胞單層生長觀測的特定高度的培養腔室，即培養腔室高度小于酵母細胞的2倍(優化值為I. 5倍)，使細胞單層生長，有利于觀測研究；2)設計與排槍和液體自動點樣儀匹配的孔間距，使得系統真正能實現高通化與自動化，更加適用于針對酵母相關基因功能的研究工作；3)覆蓋該多孔單細胞觀測板，可以只用IOiU的液體，進行時間長達5-10小時左右的觀測。通過細胞培養腔室和擴散通道的不同尺度的設計，還可以對多種微生物進行高通量研究。
圖I是本發明實施例I計算機輔助繪制的掩膜版a。圖2是本發明實施例I中計算機輔助繪制的掩膜版b。圖3為本發明實施例I中多孔單細胞觀測板的俯視圖。圖4是ー個小孔單元的俯視圖。圖5是圖4中圓圈部分的局部放大圖。圖中，I為小孔，2為細胞培養室，3為擴散通道。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。其中PDMS預塑體購自GE公司，型號為RTV615。本發明提出的微流控芯片可用于人體細胞、植物細胞、動物細胞、細菌的研究，其細胞線度為10_4-10_6m。實施例I :制備多孔單細胞觀測板I)用L-Edit繪圖，如圖I和圖2的掩模版a和掩模版b，掩膜版a的小孔直徑為3mm,孔間距為4. 5mm,該孔間距與排槍(DragonMed, DR27506 0. 5 U 1-10 U I 8通道排槍)相適配。掩膜版b為細胞培養室和擴散道圖層，根據研究的微生物不同，擴散通道的橫截面積可設計為細胞培養室面積的2-80%。本實施例中，細胞培養室為直徑為250微米的小圓，高度為8 u m，通過一段40微米寬、40微米高，60微米長的擴散道與小孔相連。重復小孔単元可為4X2個至36X16個。本實施例中，重復的小孔單元為12X4個。 2)采用光刻膠SU83005，通過甩膠機在硅片上涂布上7微米的光刻膠(轉速2000rpm，時間為30s)，經過65攝氏度烘烤I分鐘，95攝氏度烘烤5分鐘前烘后，放于曝光機下曝光，米用的掩模為所設計圖2圖形的陰版,曝光時間為50秒,光強為20mW/cm2 ;曝光后樣品放于65攝氏度I分鐘，95攝氏度后烘5分鐘；經過顯影液顯影后，獲得如圖2的模具。再通過利用SU83025，步驟同上，前烘條件為65攝氏度I分鐘，95攝氏度10分鐘，采用相應的掩模，曝光時間為90秒，光強20mW/cm2，后烘條件為65攝氏度I分鐘，95攝氏度10分鐘。套刻圖I的圖層，制得如圖3的模具。3)用液態的PDMS預塑體(A B=8 :1)倒在模具上，PDMS的高度大約為l_2mm，在75度烘箱中Ih使得PDMS固化。切下后在相應的小孔處采用3_直徑的打孔器打孔后，用70%
酒精超聲清潔干凈，待用。實施例2 :應用實施例I的多孔單細胞觀測板研究細胞實施例I制備的多孔單細胞觀測板通過等離子處理后(等離子處理機，Harrick公司，PDC-002，處理一分鐘)圖形面向下放于干凈的玻片上，采用排槍在不同的小孔內加入相同的尺度大小為4-5 u m的芽殖酵母菌群I U I溶液(菌群密度3X IO7個/ml)等待I分鐘，細胞溶液可被吸入整個細胞腔室。采用排槍吸出小孔中的細胞溶液，用新鮮的培養液洗兩次小孔(毎次lOul)，然后將小孔替換為希望細胞所處的溶液(YPDA培養液)環境后，用同樣大小的玻片蓋在PDMS多孔單細胞觀測板的上方。將該裝置放于帶有自動平移臺和自動對焦的顯微鏡系統上，即可對不同的細胞/細菌類型進行時序的單細胞記錄。覆蓋該多孔單細胞觀測板，可進行時間長達10小時的觀測。實施例3 :用4X2的多孔單細胞觀測板研究細胞共有4X2個小孔単元的多孔單細胞觀測板通過等離子處理后圖形面向下放于干凈的玻片上，采用自動點樣儀(beckman公司，biomek FX)在不同的小孔加入4種不同的芽殖酵母菌群Iyl溶液(菌群密度2X107個/ml、3X107個/ml、4X107個/ml、5X107個/ml)，等待2-3分鐘，細胞溶液可吸滿整個細胞腔室。