快速提取及擴增加拿大一枝黃花基因組的方法

專利名稱：快速提取及擴增加拿大一枝黃花基因組的方法
技術領域：
本發明涉及提取及擴增加拿大一枝黃花基因組的方法，特別是ー種快速提取及擴増加拿大一枝黃花基因組的方法。
背景技術：
加拿大一枝黃花(Solidago canadensis L.)原產于北美,現在,它已擴散到歐洲、亞洲和澳大利亞等地，成為世界范圍內的一種入侵性外來植物。加拿大一枝黃花于1935年作為花卉引入中國，經過70余年的入侵、定居、擴散過程，已擴散至14省、市、區。遺傳多樣性是影響外來物種成功入侵的重要因素之一。加拿大一枝黃花遺傳多樣性研究，一般都有大量樣品需要提取基因組DNA，工作量大，耗時、費力，因此國內外都在探索快速、簡便、經濟、有效的提取方法(楊杰，2005 ；Virk P S et al.，1999)。 目前所存在的植物基因組提取方法主要有CTAB法(董梅，2009)、SDS法、試劑盒法、NaOH法。CTAB法即十六烷基三甲基溴化銨法。這是最廣泛地用來分離植物DNA的方法，對大多數植物種都適用，特別是當樣本數量很小吋。此法運用陽離子去污劑CTAB溶解植物細胞膜，并與DNA形成ー復合物。其優點是不需要準備大量的植物組織，而且適合多種類型的組織提取DNA。另外，此法對樣品數量的要求也不高，從小到毫克數量的標本到許多克的新鮮材料均可使用。但該方法比較花費時間，且所需試劑較多。SDS法即十二烷基硫酸鈉法。此方法的優點是比較快速簡便，可大量提取，而且小于10 mg的新鮮葉子材料就可以產生足夠的DNA。這個方法存在的問題是DNA沉淀物可能不夠緊密，或不一定能形成一緊密的DNA沉淀。且耗費時間也較多，所需試劑也不少。試劑盒法即植物基因組DNA試劑盒提取法。提取的效果比較好，可做對照組。但成本比較高，不適合大批量提取。NaOH法DNA核蛋白能溶于水及高濃度的NaCl溶液，而難溶于O. 14mol/L NaCl溶液，基于這ー原理，利用強堿溶液和機械作用使細胞破裂，利用Tris — HCI的離子活性使DNA和蛋白質分離，通過離心除去雜質，可以獲得DNA。過去曾用于水稻等植物大量樣本的基因組DNA提取，未見用于提取加拿大一枝黃花基因組DNA的報道。發明人使用該現有的法提取加拿大一枝黃花基因組DNA時，遇到提取的基因組DNA樣品在_20°C冰箱不能存放的問題。綜上所述，CTAB法和SDS法雖能夠獲得基因組DNA，但缺點是都不夠快速、簡便，提取一次基因組DNA均要超過兩個小時；試劑盒法提取的基因組DNA質量高，但成本太大，可作對照，不適合大批量提取；NaOH法能夠快速提取基因組，但經實踐后發現，使用該法提取的加拿大一枝黃花基因組DNA不宣保存。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供ー種快速提取及擴增加拿大一枝黃花基因組DNA的方法，采用該方法提取的加拿大一枝黃花基因組DNA適宜保存。為了解決上述技術問題，本發明提供ー種快速提取加拿大一枝黃花基因組的方法，包括以下步驟I)、稱取O. I O. 2 g加拿大一枝黃花的葉片放入容器中，加入液氮后，將葉片研磨成粉末；備注說明研磨完畢后，液氮已基本揮發完；2)、在步驟I)的所得物中加入38 42 μ L的濃度為O. 23 O. 27 mol/L的NaOH溶液作為提取劑，再加入150 170 μ L的濃度為100 mmol/L的Tris-HCl以及加入10 20UL的β-巰基こ醇進行研磨(研磨充分);然后離心，取上清液(約30 50 μ L)并加ddH20 至200 μ L ;得加拿大一枝黃花的DNA模板，該DNA模板置于-20で冰箱中保存。作為本發明的快速提取加拿大一枝黃花基因組的方法的改進步驟I)中，容器為I. 5 mL的離心管，研磨為選取以下任意ー種方法方法一、加入液氮I次，直至整個離心管被液氮充滿；待離心管內的液氮揮發至
