專利名稱：核酸探針在片延伸基因芯片及制備工藝和使用方法
技術領域：
本發明主要涉及一種核酸探針在片延伸基因芯片及其制備工藝和使用方法，屬于生物技術領域，特別是基因芯片領域。
背景技術：
基因芯片技術在醫學、生命科學、藥業、農業、環境科學等凡與生命活動有關的領域中均具有重大的應用前景。陣列型基因芯片技術可廣泛應用于疾病診斷、藥物基因組圖譜、篩選、中藥物種鑒定、農作物的優育優選、司法鑒定、食品衛生監督、環境檢測、國防等許多領域。它將為人類認識生命的起源、遺傳、發育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設計和藥物開發中先導化合物的快速篩選和藥物基因組學研究提供技術支撐平臺。國內外研究結果表明傳統基因芯片將寡核酸探針固定在芯片載體表面的雜交動力學表現與核酸在溶液中的表現明顯不同，實驗結果很難解釋，甚至 互相矛盾。主要原因是表觀反應速率不僅與探針的密度、探針的長度、探針在互補序列上的位置、溶液擴散速度、載體表面物理性狀、環境溫度、離子強度及種類有關，還受其他重要因素的影響。科學家們發現，基因芯片雜交結果的重現性仍然不是十分理想，一般情況下，中高密度基因芯片雜交結果的重現性在85%左右。Zhang L等使用從同一標本中提取mRNA用Affymetrix公司生產的U133A Gene和U133 Plus2. 0芯片進行參照雜交，雜交實驗獲得的結果相當不一致，兩個芯片雜交結果比較，將近70%檢測相同基因的探針陣列點雜交信號數值出現明顯偏差，他們認為通過比較兩種芯片雜交結果，無法確定哪個結果能夠準確反映生物樣本中基因表達水平。利用0WLS(optical waveguide lightmodespectroscopy, OWLS)非標記檢測技術,在實驗過程中觀測到當祀核酸序列長于探針序列時，靶序列及其與探針雜交后的游離端在溶液中會形成立體結構，而具有立體結構的靶序列分子的熱力學擴散運動，不僅影響雜交體的形成，還會使雜交體的解離常數增加，甚至使雜交體不能穩定存在。靶序列分子游離端熱力學運動是影響雜交動力學的重要因素。雜交結果重復性較差這一瓶頸問題限制了基因芯片技術的發展。前期研究發現，核酸在固液界面，尤其是當固定在芯片表面的核酸探針長度短于核酸靶序列長度情況下，雜交動力學行為有悖于Southern理論。為了實現核酸探針在片延伸，提聞基因芯片檢測的重復性和單喊基變異檢測的特異性，應該構建具有PCR擴增、探針延伸、熒光標記、雜交、清洗和檢測功能的核酸探針在片延伸基因芯片。采用核酸探針在片延伸技術在延伸核酸序列時，可以實現等位基因特異性PCRCallele specific PCR)，針對單堿基變異(包括SNPs)進行分析。傳統的基因芯片通過互補序列雜交的方式檢測待檢樣品的核酸序列，對單堿基變異識別能力較差。如果通過改變現有基因芯片工作原理，研制核酸探針在片延伸基因芯片，可以利用等位基因特異性PCR技術原理提高基因芯片識別單堿基變異的能力。
發明內容
發明目的本發明設計了一種核酸探針在片延伸基因芯片及制備工藝和使用方法，在該芯片上能夠實現核酸探針在片延伸，其目地在于提供一種高通量、高重復性、高準確性的基因序列檢測技術及裝置。技術方案一種核酸探針在片延伸基因芯片，包括芯片本體，其特征在于芯片本體上具有微池，芯片本體一側為蓋玻片，芯片本體與蓋玻片之間設有密封圈，芯片本體上方設有壓蓋，芯片本體另一側設有兩個閥門，在微池的兩端分別設有閥門的流入道和流出道；核酸探針微陣列固定于蓋玻片內表面的微池覆蓋范圍內，蓋玻片、密封圈與芯片本體的微池形成密閉的PCR反應室，蓋玻片構成透明的一側薄室壁。
