專利名稱：解淀粉芽孢桿菌Ba168及其發酵培養方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于利用有益微生物對植物病害進行生物防治的領域，具體涉及解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amylolquefaciens)Bal68菌株，以及該菌株的發酵生產及其發酵產物對防治植物病原菌的作用。
背景技術：
植物病害的流行不但引起作物減產，給人類造成重大經濟損失，甚至帶來災難性后果。植物病害的危害還會導致農產品品質低劣，不堪使用或加工，甚至導致人畜中毒。為防治植物病害，化學農藥因為具有成本低、見效快、省時省力等優點曾一度成為人們的首選，但是，化學農藥一般不可降解，隨著化學農藥的大量使用，引發了環境污染、生態破壞、食品污染等事件。這使研究開發利用生物農藥成為植物保護工作者的重要研究課題。生物農藥是指利用生物活體或其代謝產物針對農業有害生物進行殺滅或抑制的制劑，具有安 全、高效、無污染等特點，與保護生態環境和社會協調發展的要求相吻合，是未來農藥發展的必然趨勢。微生物農藥是生物農藥中應用最為廣泛的一類，也是生物防治的重要材料。微生物源農藥的主要成分是微生物活體及其次生代謝產物，由于微生物種類多樣，其活性也很廣泛，包括殺蟲、殺菌、除草以及植物生長調節作用等。自然界中用于生防細菌的，主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬。特別是近幾年，利用微生物防治植物真菌性病害由于對環境安全，可以減緩病原菌產生抗藥性，已經成為當前防治植物病害的主流方法。解淀粉芽孢桿菌是一種嗜溫、好氧、產芽孢的桿狀細菌，其生理特征多樣，該菌在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不污染環境，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。解淀粉芽孢桿菌不僅可以在土壤、植物根際體表等外界環境中廣泛存在，而且是植物體內常見內生細菌，尤其是在植物的根、莖內部。解淀粉芽孢桿菌通過成功定殖至植物根際、體表或體內，改變其周圍菌群環境和種類，與病原菌競爭植物周圍的位點，并且分泌多種抗菌物質以抑制病原菌生長，同時誘導植物防御系統抵御病原菌入侵，從而達到改良土壤和生防的目的。尖孢鐮刀菌是一類既可侵染植物又可在土壤中生存的兼性寄生真菌，用化學農藥難于防治，屬于頑固性病害。該類病菌和其他植物病原菌一樣，存在著種下分化，可侵染許多寄主植物，具有多種專化型。其中，侵染中草藥的塊根、塊莖的一部分專化型為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum Shl,該菌可引起常見中草藥的根腐病等病害,而塊根、塊莖和鱗莖等恰好是許多名貴中藥材的藥用部位，經濟價值高，而尖孢鐮刀菌的侵染使中藥材的藥用價值下降，另外，病原菌可以在病殘體和土壤中過冬，一旦發病，笠年仍會引起作物病害，持續影響作物產量，給我國中藥材產業造成巨大的損失。
發明內容
本發明的目的在于公開了一種解淀粉芽孢桿菌Bal68 CGMCC No. 6462。
本發明的第二個目的在于公開了解淀粉芽孢桿菌Bal68的發酵方法，以及由該方法制備所得的發酵液。本發明的第三個目的在于公開了解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑及其制備方法。本發明的第四個目的在于公開了上述解淀粉芽孢桿菌Bal68、由解淀粉芽孢桿菌Bal68制備所得的發酵液以及解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑在制備防治由尖孢鐮刀菌屬引起的作物根腐病藥物中的應用。本發明的目的是通過以下技術方案實現的一種解淀粉芽孢桿菌Bal68，CGMCC No. 6462，該解淀粉芽孢桿菌Bal68的16SrDNA如序列表I所示。解淀粉芽孢桿菌Bal68的發酵方法，其中，所述發酵方法是以權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68為原料,包括下述步驟 (I)、菌種活化將解淀粉芽孢桿菌Bal68菌種接種到LB試管斜面上面，于30°C活化培養48h，所述LB培養基配方為酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15 20g，水1000ml, pH 7. 4 7. 6，連續轉接3代，確保菌株純度后，再接種到種子液中使用。(2)、種子液的制備從斜面上挑取菌接種到裝有LB培養基的三角瓶中，于恒溫振蕩培養箱中振蕩培養，即得到種子液，所述的LB培養基配方為蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g, pH7. O ；(3)、發酵培養將種子液先后進行種子罐發酵培養和大規模工業發酵培養，得到發酵液；其中種子罐發酵培養和大規模工業發酵培養步驟如下種子罐發酵培養FJ液體培養基，裝料系數O. 7，培養條件26 28°C，48h，接種量9%，通氣量2. 5L/min，攪拌轉速200r/min ；大規模工業發酵培養FJ液體培養基(2(Γ36Τ)，裝料系數O. 7，培養條件26 28°C，60 70h，接種量9%，通氣量2. OL/min，攪拌轉速150r/min ；所述的FJ液體培養基配方為黃豆餅粉2%，葡萄糖1%，淀粉I. 5%，CaCO3O. 25%，K2HPO4O. 05%, MgSO4 · 7H20 O. 25%，FeSO4 · 7H20 O. 25%，其余為水，所列百分比為質量分數。由上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵方法制備所得的發酵液。解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑的制備方法，其中，所述制備方法是以由上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵液為原料，包括下述步驟(I)、過濾濃縮發酵液用草酸調節pH至4. 5^5. O后，將發酵液通過截留分子量4000(Tl00000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為25 45°C，膜通量為5(T60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為6-7倍；(2)、噴霧干燥向濃縮后的發酵液中添加發酵液質量I. 