<50 μ L時，用塑料研磨棒將離心管中的葉片研磨成粉末；方法ニ、加入液氮2次，待離心管內第一次加入的液氮揮發完畢后立即加入第二次液氮，待離心管內第二次加入的液氮揮發至< 50 μ L時，用塑料研磨棒將離心管中的葉片研磨成粉末；毎次加入的液氮均為直至整個離心管被液氮充滿。作為本發明的快速提取加拿大一枝黃花基因組的方法的進ー步改進步驟2)中的離心為:10000^14000 r/min 離心 4 6 min。作為本發明的快速提取加拿大一枝黃花基因組的方法的進ー步改進步驟2)為加入40 μ L的濃度為O. 25 mol/L的NaOH作為提取劑，再加入160 μ L濃度為100mmol/L的Tris-HCl以及加入10 20 μ L的β -巰基こ醇研磨I 2 min ;再于12000 r/min離心5 min ;取上清液(約30 50 μ L)至200 μ L的離心管內，加ddH20至200 μ L ；得加拿大一枝黃花的DNA模板。該DNA模板可置于-20で冰箱中保存備用。備注說明濃度為100 mmol/L的Tris-HCl對應的PH值是8. O ;其制備方法為先配制100 mmol/L的Tris (三羥甲基氨基甲烷)溶液，再用濃鹽酸(HCl)調節PH至8. O。利用上述方法制備而得的DNA模板的濃度為20 60 ng/ μ L DNA。本發明還同時提供了ー種利用上述方法所得的加拿大一枝黃花的DNA模板進行擴增的方法PCR 體系為ddH2013. 2 μ L, IOXBuffer 2. 5 μ L, dNTP (0. 25 mmol/mL, each) 2 yL,聚こ烯聚吡咯烷酮PVP-40 (質量濃度10%) 2. 5 μ L，牛血清白蛋白BSA (質量濃度1%) 2. 5 μ L，引物 Primer (10 μ mol/L) I μ L, DNA 模板(20 60 ng/ μ L DNA) I μ L, rTaq (5 unit/μ L) 0. 3 μ しPCR反應程序94。。變性 4 min ；94で變性45 s，52で退火45 s，72で延伸45 S，循環39次；72。。延伸 7 min ；
最后4 C保存；PCR反應在PCR儀中進行，所得的PCR產物置-20で冰箱備用。備注說明ISSR法是單引物擴增，引物是單引物，因此取單引物I yL。作為本發明的加拿大一枝黃花的DNA模板進行擴增的方法的改進引物為以下任一引物引物I AGAGAGAGAGAGAGAGT引物2 CACACACACACACACAG引物3 ACACACACACACACACT 引物4 ACACACACACACACACG引物5 AGAGAGAGAGAGAGAGYT引物6 GAGAGAGAGAGAGAGAYC引物7 GAGAGAGAGAGAGAGAYG引物8 ACACACACACACACACYA引物9 ATGATGATGATGATGATG引物10GGAGAGGAGAGGAGA 。本發明的技術內容具體如下I、NaOH改進法提取樣品基因組DNA的步驟稱取O. I O. 2 g葉片放入I. 5 mL的離心管中，用鑷子夾住離心管取液氮，1_2次，待最后一次離心管中的液氮快耗盡的時候，用塑料研磨棒將離心管中的葉片研磨成粉末；加入40 μ L的O. 25 mol/L的NaOH作為提取劑，加入160 μ L的100 mmol/L Tris-HCl,加入10 20 μ L的β -巰基こ醇,再研磨I 2 min ;研磨充分后，12000 r/min離心5min ;取上清液30 50 μ L至200 μ L離心管，加ddH20至200 μ L ;置于-20で冰箱中保存備用。2、PCR擴增方法步驟 采用從美國哥倫比亞大學公布的100條ISSR引物中篩選的10條引物對上述NaOH改進法提取的基因組進行PCR擴增。PCR 體系為ddH2013. 2 μ L, 10XBuffer2. 5 μ L, dNTP (0. 25 mmol/mL) 2 μ L,PVP-40 (10%) 2.5 μ L, BSA (1%) 2. 5 μ L , Primer (10 μ mol/L) I μ L，DNA 模板(20 60 ng/ μ L DNA) I μ L, rTaq (5 unit/ μ L) 0. 3 μ L ；PCR反應程序94で變性4 min ；94で變性45 S，52で退火45 S，72で延伸45S，循環39次；72で延伸7 min;最后4で保存。PCR反應在PCR儀中進行，PCR產物置-20で冰箱備用。本發明對原NaOH法作了兩點改進ー是用液氮對I. 5 mL離心管中的葉片直接進行處理，在離心管中用研磨棒對葉片進行研磨；ニ是在提取基因組DNA過程中加入β-巰基こ醇。