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微池的容積為20-50 μ 1，微池具有快速變溫的薄壁結構。該芯片在玻璃基片上分布有多個不同區域的微陣列，在每個微陣列區域中，分別固定識別不同基因序列的特異性探針和等位基因鑒別探針，同時另設有質控探針和陣列位置指示探針；利用DNA聚合酶特異性延伸的特性，在基因芯片表面進行核酸探針特異性延伸，實現完全互補核酸探針在片延伸。一種如上所述核酸探針在片延伸基因芯片的制備工藝，其特征在于步驟如下(I)芯片本體制備選用熱變形溫度彡140°C注塑材料，制做基因芯片本體；(2)密封圈制備制做環形密封圈；(3)設計探針和引物=WNCBI等數據庫獲得基因芯片設計需要的基因序列，利用生物信息學生物軟件設計引物和特異性的探針；(4)合成探針和引物用核酸合成儀合成基因芯片所需的與靶序列反義鏈互補的核酸探針序列，5’端加氨基修飾；合成正義鏈引物和5’端熒光素標記的反義鏈引物；(5)制備核酸探針微陣列芯片用氨基硅烷和戊二醛將O. 2mm厚的蓋玻片處理成表面具有活性氨基的片基；用去離子水將合成的探針溶解，配制濃度為200mmol/l探針溶液；然后進行點樣；點樣后的芯片于37°C下水化12小時，然后在80°C下烘干2小時；以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；用封閉液封閉玻片，之后洗滌3次；吹干備用。一種如上所述核酸探針在片延伸基因芯片的使用方法，其特征在于步驟如下(I)獲取待測樣品DNA模板；(2)開啟流入道、流出道閥門，將待測樣品DNA模板與PCR緩沖液混合后，加入基因芯片微池中；(3)將基因芯片放入溫度循環風場中，進行95°C變性；94°C— 5472°C循環變溫，50°C雜交；(4)開啟流出道、流入道閥門，通過流入道注入清洗緩沖液，流出道排放液體的方式洗去游離的PCR產物和未反應的引物、核酸單體以及PCR緩沖液；(5)用熒光圖像掃描儀掃描芯片獲取芯片上不同位點熒光信號強度，分析被檢靶序列核酸序列信息。優點及效果本發明是一種核酸探針在片延伸基因芯片及制備工藝和使用方法，具有如下優點及有益效果本發明設計了一種新型工作原理的基因芯片，其原理是應用DNA聚合酶特異性延伸的特性，在基因芯片表面進行核酸探針特異性延伸，實現等位基因特異性延伸功能，可以有效地鑒別單堿基變異，為SNPs檢測提供了新的技術方法；構建具有微池的基因芯片，可以將溶液中PCR擴增、核酸探針延伸、雜交、清洗和熒光圖像掃描功能集成在同一裝置上，有利于基因芯片檢測過程的自動化，避免基因芯片操作流程中人為因素干擾，減少檢測結果的偶然誤差；基因芯片采用薄壁設計，有利于快速溫度循環變化，不僅可以提高核酸擴增的質量，還可以縮短PCR所需的時間，減少基因芯片檢測流程總時間，提高工作效率，有利于實際應用時快速檢測的需要。由于基因芯片的微池采用了一側透明室壁設計，為實時定量PCR檢測和可視化基因芯片研制提供了技術實施的可能性。
圖I為本發明核酸探針在片延伸基因芯片結構示意圖。
圖2為本發明芯片PCR擴增時的擴增條件。附圖標記說明I、芯片本體，2、微池，3、蓋玻片，4、密封圈，5、壓蓋，6、閥門，7、流入道，8、流出道。
