專利名稱：基于絲膠蛋白的抗凍劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗凍劑的制備方法，特別涉及一種來源于絲膠蛋白的抗凍劑，用于防止肉類凍藏過程中發生蛋白冷凍變性。
背景技術：
魚糜是機械去骨的魚肉經水洗后加入冷凍保護劑以保持較長的冷凍貨架期的魚肉制品，是生產魚糜制品的主要原料。目前日本、美國、俄羅斯、泰國和韓國都十分重視冷凍魚糜的生產，并成為世界冷凍魚糜生產大國。近年來，以淡水魚為原料生產冷凍魚糜及魚糜制品引起國內外食品科技工作者的興趣。魚類的蛋白可分為三種，分別是肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和基質蛋白。其中肌漿蛋白是水溶性蛋白，肌原纖維蛋白是鹽溶性的蛋白，基質蛋白則是既不溶于水也不溶于鹽溶液的不溶性蛋白。肌原纖維蛋白占到了魚類蛋白的65-75%，是魚蛋白最重要的組分，魚肉蛋白在凍藏過程中發生變性的主要是肌原纖維蛋白。已有的研究結果表明，添加抗凍劑是有效的抗魚肉蛋白冷凍變性的方法。常用的抗凍變性劑為糖類，鹽類、蛋白及水解物等。目前應用最多的商業抗凍劑的配方是蔗糖和山梨醇混合物、多聚磷酸鹽，以及糖和多聚磷酸鹽的混合物。蔗糖和山梨糖醇因其價格低廉、抗凍效果較好且不易發生美拉德反應產生褐變而受廣泛應用于實際生產中。但此類抗凍劑帶來較重的甜味和熱量，一些人因疾病(如糖尿病)不能使用，這在一定程度上限制了糖類抗凍劑在魚糜中的使用。因此低熱量的抗凍劑成為目前的研究方向。研究發現某些蛋白酶解物含有較大比例的親水性氨基酸，能與水作用形成氫鍵，增強凍結過程中水的穩定性，減少巨大冰晶體的形成，從而避免魚肉蛋白空間構象變化而引起的變性。因此，尋找新型蛋白及水解物，提高魚糜冷凍變性，是本領域研究的一項重要內容。
發明內容
解決的技術問題本發明提供一種基于絲膠蛋白的抗凍劑的制備方法，絲膠蛋白中含有大量親水性的絲氨酸，以絲膠蛋白為原料，經酶解，最終得到一種非糖類抗凍劑。技術方案基于絲膠蛋白的抗凍劑的制備方法，步驟為用水溶解絲膠蛋白，質量體積比濃度為O. 5 10% (g/mL);用O. 5 I. 5mol/LNa0H溶液調pH 7. O 9. O,保持溫度20 40°C;加入胰蛋白酶，加入量為胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=IOOOOU 40000U:lg，酶解反應O. 5 4h ;酶解結束后，將溶液加熱到80 100°C，并保持5 IOmin進行滅酶處理；將所得多肽溶液冷凍干燥，絲膠源酶解蛋白抗凍劑。上述的基于絲膠蛋白的抗凍劑的制備方法，優化步驟為1.用水將絲膠蛋白溶解，質量體積濃度為3% (g/mL)；2.用lmol/L的NaOH調pH值到8. 5，保持溫度37°C ；3.力口入胰蛋白酶，加入量為胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=30000U :lg，酶解反應時長3h ;4.酶解結束后，將溶液加熱到95°C，并保持6min進行滅酶處理，將所得多肽溶液冷凍干燥，絲膠源酶解蛋白抗凍劑。有益效果I.本發明所得的新型抗凍劑屬非糖類物質，應用于蛋白類食品的冷凍保鮮，不會增加這些食品的能量，糖尿病患者可以食用此類凍存的蛋白類食品。2.我國是養蠶大國，每年生產大量的蠶繭，絲膠產量巨大。本發明可以充分利用絲膠，達到廢物利用的目的。
具體實施例方式實施例II.用水將絲膠蛋白溶解，濃度為O. 5% (質量體積分數，g/mL)；2.用 I. 5mol/L 的 NaOH 調 pH 值到 9，保持溫度 20°C。3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=40000U:lg)，酶解反應時長