本發明的優點如下與常規提取基因組的方法比較，本發明的快速提取加拿大ー枝黃花基因組DNA的方法具有快速，簡便，無需相應的提取DNA的試劑，提取效果與樣品基因組常規提取方法效果相似。本發明的方法試驗成本低，檢測所需時間短(10分鐘左右)。尤其是群體較大時，此種方法更是顯得快速、有效、經濟。與原NaOH法比較，本發明的NaOH改進法獲得的基因組可以長時間保存，穩定性好。總之，本發明既改進了原NaOH法的PCR擴增效果，也改進了常規的CTAB法、SDS法和試劑盒法提取基因組DNA的速度、效率。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進ー步詳細說明。圖I是引物1、6對本發明的NaOH改進法提取的基因組DNA的PCR擴增結果M 為 marker,1、2分別為引物6對O. 2 g、0. 15 g葉片基因組DNA的擴增結果，
3、4、5分別為引物I對O. I g、0. 15 g、0. 2 g葉片基因組DNA擴增結果。圖2是10個引物對NaOH改進法提取的基因組DNA保存20日后的PCR擴增結果M 為 marker,Γ10為引物1-10對本發明的NaOH改進法提取的基因組DNA保存20日后的PCR
擴增結果。圖3是3種PCR體系對4種方法提取的基因組DNA擴增結果M 為 Marker,I - 4為常規體系對(I)CTAB法(2)SDS法(3)原NaOH法(4)試劑盒法提取的基因組DNA (I μ LDNA模板)擴增結果；5、6分別為常規體系對(5)SDS法和(6)原NaOH法提取的基因組DNA (4 μ LDNA模板)擴增結果；7、8分別為(7)含PVP體系和(8)含硫酸銨體系對原NaOH法提取的基因組DNA(I μ LDNA模板)擴增結果。圖4 1 10為引物I到引物10對原NaOH法的基因組DNA保存5日后的PCR產物。圖5為含PVP體系對NaOH法(不加液氮，加β -巰基こ醇)提取的基因組DNA的PCR結果圖。M為Marker，I為含PVP體系對NaOH法(不加液氮，加β -巰基こ醇)提取的基因組DNA的PCR結果。圖6為含PVP體系對NaOH法(加液氮，不加β _巰基こ醇)提取的基因組DNA的PCR結果圖。M為Marker，I為含PVP體系對NaOH法(加液氮，不加β -巰基こ醇)提取的基因組DNA的PCR結果。圖7為10個引物用含PVP體系對NaOH法(加液氮，不加β -巰基こ醇)提取的保存5日后的基因組DNA的PCR結果圖。M為Marker，1-10為10個引物用含PVP體系對NaOH法(加液氮，不加β -巰基こ醇)提取的保存5日后的基因組DNA的PCR結果。
具體實施例方式實施例I、加拿大一枝黃花基因組的提取和擴增，包括以下步驟I)、稱取O. I g加拿大一枝黃花的葉片到I. 5 mL的離心管中，用鑷子夾住離心管取液氮I次(直至整個離心管被液氮充滿)，待離心管中的液氮快耗盡的時候(即，待離心管內的液氮< 50 μ L吋)，用塑料研磨棒將離心管中的葉片研磨成粉末。2)、然后，加入40 μ L的0.25 mol/L的NaOH溶液作為提取劑，加入160 yL的100mmol/L的Tris-HCl (PH 8. O),加入10 yL的β-巰基こ醇,再研磨I min ;研磨充分后，12000 r/min離心5 min ;取所得的上清液(約30 μ L)至200 μ L的離心管內，加ddH20至200 μ L ;置于-20で冰箱中保存備用。上述提取基因組DNA所用時間約9分鐘。所得的基因組DNA作為DNA模板，其濃度約為20 ng/ μ L DNA。3 )、采用ISSR引物對基因組DNA 立即進行PCR擴增。PCR 體系為ddH2013. 2 μ L, 10XBuffer2. 5 μ L, dNTP (0.25 mmol/mL, each) 2μ L,PVP-40 (質量濃度 10%) 2. 5 μ L，BSA (質量濃度 1%) 2. 5 μ L ,Primer (10 μ mol/L)I μ L，DNA 模板(20 ng/μ L DNA) I μ L, rTaq (5 unit/μ L) 0. 3 μ L ；Primer 選用引物I AGAGAGAGAGAGAGAGT 。