具體實施例方式下面結合附圖和具體的實施方式對本發明做進一步的說明本發明這種核酸探針在片延伸基因芯片構建了一種新型工作原理的基因芯片，達到核酸探針在片延伸，提高基因芯片檢測結果的重復性的目地。本發明研制的核酸探針在片延伸基因芯片，利用DNA擴增酶在引物與模板雜交形成的局部雙鏈3’末端特異性延伸技術原理，在玻片固定基因探針的表面構建能夠容納PCR緩沖液的微池，在微池中進行PCR反應，當溶液中靶序列數量擴增到一定數量時，固/液界面的核酸探針可以與溶液中的互補靶序列雜交，在DNA聚合酶的作用下，使核酸探針延伸，實現單堿基變異檢測的功能。為了實現上述過程，本發明構建了新型工作原理的基因芯片，芯片結構如圖I中所示。一種核酸探針在片延伸基因芯片，包括芯片本體1，其特征在于芯片本體I上具有微池2，芯片本體I 一側為蓋玻片3，芯片本體I與蓋玻片3之間設有密封圈4，芯片本體I上方設有壓蓋5，芯片本體I另一側設有兩個閥門6，在微池2的兩端分別設有閥門6的流入道7和流出道8 ;如圖I所示，將核酸探針微陣列固定于蓋玻片3內表面的微池2覆蓋范圍內，蓋玻片3、密封圈4與芯片本體的微池2形成密閉的PCR反應室，蓋玻片3構成透明的一側薄室壁，高速流動的變溫空氣吹到蓋玻片3表面，可以通過蓋玻片3進行熱傳導，控制微池2內液體的溫度變化，實現PCR所需的溫度循環控制，完成溶液中靶核酸序列擴增、核酸探針延伸和雜交過程；開啟流入道、流出道閥門進行清洗；清洗后，通過蓋玻片進行熒光圖像掃描。可以將溶液中PCR擴增、芯片固/液界面核酸探針延伸、雜交、清洗和熒光圖像掃描功能集成在同一裝置上，有利于基因芯片檢測過程的自動化，避免基因芯片操作流程中人為因素干擾，減少檢測結果的偶然誤差。微池2的容積為20-50 μ I，微池2具有快速變溫的薄壁結構。
本發明設計的基因芯片采用薄壁設計，有利于快速溫度循環變化，不僅可以提高核酸擴增的質量，還可以縮短PCR所需的時間，減少基因芯片檢測流程總時間，提高工作效率，有利于實際應用時快速檢測的需要。由于基因芯片的微池采用了一側透明室壁設計，為實時定量PCR檢測和可視化基因芯片研制提供了技術實施的可能性。該芯片在玻璃基片上分布有多個不同區域的微陣列，在每個微陣列區域中，分別固定識別不同基因序列的特異性探針和等位基因鑒別探針，同時另設有質控探針和陣列位置指示探針；利用DNA聚合酶特異性延伸的特性，在基因芯片表面進行核酸探針特異性延伸，實現完全互補核酸探針在片延伸，可以有效地鑒別單堿基變異，為SNPs檢測提供了新的技術方法；等位基因鑒別陣列點探針能夠有效地區分單喊基變異基因型，達到提聞基因芯片檢測單堿基變異特異性的目地。具體來說是在玻璃基片上分布有多個不同區域的微陣列，在每個微陣列區域中，分別固定識別不同核酸序列的特異性核酸探針，針對需要鑒別的等位基因位點分別設計四 個等位基因鑒別探針，等位基因鑒別探針除了 3’末端分別為A、T、C、G外，其余序列完全相同，其中與模板完全互補的探針序列可以與溶液中靶核酸序列雜交，在核酸聚合酶的作用下，完全互補的探針將會延伸，不完全互補的探針將不會延伸。延伸的核酸探針與靶序列雜交后形成的雜交體結合能增加，在清洗時不易被洗脫；而沒有被延伸的核酸探針與靶序列雜交后的雜交體結合能較小，在清洗時容易洗脫。由于靶序列在擴增時被標記熒光，雜交后延伸的核酸探針位點經熒光圖像掃描儀掃描后就會有熒光信號，通過分析不同位點熒光信號就可以實現單堿基變異識別功能。