專利名稱：加拿大一枝黃花內生真菌的抗菌發酵液的制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，涉及ー種發酵培養方法，具體涉及加拿大一枝黃花內生真菌的抗菌發酵液的制備方法。
背景技術：
隨著經濟的發展和人民生活水平的提高，人們越來越關注環境污染，生態平衡和人類健康等問題。尤其是對食品品質要求也越來越高。無公害蔬菜和緑色食品，已經得到全社會的公認。開發和利用生物農藥，開展生物防治，勢在必行。當前，微生物農藥在開展生物防治中將大顯身手。因為它具有明顯優點對環境安全，無公害，無殘留，不易產生抗 性，生產成本低，發酵エ藝簡単，對非靶標生物安全。作為微生物農藥來源之一的植物內生真菌(Endophytic fungi)在宿主植物長期相互作用、協同進化、互相適應過程中，在植物體內維持了微生態系統平衡。同時，為了保持這種平衡，植物內生真菌可能產生與其周邊環境(即宿主植物)相似或相同作用的次生代謝產物。因此，可以認為植物內生真菌的次生代謝產物可以替代宿主植物的代謝產物，進而作為新化合物、新藥物篩選的潛在或替代資源，從而可以有效降低新藥物或其它用途活性物質的研發成本。加拿大一枝黃花canadensis)作為ー種外來物種，繁埴カ極強,傳播速度快，生長優勢明顯，生態適應性廣闊，與周圍植物爭陽光、爭肥料，直至其它植物死亡，從而對生物多祥性構成嚴重威脅。加拿大一枝黃花可做觀賞切花、飼料、蜜源，同時可用干天然色素的生產和提煉精油。目前，已經發現加拿大一枝黃花體內具有較強的抗氧化、自由基消除活性和多種抑菌活性的黃酮類成分。此外還有報道加拿大一枝黃花的植物浸提液對許多雜草(如光頭稗和大狗尾草)及多種蔬菜(紫花苜蓿、紅莧菜、小麥、大豆和棉花)的種子萌發及幼苗生長具有顯著的化感作用。根據植物內生真菌內共生理論，加拿大一枝黃花很有可能存在著特殊的內生真菌，通過產生特殊的具有抗菌活性的次生代謝產物。目前，國內外還沒有加拿大一枝黃花內生真菌次生代謝產物對植物病原菌抑菌活性的研究報道。
發明內容
本發明的目的在于提供ー種具有較強的抑制植物病原真菌活性的加拿大一枝黃花內生真菌抗菌發酵液的制備方法。本發明所述的加拿大一枝黃花內生真菌命名為球毛殼菌yt03 (.Chaetomiumglobosum yt03)，現保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市北辰西路I號院3號，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC No. 5088。本發明所描述的加拿大一枝黃花內生真菌系從中國安徽省合肥市加拿大一枝黃花{SoIidgo canadensis)植物活體中分離得到的。加拿大一枝黃花內生真菌命名為球毛殼菌Woかxs yt03),保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC No. 5088 ；本發明加拿大一枝黃花內生真菌抗菌發酵液的具體發酵制備操作步驟如下
(1)菌種活化
在無菌條件下，用接種環挑取少許加拿大一枝黃花內生真菌試管斜面保藏菌種，轉接于已滅菌的馬鈴 薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板中，置培養箱內溫度28°C 土 rc，活化培養5 7天，得到活化菌種；
(2)種子培養
用無菌打孔器(內徑5mm)在無菌條件下將活化菌種打成直接為5mm菌碟，接種5塊菌碟于含有50ml液體培養基的三角搖瓶內，恒溫搖床培養，搖床轉速160轉/分,溫度280C ±2°C，培養2 3天，得搖床種子；
(3)發酵培養
將搖床種子接種到裝有50ml液體培養基的250ml三角搖瓶中，接種量5%，搖床轉速160轉/分，溫度28°C ±2°C，培養5 7天，得到加拿大一枝黃花內生真菌發酵液；加拿大一枝黃花內生真菌發酵液在無菌條件下過濾除去菌絲體，過0. 22微米過濾器，即得到加拿大一枝黃花內生真菌的抗菌發酵液；
發酵培養特征培養第I天，菌體為少量灰色的粉末；培養第3天，淡粉色的細粉末減少，出現黑色的小菌絲球；培養第5天，黑色菌絲球繼續增多，并且體積變大，發酵液為黃褐色；培養第7天，出現大量黑色的菌絲球，體積也變大，發酵液為褐色；
所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I
升;
所述液體培養基蛋白胨15克，葡萄糖20克，氯化鈣0.5克，磷酸氫二鉀0. I克，硫酸亞鐵0. 01克,硝酸鈉I克,水1000毫升，pH自然；