PCR反應程序94で變性4 min ；94で變性45 S，52で退火45 S，72で延伸45S，循環39次；72で延伸7 min;最后4で保存。PCR反應在PCR儀中進行，PCR擴增結果電泳有多個條帶，表明PCR成功。如圖I (泳道3)。實施例2、加拿大一枝黃花基因組的提取和擴增，包括以下步驟I)、稱取O. 15 g加拿大一枝黃花的葉片到I. 5 mL的離心管中，用鑷子夾住離心管取液氮，重復取兩次，待第二次離心管中的液氮快耗盡的時候(即，加入液氮2次，毎次加入液氮直至整個離心管被液氮充滿；待第一次的液氮揮發完畢后立即加入第二次液氮，待離心管內的第二次加入的液氮< 50μ L吋)，用塑料研磨棒將離心管中的葉片研磨成粉末。2)、然后，加入40 UL的O. 25 mol/L的NaOH溶液作為提取劑，加入160 yL的100 mmol/L Tris-HClCPH 8.0),加入20 yL的β-巰基こ醇,再研磨I min ;研磨充分后，12000 r/min離心5 min ;取所得的上清液(約40 μ L)至200 μ L離心管,加ddH20至200yL;置于-20で冰箱中保存備用。上述提取基因組DNA所用時間約10分鐘。所得的基因組DNA作為DNA模板，其濃度約為60 ng/ μ L DNA。3)、以上述DNA模板(60 ng/μ L DNA)替代實施例I步驟3)中的DNA模板(20 ng/UL DNA)，其余同實施例I步驟3)。PCR擴增結果電泳有多個條帶，表明PCR成功。如圖I (泳道4)。實施例3、加拿大一枝黃花基因組的提取和擴增，包括以下步驟I)、將實施例2步驟I)中的加拿大一枝黃花的葉片由0. 15 g改成0. 2 g，其余同實施例2步驟I)。2)、然后，加入40 μ L的0.25 mol/L的NaOH溶液作為提取劑，加入160 yL的100mmol/L Tris-HCl (PH 8.0),加入15 μ Lβ -巰基こ醇,再研磨I min ;研磨充分后，12000r/min離心5 min ;取所得的上清液(約50 μ L)至200 μ L離心管,加ddH20至200 μ L ;置
干-20で冰箱中保存備用。所得的基因組DNA作為DNA模板，其濃度約為40 ng/ μ L DNA。3)、以上述DNA模板(40 ng/μ L DNA)替代實施例I步驟3)中的DNA模板(20 ng/UL DNA)，其余同實施例I步驟3)。PCR擴增結果電泳有多個條帶，表明PCR成功。如圖I (泳道5)。
實施例4、將實施例3中所用的Primer由引物I改成引物6 引物6 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 。其余同實施例3。PCR擴增結果電泳有多個條帶，表明PCR成功。如圖I (泳道I)。實施例5、將實施例2中所用的Primer由引物I改成引物6 引物6 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 。其余同實施例2。PCR擴增結果電泳有多個條帶，表明PCR成功。如圖I (泳道2)。
實施例6、將實施例3步驟2)所得的基因組DNA樣品(B卩，DNA模板(40 ng/μ L DNA))置干-20で冰箱中保存備用。保存20日以后再以10條不同引物(即引物f引物10)對該基因組DNA樣品以等同于實施例3步驟3)的PCR條件做PCR實驗，電泳結果均有多個條帯，表明PCR成功。見圖2 (泳道1-10)。對照例I、原NaOH法參照現有的NaOH法，取O. 2 g加拿大一枝黃花的葉片放入I. 5mL的離心管，カロ入40 μ L的O. 25 mol/L的NaOH溶液作為提取液，將葉片搗碎，加入160 μ L的100 mmol/Ltris-HCI, 8000 r/min離心5 min,取上清液40 μ L至離心管,加入160 μ L TE,在4°C冰