同時，在芯片上另設有質控探針和陣列位置指示探針，可以反應芯片制備的質量及在掃描圖像上提供位點定位信息。該基因芯片是在固定有核酸探針陣列的玻片表面構建具有容積為20-50 μ I的微池，在微池兩端分別設有常閉逆止閥門的流入通道和流出通道，常閉逆止閥門可以通過外力實現開關功能；微池具有快速變溫的薄壁結構，足夠的換熱面積，能夠達到升、降溫速度>10°c /s的要求；芯片一側室壁透明，可以滿足核酸探針微陣列熒光圖形掃描的需要。一種如上所述核酸探針在片延伸基因芯片的制備工藝，其特征在于步驟如下(I)芯片本體制備選用熱變形溫度彡140°C (注塑)材料，根據圖I所示制做基因芯片本體；(2)密封圈制備根據圖I所示制做環形密封圈；(3)設計探針和引物=WNCBI等數據庫獲得基因芯片設計需要的基因序列，利用生物信息學生物軟件設計引物和特異性的探針；(4)合成探針和引物用核酸合成儀合成基因芯片所需的與靶序列反義鏈互補的核酸探針序列，5’端加氨基修飾；合成正義鏈引物和5’端熒光素標記的反義鏈引物；(5)制備核酸探針微陣列芯片用氨基硅烷和戊二醛將O. 2mm厚的蓋玻片處理成表面具有活性氨基的片基；用去離子水將合成的探針溶解，配制濃度為200mmol/l探針溶液；用BioRobotics公司的點樣儀按預先設定好的程序進行點樣；按照不同要求從幾十點到上千點，點的大小為50-100微米左右，點間距依點的數量而定；點好的芯片于37°C下水化12小時，然后在80°C下烘干2小時；用探針緩沖液(lxSSC，0. 1%SDS)及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液(1%BSA，PH=7. 0,0. 01mol/l PB)封閉玻片，之后洗滌3次；吹干備用。
—種如上所述核酸探針在片延伸基因芯片的使用技術原理步驟如下(I)獲取待測樣品DNA模板；(2)開啟流入道、流出道閥門，將待測樣品DNA模板與PCR緩沖液(含有DNA聚合酶)混合后，加入基因芯片微池中；(3)將基因芯片放入溫度循環風場中，進行95°C變性；94°C— 54°C— 72°C循環變溫，50°C雜交；(4)開啟流出道、流入道閥門，通過流入道注入清洗緩沖液，流出道排放液體的方式洗去游離的PCR產物和未反應的引物、核酸單體以及PCR緩沖液；(5)用熒光圖像掃描儀掃描芯片獲取芯片上不同位點熒光信號強度，分析被檢靶 序列核酸序列信息。上述芯片的具體使用方法按以下步驟進行(I)處理樣品取待檢樣品I毫升，用溶菌酶溶解，氯仿抽提，乙醇沉淀法提取模板DNA，備用。如需長時間放置，在-20°C下凍存。(2)上樣開啟流入道、流出道閥門，將待測樣品DNA模板與PCR緩沖液(含有DNA聚合酶)混合后，加入基因芯片微池中。(3) PCR 擴增擴增條件如下如圖2中所示。(4)雜交PCR產物與芯片上的探針在50°C下雜交10分鐘。(5)清洗經流入道在3分鐘內連續注入Iml清洗緩沖液清洗芯片。(6)檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片,得到圖像并輸出結果。(7)數據分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件將芯片分析結果輸出。
權利要求