O.5h ；4.酶解結束后，將溶液加熱到80°C，并保持IOmin進行滅酶處理。將所得多肽溶液冷凍干燥，得到絲膠源酶解蛋白抗凍劑。實施例2I.用水將絲膠蛋白溶解，濃度為10% (質量體積分數，g/mL)；2.用 lmol/L 的 NaOH 調 pH 值到 7. 5，保持溫度 30°C。3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=IOOOOU :lg)，酶解反應時長2h ；4.酶解結束后，將溶液加熱到100°C，并保持5min進行滅酶處理。將所得多肽溶液冷凍干燥，絲膠源酶解蛋白抗凍劑。實施例3I.用水將絲膠蛋白溶解，濃度為7. 5% (質量體積分數，g/mL);2.用 O. 5mol/L 的 NaOH 調 pH 值到 8，保持溫度 40°C。3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=20000U :Ig)，酶解反應時長4h ；
4.酶解結束后，將溶液加熱到90°C，并保持7min進行滅酶處理。將所得多肽溶液冷凍干燥，絲膠源酶解蛋白抗凍劑。實施例4I.用水將絲膠蛋白溶解，濃度為3% (質量體積分數，g/mL);2.用 lmol/L 的 NaOH 調 pH 值到 8. 5，保持溫度 37°C。3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=30000U:lg)，酶解反應時長3h ；4.酶解結束后，將溶液加熱到95°C，并保持6min進行滅酶處理。將所得多肽溶液冷凍干燥，絲膠源酶解蛋白抗凍劑。實施例5I.用水將絲膠蛋白溶解，濃度為8% (質量體積分數，g/mL)；2.用 lmol/L 的 NaOH 調 pH 值到 7. 5，保持溫度 40°C。
3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=40000U:lg)，酶解反應時長
I.5h ；4.酶解結束后，將溶液加熱到100°C，并保持7min進行滅酶處理。將所得多肽溶液冷凍干燥，絲膠源酶解蛋白抗凍劑。絲膠源性抗凍劑對鰱魚糜的冷凍變性的保護作用按實施例4方法，制備得到絲膠源性抗凍劑，進行抗鰱魚糜的冷凍變性試驗。I.將鰱魚清洗、去鱗、去頭、去內臟，并經第二次清洗。然后采肉。漂洗4次及以 上，最后一次漂洗水中加入O. 15%的食鹽(以使肌球蛋白收斂，容易脫水)。脫水；2.向脫水完畢的魚糜中添加酶解后的絲膠蛋白粉(或與糖類抗凍劑聯合應用)，分別為無抗凍劑、1% (酶解產物與魚糜的質量分數，下同)絲膠蛋白酶解產物、O. 5%絲膠蛋白酶解產物、4 %蔗糖+4 %山梨醇、I %絲膠蛋白酶解產物+2 %蔗糖+2 %山梨醇，混勻，_20°C保存；3.每周檢測魚糜保水性、鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巰基含量、表面疏水性。同時以未加任何抗凍劑的鰱魚糜為對照，評價酶解絲膠蛋白抗凍劑的效果。魚糜質量檢測方法如下(I)保水性稱取魚糜5. 0g，加入O. 65mL的10% NaCl溶液，擂潰6min，裝入已經稱重的干燥離心管，4000r/min離心5min，使其充填結實，4°C保存2h。水浴加熱至內部溫度90°C，取出，5000r/min離心5min,用濾紙吸干水分后稱重。保水性計算公式如下
歷騰 X 100_o(2)鹽溶性蛋白含量第一步用牛血清蛋白為對照，制作595nm處吸光度標準曲線牛血清蛋白標準曲線的制作采用考馬斯亮藍法。首先配制100 μ g/mL的牛血清白蛋白和lOmg/mL考馬斯亮藍G250溶液，按照表I添加各物質于試管中。用紫外分光光度計在595nm處測定其吸光度，根據所得數據繪制標準曲線。表I牛血清蛋白標準曲線的制作