箱中保存備用。采用ISSR引物對基因組進行PCR擴增，Primer選用引物I。分成以下3種情況I)采用常規的PCR體系，即PCR體系為ddH2018. 2 μ L (或21. 2μ L),10XBuffer2. 5 μ L, dNTP (O. 25 mmol/mL, each) 2 μ L, Primer (10 μ mol/L) I μ L, DNA模板(約 40 ng/ μ L DNA) IuL (或 4 μ L), rTaq (5 unit/ μ L) 0. 3 μ しPCR反應程序94で變性4 min; 94で變性45 S，52で退火45 S，72で延伸45S，循環39次；72で延伸7 min ;最后4で保存。PCR反應在PCR儀中進行，PCR產物當日經電泳，結果表明沒有PCR條帶，即PCR失敗。見圖3 (泳道3、6)。2)、采用含 PVP 的體系，SP PCR 體系為ddH2013. 2 μ L, 10XBuffer2. 5 μ L，dNTP(0. 25 mmol/mL, each) 2 μ L,PVP-40 (質量濃度 10%) 2. 5 μ L,BSA (質量濃度 1%)2. 5 μ L,Primer (10 μ mol/L) I μ L, DNA 模板(約 40 ng/ μ L DNA) I μ L, rTaq (5 unit/μ L) O. 3μ L ；PCR反應程序同情況I)。PCR產物當日經電泳，結果表明有PCR多個條帶，即PCR成功。見圖3 (泳道7)。在經當日的上述PCR實驗成功后，該基因組DNA樣品置于-20で冰箱中保存備用。5日后再以10條不同引物(B卩引物f引物10)對該基因組DNA樣品以上述等同的PCR條件做PCR實驗，電泳結果沒有條帶，表明PCR不成功。見圖4。3 )、采用含硫酸銨的體系，即將上述情況2 )的含PVP的體系中的PVP-40改成濃度相同的硫酸銨溶液(即，質量濃度為10%)，其余等同于情況2);對上述原NaOH法所得的DNA模板(約40 ng/μ L DNA)進行擴增，電泳結果沒有條帶，表明PCR不成功。見圖3(泳道8)。對照例2、SDS法取0. 2 g加拿大一枝黃花的葉子放入I. 5ml離心管中，加入液氮研磨；在研碎的樣品中加400 μ L的分離緩沖液，用適合的速度渦旋10秒鐘，以分散開樣品；在室溫下將
I.5 mL離心管中樣品離心10分鐘，沉淀細胞內物質；搜集300 μ L上清液，棄去沉淀；在上清液中加300 μ I預冷異丙醇，倒轉樣品2次，使之充分混合，在室溫下放置5分鐘；將微離心管中的樣品在室溫下離心20分鐘，以搜集沉淀的DNA;棄去上清液，用300 μ L 80%的こ醇室溫下沉淀10分鐘；室溫下離心樣品12分鐘，棄上清；用300 μ L 80%的こ醇再洗后，室溫下離心5分鐘，棄上清；室溫下干燥樣品I小吋；用100 UL ddH20懸浮樣品，置于_20°C冰箱中保存備用。用此方法耗時約2小吋。采用ISSR引物對基因組進行常規的PCR擴增。PCR體系為ddH2018. 2 μ L (或21. 2 μ L), 10XBuffer2. 5 μ L, dNTP (0. 25 mmol/mL) 2 μ L, Primer (10 μ mol/L) I μ L,DNA 模板(約 40 ng/μ L DNA) I μ L (或 4 μ L)，rTaq (5 unit/μ L) O. 3 μ しPrimer 選用引物 I。PCR反應程序94で變性4 min ；94で變性45 s，52で退火45 s，72で延伸45 S，循環39次；72で延伸7 min ;最后4で保存。PCR反應在PCR儀中進行，PCR產物當日經電泳，結果表明沒有PCR條帶，即PCR失敗。見圖3 (泳道2、5)。對照例3、CTAB法取O. 2 g加拿大一枝黃花的葉子放入I. 5mL離心管中，加入液氮研磨；加入650μ L2%預熱(水浴65°C )過的CTAB緩沖溶液，加入15 μ L β -巰基こ醇，繼續研磨；將研磨的勻衆轉移到I. 5 mLeffendorf管，并將effendorf管置于65°C水浴中溫育約45分鐘，在溫育過程中將管子顛倒幾次以混勻溶液；加入650 μ L24:1的氯仿-異戊醇，輕輕搖動5min以混勻，在室溫下12000 r/min離心5 min ;上層的水相轉入另一個I. 5 mL effendorf管，下層的有機相棄去；在上清中再加650 μ L24:1的氯仿-異戊醇，輕搖5 min。而后在室溫下12000 r/min離心5 min。上層的水相轉入另ー個I. 