0%的白炭黑、微細滑石粉、輕質碳酸鈣或2500目超細重鈣填料；再將芽孢溶液經噴霧制成粉末，即得到解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中噴霧干燥的進口溫度為17(Tl90°C，出口溫度為65 85°C，進料速度 60mL/min，噴頭壓力 O. IOMPa0解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵液，其中，所述解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵液由上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵所得。解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中，所述解淀粉芽孢桿菌Bal68是以由上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵液為原料，通過下述方法制備所得
(I)、過濾濃縮發酵液用草酸調節pH至4. 5^5. O后，將發酵液通過截留分子量4000(Tl00000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為25 45°C，膜通量為5(T60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為6-7倍；(2)、噴霧干燥向濃縮后的發酵液中添加發酵液質量I. 0%的白炭黑、微細滑石粉、輕質碳酸鈣或2500目超細重鈣填料；再將芽孢溶液經噴霧制成粉末，即得到解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中噴霧干燥的進口溫度為17(Tl90°C，出口溫度為65 85°C，進料速度 60mL/min，噴頭壓力 O. IOMPa0上述技術方案所述一種解淀粉芽孢桿菌Bal68、上述技術方案所述的發酵液以及上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑在制備防治由尖孢鐮刀菌屬引起的作物根腐病藥物中的應用。根據上述技術方案所述的應用，其中，所述由尖孢鐮刀菌屬引起的作物根腐病為白術根腐病、西洋參根腐病和三七根腐病。 本發明具有以下有益效果I、本發明的解淀粉芽孢桿菌Bal68 CGMCC No. 6462，環境相容性好，具有很高的生物活性，特別是對由鐮刀菌屬真菌引起的根腐病具有較好的防效，通過實驗證明，該解淀粉芽孢桿菌菌株制劑對西洋參根腐病、白術根腐病菌和三七根腐病菌等都具有很好的防治作用。 2、本發明為防治由鐮刀菌屬真菌弓I起的根腐病提供了一種新的微生物農藥。菌株保藏信息本發明解淀粉芽孢桿菌Bal68，分類命名Bacillusamyloliquefaciens,已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行保藏，保藏單位地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCCNo. 6462，保藏日期為2012年8月21日。
圖I為解淀粉芽孢桿菌Bal68 CGMCC No. 6462的16SrRNA同源序列比對分析樹狀圖。
具體實施例方式為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對鐮刀菌屬真菌引起的根腐病防治中的應用作進一步的說明。實施例I :解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bal68的分離與純化(I)、土樣采集從秦嶺深山原始森林土壤中選取多個地點，每個地點取3到15cm處土壤,混合過粗篩，取25g做分離用；(2)、培養基平板制備將NA培養基和LB培養基加熱融化倒入培養皿內冷卻，制成NA培養基和LB培養基平板。所述的NA培養基配方為葡萄糖10g，瓊脂15g，牛肉浸膏3g，酵母膏lg，蛋白胨5g，水1L，pH 6. 8 7. O ；LB液體培養基配方為蛋白胨10g, NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，pH 7. O ；
(3)、細菌的分離 平板接種分別采用涂抹法和混菌法接種。涂抹法分別取上述5個濃度土壤稀釋液O. 05ml，分別加入已做好的NA、LB平板上，用滅菌的玻璃刮刀將稀釋液均勻的涂布開。放入32°C恒溫箱中培養，設三個重復。混菌法分別取上述5個濃度土壤稀釋液1ml，加入培養皿中，將已熔化的45飛(TC的NA、LB培養基倒入，輕輕搖轉使樣品和培養基混合均勻，待培養基凝固后放入培養箱32°C恒溫培養，設三個重復；(4)、菌種的純化隨時觀察并記錄菌株的原始培養結果，統一編號。根據細菌的特征及時挑取單個細菌落至LB平板上，采用劃線分離的方法純化。·
實施例2 :解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bal68 的鑒定對實施例I所得的解淀粉芽孢桿菌Bal68 CGMCC No. 6462的鑒定過程為(I)、形態特征在LB培養基上菌落呈圓形，表面有明顯光澤，不光滑；邊緣不規貝U，有擴散，表面褶皺；菌落呈乳白色，不透明，渾濁；具有一定的粘附性；所述的LB培養基配方為蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，瓊脂18g，水1000ml, pH為7. O。培養前期(5 12h)菌落呈無色透明液滴，有光澤；后期(24h后)呈白色不透明狀，較為暗淡。菌體桿狀，長約2 μ m，單生，周生鞭毛，產芽孢。革蘭氏染色呈陽性。(2)、生理生化實驗通過對解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bal68的生理生化特性試驗(如表I所示)并結合該菌株的形態特征，對照《伯杰氏細菌手冊》(Buchanan & Gibbons，1984)和《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠和蔡妙英，2001)進行檢索，鑒定Bal68菌株為芽孢桿菌屬。表I解淀粉芽孢桿菌BA168菌株的生理生化特征