采用自動點樣儀吸出小孔中的細胞溶液，用新鮮的培養液洗兩次小孔(毎次10ul)，然后將小孔替換為YPDA培養液環境后，用同樣大小的玻片蓋在PDMS多孔單細胞觀測板的上方。將該裝置放于帶有自動平移臺和自動對焦的顯微鏡系統上，即可對不同的細胞/細菌類型進行時序的單細胞記錄。覆蓋該多孔單細胞觀測板，可進行時間長達10小時的觀測。實施例4共有4 X 2個小孔単元的多孔單細胞觀測板的小孔為400 U m邊長的正方形，其它同實施例I。實施例5多孔單細胞觀測板用于裂殖酵母或大腸桿菌的實驗。本實施例中，所研究大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli )細胞最小特征尺寸為Iiim (桿狀，直徑為Ium,長度為
3-8 u m)o所使用的多孔單細胞觀測板共36X 16個重復的小孔單元。細胞培養室高度為I. 5 u mo擴散通道高和寬均為4 u m。
實施例64X2的多孔單細胞觀測板用于不同菌株在不同環境下的并行比較，例如各種突變株，營養，抗生素等。本實施例中，使用芽殖酵母的突變株，共四種，分別加入到不同小孔單元中，進行并行比較。以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變型和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。
權利要求
1.一種多孔單細胞觀測板，其特征在于，包括多個小孔單元，每個小孔單元包括一個小孔、多個重復的細胞培養室和擴散通道，每個細胞培養室通過擴散通道與小孔連接。
2.如權利要求I所述的多孔單細胞觀測板，其特征在于，小孔單元的數目為1-1000個，小孔的直徑為2-4mm，小孔的孔間距為4_10mm且孔間距均相等。
3.如權利要求I所述的多孔單細胞觀測板，其特征在于，所述擴散通道的高度、寬度或直徑均大于細胞特征尺寸。
4.如權利要求I所述的多孔單細胞觀測板，其特征在于，所述細胞培養室的高度為細胞最小特征尺寸的1-2倍。
5.如權利要求I所述的多孔單細胞觀測板，其特征在于，其是用聚二甲基硅氧烷制成。
6.一種制備權利要求1-5任一所述的多孔單細胞觀測板的方法，其特征在于，是使用軟光刻和打孔的方法制備。
7.應用權利要求1-5任一所述的多孔單細胞觀測板觀測細胞的方法，其特征在于，包括步驟 1)等離子處理所述多孔單細胞觀測板，然后把所述多孔單細胞觀測板置于一平面上； 2)將含有細胞的溶液均勻加入所述小孔中； 3)當所述小孔、細胞培養室、擴散通道均被含有細胞的溶液充滿后，去除小孔內的殘留的含有細胞的溶液。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，去除小孔內的殘留的含有細胞的溶液后，還包括用不含細胞的溶液充滿小孔的步驟。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，還包括覆蓋所述多孔單細胞觀測板的步驟。
全文摘要
本發明提供一種多孔單細胞觀測板，包括多個小孔單元，每個小孔單元包括一個小孔、多個重復的細胞培養室和擴散通道，每個細胞培養室通過擴散通道與小孔連接。本發明提出的多孔單細胞觀測板主要應用的方向為細胞生物學、高通量基因表型篩選等。本發明的提出的裝置采用小孔與細胞微培養腔室結合的方式，針對研究高通量的不同的酵母細胞菌群，采用小孔和為酵母細胞單層生長觀測的特定高度的培養腔室，使細胞單層生長，有利于觀測研究；設計與排槍和液體自動點樣儀匹配的孔間距，使得系統真正能實現高通化與自動化；覆蓋該多孔單細胞觀測板，可以只用10μl的液體，進行時間長達5-10小時左右的觀測。
文檔編號C12M1/34GK102796659SQ20121029917
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月21日 優先權日2012年8月21日
發明者羅春雄, 蔣靈俐, 楊薇, 姜香丹 申請人:北京大學