5 mL effendorf管,加入等體積預冷的無水こ醇,顛倒混勻，置于-20で中沉淀I小時；室溫12000 r/min離心10分鐘，棄上清，沉淀出的DNA用75%こ醇洗滌，離心后將こ醇輕輕倒出；DNA沉淀放入烘箱烘干，用500 μ LH2O溶解；加入500 μ L25:24:1酹-氯仿-異戍醇,輕輕搖動5 min,在室溫下12000 r/min離心5 min ；加入600 μ L24:1的氯仿ー異戍醇,輕輕搖動5 min以混勻,在室溫下12000 r/min離心5min ;重復步驟￠-8)，烘干后，用100 μ LH2O溶解；完全溶解后，用紫外分光光度計測定DNA溶液濃度，并統ー稀釋到25 μ g/ μ L ;原液和稀釋液置于-20で冰箱中保存。用此方法耗時約2小時。采用ISSR引物對基因組進行常規的PCR擴增。PCR體系為ddH2018. 2 μ L,10XBuffer2. 5 μ L, dNTP (0. 25 mmol/mL) 2 μ L, Primerl (10 μ mol/L) I μ L, DNAtemplate (約 40 ng/μ L) I μ L, rTaq (5 unit/μ L) 0· 3 μ しPrimer 選用引物 I。PCR反應程序94で變性4 min ；94で變性45 s，52で退火45 s，72で延伸45S，循環39次；72で延伸7 min ;最后4で保存。PCR反應在PCR儀中進行，PCR產物當日經電泳，結果表明有PCR多個條帶，即PCR成功。見圖3 (泳道I)。對照例4、試劑盒法從-80で冰箱中取出樣品，稱取葉片樣品0. 2 g，剪成小塊放入研缽中；加入液氮，使組織冷凍完全后，快速、用力研磨至粉末狀。研磨時應間斷加入液氮以防止組織融化，研磨充分后將研缽放入56で水浴至樣品粉末剛開始融化；加入350 μ L PBS和O. 9 μ LRNaseA貯存液，用力研磨30 s ;轉移350 μ L研磨好的勻漿至2 mL離心管中，如勻漿體積不足 350 μ L，補充 PBS 至 350 μ L ;加入 150 μ L BufferC_L 和 20 μ L ProteinaseK。立即渦旋振蕩I min混合均勻。短暫離心后，將離心管置56で水浴10 min ;加入150 μ LBufferP-D，渦旋振蕩30 s混合均勻，12000 rpm，離心10 min ;將DNA制備管置于2 ML離心管中，將步驟5中的混合液移至制備管中，12000 rpm，離心I min ;棄濾液，將制備管置回到原來的2 mL離心管中，加入500 μ L Bufferffl, 12000 rpm,離心I min;棄濾液，將制備管置回到原來的2 mL離心管中，加入700 μ L Bufferff2,12000 rpm,離心I min;以同樣的方法，用700 μ L Bufferff2再洗滌一次；棄濾液，將制備管置回到原來的2 mL離心管中，12000 rpm，離心I min ;將DNA制備管置于另ー潔凈的I. 5 mL離心管中，在制備管膜中央加150 μ L Eluent或去離子水，室溫靜置I min, 12000 rpm,離心I min,洗脫DNA ;將制備的DNA置于-20で冰箱中保存備用。用此方法耗時約30分鐘。采用ISSR引物對基因組進行常規的PCR擴增。PCR體系為ddH2018. 2 μ L,10XBuffer2. 5 μ L, dNTP (0. 25 mmol/mL) 2 μ L, Primerl (10 μ mol/L) I μ L, DNA template (約 40 ng/μ L) I μ L, rTaq (5 unit/μ L) 0· 3 μ しPrimer 選用引物 I。PCR反應程序94で變性4 min ; 94で變性45 S，52で退火45 S，72で延伸45S，循環39次；72で延伸7 min;最后4で保存。PCR反應在PCR儀中進行，PCR產物置-20で冰箱備用。PCR產物當日經電泳，結果表明有PCR多個條帶，即PCR成功。見圖3 (泳道4)。對照例5、不加液氮，加β -巰基こ醇參照現有的NaOH法，取O. 2 g葉片放入I. 5mL的離心管，加入40 μ L的O. 25 mol/L的NaOH提取液，將葉片搗碎，加入160 μ L的100 mmol/L tris-HCI (PH 8.0)，加入15μ L β -巰基こ醇,8000 r/min離心5 min,取上清液40 μ L至離心管,加入150 μ L TE,在