_測試項目_iSM_測試項目_結果
革蘭氏染色Gt脂_+
細胞ft徑>1μ m-BJJ膠液化+
細胞形狀桿狀硫化氫 +_形成芽泡_+_MW_+
權利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌Bal68，CGMCC No. 6462，該解淀粉芽孢桿菌Bal68的16SrDNA如序列表I所示。
2.解淀粉芽孢桿菌Bal68的發酵方法，其特征在于所述發酵方法是以權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68為原料,包括下述步驟 (1)、菌種活化將解淀粉芽孢桿菌Bal68菌種接種到LB試管斜面上面，于30°C活化培養48h，所述LB培養基配方為酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15 20g，水IOOOml，pH 7. 4 7. 6，連續轉接3代，確保菌株純度后，再接種到種子液中使用。
(2)、種子液的制備從斜面上挑取菌接種到裝有LB培養基的三角瓶中，于恒溫振蕩培養箱中振蕩培養，即得到種子液，所述的LB培養基配方為蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，ρΗ7· O ； (3)、發酵培養將種子液先后進行種子罐發酵培養和大規模エ業發酵培養，得到發酵液；其中種子罐發酵培養和大規模エ業發酵培養步驟如下 種子罐發酵培養FJ液體培養基，裝料系數O. 7，培養條件26 28°C，48h，接種量9%，通氣量2. 5L/min，攪拌轉速200r/min ； 大規模エ業發酵培養FJ液體培養基(2(Γ36Τ)，裝料系數O. 7，培養條件26 28°C，60 70h，接種量9%，通氣量2. OL/min，攪拌轉速150r/min ； 所述的FJ液體培養基配方為黃豆餅粉2%，葡萄糖1%，淀粉I. 5%，CaCO3O. 25%，K2HPO4.O.05%，MgSO4 · 7H20 O. 25%，FeSO4 · 7H20 O. 25%，其余為水，所列百分比為質量分數。
3.由權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵方法制備所得的發酵液。
4.解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑的制備方法，其特征在于所述制備方法是以由權利要求3所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵液為原料，包括下述步驟 (1)、過濾濃縮發酵液用草酸調節PH至4.5、. O后，將發酵液通過截留分子量40000 100000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為25 45°C，膜通量為5(T60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為6-7倍； (2)、噴霧干燥向濃縮后的發酵液中添加發酵液質量I.0%的白炭黑、微細滑石粉、輕質碳酸鈣或2500目超細重鈣填料；再將芽孢溶液經噴霧制成粉末，即得到解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中噴霧干燥的進ロ溫度為17(Tl90°C，出口溫度為65 85°C，進料速度60mL/min，噴頭壓力 O. IOMPa0
5.解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其特征在于所述解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑由權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵制備所得。
6.解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其特征在于所述解淀粉芽孢桿菌Bal68是以由權利要求3所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發酵液為原料，通過下述方法制備所得 (1)、過濾濃縮發酵液用草酸調節PH至4.5、. O后，將發酵液通過截留分子量4000(Tl00000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為25 45 °C，膜通量為5(T60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為6-7倍； (2)、噴霧干燥向濃縮后的發酵液中添加發酵液質量I.0%的白炭黑、微細滑石粉、輕質碳酸鈣或2500目超細重鈣填料；再將芽孢溶液經噴霧制成粉末，即得到解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中噴霧干燥的進ロ溫度為17(Tl90°C，出口溫度為65 85°C，進料速度60mL/min，噴頭壓力 O. IOMPa0
7.權利要求I所述ー種解淀粉芽孢桿菌Bal68、權利要求3所述的發酵液以及權利要求6所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑在制備防治由尖孢錸刀菌屬引起的作物根腐病藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述由尖孢錸刀菌屬引起的作物根腐病為白術根腐病、西洋參根腐病和三七根腐病。
全文摘要
本發明公開了解淀粉芽孢桿菌Ba168及其制備方法和應用，其目的是提供一種植物病原菌的生物防治方法。該菌株已于2012年8月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.6462。該菌株從秦嶺原始森林土壤中分離獲得，經過菌種活化、搖瓶發酵、種子液發酵和大發酵罐發酵得到發酵液，發酵液經過過濾濃縮、超濾膜分離、噴霧干燥和包裝后制成殺菌劑。本發明具有對由尖孢鐮刀菌引起的白術根腐病、西洋參根腐病和三七根腐病等根腐病害有很好的防治作用的優點。
文檔編號C12N1/20GK102839142SQ201210342838
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者楊軒, 翟楓, 楊長鎖, 安德榮 申請人:楊凌綠都生物科技有限公司