實驗號牛血清白蛋白(niL)蒸餾水(niL)考馬斯亮藍(lOmg/mL)總體積(niL)~
~OOI56
~020856
~2040656
~0~60456
~0~80~256
~5IO56
第二步稱取魚糜5. 0g，然后加入20mL冰冷的O. 6mol/L KCl溶液，在研缽中研磨、勻漿，4°C靜置I. 5h，10000r/min離心30min，取上清液lmL，加入5mL考馬斯亮藍試劑，于595nm處測定吸光度，用0.6mol/L KCl做空白對照。根據所得的吸光度和所繪制的標準曲線計算出鹽溶蛋白的含量。(3)肌原纖維蛋白溶液的測定取5g魚肉樣品，添加10倍量的20mmol/L Tris-maleate緩沖液(pH7. O,內含
O.05mol/L KCl),充分勻衆,然后在9000r/min下低溫離心IOmin,以洗去魚糜樣品中殘留水溶性蛋白質。棄去上清液，在沉淀中加入10倍量的20mmol/L Tris_maleate緩沖液(pH7. O,內含O. 6mol/L KCl )，充分勻漿后在4°C下提取鹽溶性蛋白質lh，然后在9000r/min下低溫離心lOmin，上清液即為實驗用肌原纖維蛋白溶液。用考馬斯亮藍法測定其中的蛋白質含量，所得肌原纖維蛋白溶液用O. 6mol/L KCl調節濃度在4mg/mL，供屬性(Ca2+-ATPase活性、巰基含量、表面疏水性)測定。(4) Ca2+-ATPase 活性測定測定的試劑體系如表2所示表2Ca2+_ATPase活性測定時添加的試劑
權利要求
1.基于絲膠蛋白的抗凍劑的制備方法，其特征在于步驟為用水溶解絲膠蛋白，質量體積比濃度為O. 5 10% (g/mL);用O. 5 I. 5mol/L NaOH溶液調pH 7. O 9. 0，保持溫度20 40°C ;加入胰蛋白酶，加入量為胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=IOOOOU 40000U:Ig,酶解反應O. 5 4h ;酶解結束后，將溶液加熱到80 100°C，并保持5 IOmin進行滅酶處理；將所得多肽溶液冷凍干燥，絲膠源酶解蛋白抗凍劑。
2.根據權利要求I所述的基于絲膠蛋白的抗凍劑的制備方法，其特征在于步驟為I.用水將絲膠蛋白溶解，質量體積濃度為3%(g/mL);2.用lmol/L的NaOH調pH值到8. 5，保持溫度37°C;3.加入胰蛋白酶，加入量為胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=30000U:lg，酶解反應時長3h ；4.酶解結束后，將溶液加熱到95°C，并保持6min進行滅酶處理，將所得多肽溶液冷凍干燥，絲膠源酶解蛋白抗凍劑。
全文摘要
基于絲膠蛋白的抗凍劑的制備方法，步驟為用水溶解絲膠蛋白，濃度為0.5～10％(質量體積分數，g/mL)；用0.5～1.5mol/L NaOH溶液調pH 7.0～9.0，保持溫度20～40℃；加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力絲膠蛋白質量=10000U～40000U1g)，酶解反應0.5～4h；酶解結束后，將溶液加熱到80～100℃，并保持5～10min進行滅酶處理；將所得多肽溶液冷凍干燥，絲膠源酶解蛋白抗凍劑。本發明所得的新型抗凍劑屬非糖類物質，應用于蛋白類食品的冷凍保鮮，不會增加這些食品的能量，糖尿病患者可以食用此類凍存的蛋白類食品。
文檔編號A23B4/09GK102823638SQ20121033275
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月10日 優先權日2012年9月10日
發明者顏輝, 吳瓊英, 江明珠, 賈俊強 申請人:江蘇科技大學