4°C冰箱中保存備用。采用ISSR引物對基因組進行PCR擴增。PCR體系為ddH2013. 2 μ L，10XBuffer2. 5 μ L，dNTP (0. 25 mmol/mL) 2 μ L, PVP-40 (10%) 2. 5 μ L, BSA (1%) 2. 5μ L , Primer (10 μ mol/L) I μ L, DNA 模板(約 40 ng/ μ L DNA) I μ L, rTaq (5 unit/ μ L)
O.3 μ しPrimer 選用引物 I。PCR反應程序94で變性4 min ；94で變性45 s，52で退火45 s，72で延伸45S，循環39次；72で延伸7 min;最后4で保存。PCR反應在PCR儀中進行，PCR產物當日經電泳，結果表明沒有PCR條帶，即PCR失敗。見圖5 (泳道I)。對照例6、加液氮，不加β -巰基こ醇稱取0. 2 g葉片到I. 5 mL的離心管中，用鑷子夾住離心管取液氮I次，待離心管中的液氮快耗盡的時候(即，待離心管內的液氮€50μ L吋)，用塑料研磨棒將離心管中的葉片研磨成粉末；加入40 μ L的0. 25 mol/L的NaOH提取液，加入160 μ L的100 mmol/L Tris-HCl (PH 8.0),再研磨I min ;研磨充分后，12000 r/min離心5 min ;取上清液30μ L至200 4し離心管，加(1(1!120至200 μ L ;置于-20で冰箱中保存備用。上述提取基因組DNA所用時間約9分鐘。采用ISSR引物對基因組立即進行PCR擴增。PCR 體系為ddH2013. 2 μ L, 10XBuffer2. 5 μ L, dNTP (0. 25 mmol/mL) 2 μ L,PVP-40 (10%) 2. 5 μ L, BSA (1%) 2. 5 μ L，Primer (10 μ mol/L) I μ L, DNA 模板(約 20ng/ μ L DNA) I μ L, rTaq (5 unit/ μ L) 0. 3 μ L ；Primer 選用引物 I。PCR反應程序94で變性4 min ；94で變性45 S，52で退火45 S，72で延伸45S，循環39次；72で延伸7 min;最后4で保存。PCR產物當日經電泳，結果表明有PCR多個條帶，即PCR成功。見圖6 (泳道I)。 在經當日的上述PCR實驗成功后，該基因組DNA樣品置于-20で冰箱中保存備用。5日后再以10條不同引物(即引物f引物10)對該基因組DNA樣品以等同的PCR條件做PCR實驗，電泳結果沒有條帶，表明PCR不成功。見圖7 (泳道1-10)。對比例7、將實施例3中的PCR體系改成常規的體系，即PCR體系為ddH2018. 2 μ L (或21. 2 μ L), 10XBuffer2. 5 μ L, dNTP (0. 25 mmol/mL, each) 2 μ L, Primer (10 μ mol/L)I μ L，DNA 模板(約 40 ng/μ L DNA) I μ L, rTaq (5 unit/μ L) 0. 3 μ しPCR反應程序同實施例3。其余均同實施例3。結果表明沒有PCR條帶，即PCR失敗。對比例8、將實施例3中的含PVP的體系改成含硫酸銨的體系，即，將實施例3的PCR體系中的PVP-40改成濃度相同的硫酸銨溶液(即，質量濃度為10%)。PCR反應程序同實施例3。其余均同實施例3。結果表明沒有PCR條帶，即PCR失敗。綜上所述，通過上述實施例和對比例，我們發現本發明的NaOH改進法與原NaOH法的比較，采用本發明的NaOH改進法獲得的基因組DNA可長期放置于_20°C冰箱(至少2個月)，還能擴增出條帯。而原NaOH法所提取的基因組，實際放置5天后就出現擴增不出條帶的情況。可見，本發明的NaOH改進法獲得的基因組有更好的保存性。常規PCR體系對CTAB法、試劑盒法提取的基因組DNA能有效擴增出條帶，常規PCR體系和含硫酸銨的PCR體系對本發明NaOH改進法提取樣品基因組DNA不能擴增出條帶，只有本發明的含PVP的PCR體系能對其有效擴增。因此經實驗比較，得到本發明的含PVP的PCR體系能夠對本發明的NaOH改進法提取樣品基因組DNA進行有效擴増。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.快速提取加拿大一枝黃花基因組的方法，其特征是包括以下步驟1)、稱取O.I O. 2 g加拿大一枝黃花的葉片放入容器中，加入液氮后，將葉片研磨成粉末；2)、在步驟I)的所得物中加入38 42μ L的濃度為O. 23 O. 27 mo I/L的NaOH溶液作為提取劑，再加入150 170 μ L的濃度為100 mmol/L的Tris-HCl以及加入10 20 μ L的巰基こ醇進行研磨；然后離心，取上清液并加ddH20至200 μ L ;得加拿大一枝黃花的DNA模板。