1.一種核酸探針在片延伸基因芯片，包括芯片本體(1)，其特征在于芯片本體(I)上具有微池(2)，芯片本體(I) 一側為蓋玻片(3)，芯片本體(I)與蓋玻片(3)之間設有密封圈(4),芯片本體(I)上方設有壓蓋(5)，芯片本體(I)另一側設有兩個閥門(6)，在微池(2)的兩端分別設有閥門(6)的流入道(7)和流出道(8);核酸探針微陣列固定于蓋玻片(3)內表面的微池(2 )覆蓋范圍內，蓋玻片(3 )、密封圈(4 )與芯片本體的微池(2 )形成密閉的PCR反應室，蓋玻片(3)構成透明的一側薄室壁。
2.根據權利要求I所述的核酸探針在片延伸基因芯片，其特征在于微池(2)的容積為20-50W，微池(2)具有快速變溫的薄壁結構。
3.根據權利要求I所述的核酸探針在片延伸基因芯片，其特征在于該芯片在玻璃基片上分布有多個不同區域的微陣列，在每個微陣列區域中，分別固定識別不同基因序列的特異性探針和等位基因鑒別探針，同時另設有質控探針和陣列位置指示探針；利用DNA聚合酶特異性延伸的特性，在基因芯片表面進行核酸探針特異性延伸，實現完全互補核酸探針在片延伸。
4.一種如權利要求I所述核酸探針在片延伸基因芯片的制備工藝，其特征在于步驟如下 (1)芯片本體制備選用熱變形溫度>140°C注塑材料，制做基因芯片本體； (2)密封圈制備制做環形密封圈； (3)設計探針和引物=WNCBI等數據庫獲得基因芯片設計需要的基因序列，利用生物信息學生物軟件設計引物和特異性的探針； (4)合成探針和引物用核酸合成儀合成基因芯片所需的與靶序列反義鏈互補的核酸探針序列，5’端加氨基修飾；合成正義鏈引物和5’端熒光素標記的反義鏈引物； (5)制備核酸探針微陣列芯片用氨基硅烷和戊二醛將0.2_厚的蓋玻片處理成表面具有活性氨基的片基；用去離子水將合成的探針溶解，配制濃度為200mmol/l探針溶液；然后進行點樣；點樣后的芯片于37°C下水化12小時，然后在80°C下烘干2小時；以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；用封閉液封閉玻片，之后洗滌3次；吹干備用。
5.一種如權利要求I所述核酸探針在片延伸基因芯片的使用方法，其特征在于步驟如下 (1)獲取待測樣品DNA模板； (2)開啟流入道、流出道閥門，將待測樣品DNA模板與PCR緩沖液混合后，加入基因芯片微池中； (3)將基因芯片放入溫度循環風場中，進行95°C變性；94°C—540C- 72°C循環變溫，50°C雜交； (4)開啟流出道、流入道閥門，通過流入道注入清洗緩沖液，流出道排放液體的方式洗去游離的PCR產物和未反應的引物、核酸單體以及PCR緩沖液； (5)用熒光圖像掃描儀掃描芯片獲取芯片上不同位點熒光信號強度，分析被檢靶序列核酸序列信息。
全文摘要
本發明屬于基因芯片技術領域，主要涉及一種核酸探針在片延伸基因芯片及制備工藝和使用方法，具體地講是一種可以將溶液中PCR擴增、核酸探針延伸、雜交、清洗和熒光圖像掃描功能集成在同一裝置上的基因芯片，在該芯片上能夠實現核酸探針在片延伸，有利于基因芯片檢測過程的自動化，避免基因芯片操作流程中人為因素干擾，減少檢測結果的偶然誤差，適于推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102827764SQ20121030502
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者趙雨杰, 何群, 趙書陽, 潘忠誠, 王天驕, 王紹成, 鐘連聲, 馬汝海, 張玉魁 申請人:趙雨杰