使用前以上述兩種培養基在溫度121°C、壓力0. IMPa下滅菌30 min。本發明通過對球毛殼菌yt03的抗菌發酵液的抗菌試驗發現，該菌對供試六種植物病原真菌(即辣椒疫霉病菌iPhytophthora capsici),番爺枯萎病菌ifusariumoxysporum)，蘋果腐爛病菌〈Cytospora mandshurica)，蘋果炭疽病菌(Colle to trichumgloeosporioides),率炭疽病菌(Gloelsporium fructigenum),小麥赤霉病菌(/7W1Sari應
具有較為明顯的抑制菌絲生長作用。本發明利用植物內生真菌資源，以求獲得抗植物病原真菌病害新型農用抗生素類天然成分。本發明所述加拿大一枝黃花內生真菌抗菌發酵液的抗菌試驗如下
1.植物病原真菌
辣椒疫霉病菌{Phytoph thora capsici ),番爺枯萎病菌 ifusarium oxysporum),蘋果腐爛病菌(Qytospora mandshuri ca),蘋果炭疽病 HCo I Ietotrichumgloeospori oi des )，率炭疽病菌(Gloelspori um fruc tigenum)，小麥赤霉病菌 QFusari umgraminearum )；
2.病原微生物的培養
取病原菌的斜面培養物分別接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板活化，在(28±2) °C恒溫箱中培養5天；
3.抑制菌絲生長速率法測定抗菌活性
在100毫升的無菌三角瓶中加入6毫升本發明制備的加拿大一枝黃花內生真菌的抗菌發酵液和54毫升馬鈴薯葡萄糖瓊脂無菌融化的培養基，搖勻，分別各取10毫升置于直徑為9厘米無菌培養皿內制成平板，冷卻后在每個培養基平面放入I個供試病原菌菌餅(直徑為6毫米)，菌餅的菌絲面貼在培養基表面，將平板置于28±1°C培養96小吋。采用十字交叉法測定菌落生長直徑，用下述公式計算抑制率
權利要求
1.加拿大一枝黃花內生真菌的抗菌發酵液的制備方法，其特征在于所述加拿大一枝黃花內生真菌命名為球毛殼菌yt03 (.Chaetomium globosum yt03),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市北辰西路I號院3號，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC No. 5088 ； 具體發酵制備操作步驟如下 (1)菌種活化 在無菌條件下，用接種環挑取少許加拿大一枝黃花內生真菌試管斜面保藏菌種，轉接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板中，置培養箱內溫度28°c 土rc，活化培養5 7天，得到活化菌種； (2)種子培養 用無菌打孔器(內徑5mm)在無菌條件下將活化菌種打成直接為5mm菌碟，接種5塊菌碟于含有50ml液體培養基的三角搖瓶內，恒溫搖床培養，搖床轉速160轉/分,溫度280C ±2°C，培養2 3天，得搖床種子； (3)發酵培養 將搖床種子接種到裝有50ml液體培養基的250ml三角搖瓶中，接種量5%，搖床轉速160轉/分，溫度28°C ±2°C，培養5 7天，得到加拿大一枝黃花內生真菌發酵液；加拿大一枝黃花內生真菌發酵液在無菌條件下過濾除去菌絲體，過0. 22微米過濾器，即得到加拿大一枝黃花內生真菌的抗菌發酵液； 發酵培養特征培養第I天，菌體為少量灰色的粉末；培養第3天，淡粉色的細粉末減少，出現黑色的小菌絲球；培養第5天，黑色菌絲球繼續增多，并且體積變大，發酵液為黃褐色；培養第7天，出現大量黑色的菌絲球，體積也變大，發酵液為褐色； 所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I升; 所述液體培養基蛋白胨15克，葡萄糖20克，氯化鈣0.5克，磷酸氫二鉀0. I克，硫酸亞鐵0. 01克,硝酸鈉I克,水1000毫升，pH自然； 使用前上述兩種培養基在溫度121°C、壓力0. IMPa下滅菌30 min。
全文摘要
本發明涉及加拿大一枝黃花內生真菌的抗菌發酵液的制備方法。該方法包括以下操作步驟1.菌株活化，2.一級種子培養，3.二級種子培養，4.發酵培養，得到加拿大一枝黃花內生真菌發酵液，發酵液為褐色；加拿大一枝黃花內生真菌發酵液在無菌條件下過濾除去菌絲體，過0.22微米過濾器，即得到加拿大一枝黃花內生真菌的抗菌發酵液。本發明明確了具有廣譜抗菌活性的球毛殼菌yt03(Chaetomiumglobosumyt03)菌株的抗菌發酵液的制備方法，通過對球毛殼菌yt03抗菌發酵液的抗菌試驗發現該菌發酵液對供試六種植物病原真菌具有較為顯著的抑制菌絲生長作用。
文檔編號A01N63/04GK102719363SQ201210180678
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者吳祥為, 唐俊, 操海群, 李學德, 柏鈺, 花日茂, 郭正彥 申請人:安徽農業大學