2.根據權利要求I所述的快速提取加拿大一枝黃花基因組的方法，其特征是所述步驟I)中，容器為I. 5 mL的離心管，所述研磨為選取以下任意ー種方法 方法一、加入液氮I次，直至整個離心管被液氮充滿；待離心管內的液氮揮發至< 50μ L時，用塑料研磨棒將離心管中的葉片研磨成粉末；方法ニ、加入液氮2次，待離心管內第一次加入的液氮揮發完畢后立即加入第二次液氮，待離心管內第二次加入的液氮揮發至< 50 μ L時，用塑料研磨棒將離心管中的葉片研磨成粉末；毎次加入的液氮均為直至整個離心管被液氮充滿。
3.根據權利要求I或2所述的快速提取加拿大一枝黃花基因組的方法，其特征是所述步驟2)中的離心為:10000 14000 r/min離心4 6 min。
4.根據權利要求3所述的快速提取加拿大一枝黃花基因組的方法，其特征是所述步驟2)為加入40 μ L的濃度為0.25 mol/L的NaOH作為提取劑，再加入160 μ L濃度為100mmol/L的Tris-HCl以及加入10 20 μ L的β -巰基こ醇研磨I 2 min ;再于12000 r/min離心5 min ;取上清液至200 μ L的離心管內，加ddH20至200 μ L ;得加拿大一枝黃花的DNA模板。
5.利用如權利要求Γ4中任一方法所得的加拿大一枝黃花的DNA模板進行擴增的方法，其特征是PCR體系為ddH2013. 2 μ L, IOXBuffer 2.5 μ L, dNTP (O. 25 mmol/mL, each) 2 μ L，聚こ烯聚吡咯烷酮(質量濃度10%)2. 5 yL，牛血清白蛋白(質量濃度1%)2. 5 yL，引物(10 μ mol/L)Iμ L, DNA 模板 I μ L, rTaq (5 unit/ μ L) 0. 3 μ L ；PCR反應程序94。。變性 4 min ；94で變性45 s，52で退火45 s，72で延伸45 S，循環39次；72。。延伸 7 min ；4で保存；PCR反應在PCR儀中進行。
6.根據權利要求5所述的加拿大一枝黃花的DNA模板進行擴增的方法,其特征是所述引物為以下任一引物引物 I AGAGAGAGAGAGAGAGT引物 2 CACACACACACACACAG引物 3 ACACACACACACACACT引物4 ACACACACACACACACG引物5 AGAGAGAGAGAGAGAGYT引物6 GAGAGAGAGAGAGAGAYC引物7 GAGAGAGAGAGAGAGAYG引物8 ACACACACACACACACYA引物9 ATGATGATGATGATGATG引物1OGGAGAGGAGAGGAGA 。
全文摘要
本發明公開了一種快速提取加拿大一枝黃花基因組的方法，包括以下步驟1)、稱取0.1～0.2g加拿大一枝黃花的葉片放入容器中，加入液氮后，將葉片研磨成粉末；2)、在步驟1)的所得物中加入38~42μL的濃度為0.23~0.27mol/L的NaOH溶液作為提取劑，再加入150~170μL的濃度為100mmol/L的Tris-HCl以及加入10～20μL的β-巰基乙醇進行研磨；然后離心，取上清液并加ddH2O至200μL；得加拿大一枝黃花的DNA模板。本發明還同時提供了一種利用上述方法所得的加拿大一枝黃花的DNA模板進行擴增的方法。
文檔編號C12N15/10GK102827832SQ20121034159
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月15日 優先權日2012年9月15日
發明者潘晶晶, 胡淺淺, 熊琳月, 吳瑩亮, 竺知茹, 謝辛慈, 吳佳, 徐婷婷, 竺錫武 申請人:浙江理工大學