專利名稱：一株耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物及其篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種用于環境污染修復的微生物，尤其涉及一株耐鹽耐堿的Cr(VI) 還原菌株及其篩選方法。
背景技術：
據初步調查，目前我國鉻渣總堆存量超過600萬噸，分散于20多個省市的80余處。經過幾十年的雨水沖淋、滲透，鉻渣堆存場地已被嚴重污染，據有關專家估算，已被鉻渣嚴重污染、必須治理的土壤數量估計在400萬噸至1000萬噸之間，由此導致的水體污染亦不容忽視。《中華人民共和國國民經濟和社會發展第十一個五年規劃綱要》已將鉻渣污染治理列為環境治理重點工程，明確要求對堆存鉻渣及受污染土壤進行綜合治理，實現所有堆存鉻渣無害化處置。因此，開展鉻污染水體與土壤的修復治理工作已刻不容緩。
鉻在環境中主要以Cr(VI)和Cr(III)的形式存在。與Cr(III)相比，Cr(VI)具有致畸、致癌、致突變等高毒性。而Cr(III)則易與環境中的有機、無機化合物相結合，形成復雜穩定的難溶化合物，因而遷移性小，生物有效性低，其毒性僅為Cr (VI)的千分之一。因此，將高毒性的Cr(VI)還原為低毒性的Cr(III)是Cr (VI)污染物修復的基本思路。
與物理隔離法、化學還原沉淀法、離子交換法、反滲透法等傳統的物理化學方法相比，生物修復因其具有低成本、操作簡單、無二次污染等優勢而受到廣泛的關注與重視。近年來，已有不同種屬的鉻還原微生物得以分離和報道，如無色桿菌Achromobacter sp. Ch_l、微桿菌· Microbacterium sp. MP30、蒼白桿菌 Ochrobactrum sp.、金黃節桿菌 Arthrobater aurescens sp.、芽孢桿菌Bacillus sp.等。但迄今尚未有關于解糖假蒼白桿菌Pseudochrobactrum saccharolyticum還原Cr (VI)的報道。同時，已報道的微生物中，大多數菌株的Cr(VI)還原過程在厭氧條件下進行，且耐鹽能力低、耐堿能力有限，因而難以滿足實際污染土壤和水體中高鹽分含量、堿性環境的實際修復要求。
因此，本領域迫切需要篩選獲得新的、能夠滿足實際污染水體與土壤修復要求的微生物資源，從而為鉻污染生物修復的實施提供技術支撐。發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一株耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物及其篩選方法。該菌株對鉻污染物具有高耐受能力，且能夠在高鹽度的堿性環境中將高毒性的Cr (VI)還原為低毒性的Cr (III)。本發明為鉻污染的生物修復提供了新的微生物資源。
本發明的目的通過以下技術方案來實現一株耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物，它的16S rRNA基因具有SEQ ID No.1所示的基因序列；該耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物保存在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號為CGMCC No. 5873。
上述耐鹽耐堿的Cr (VI)還原微生物通過以下步驟篩選獲得
(I)富集稱取5g鉻污染土壤于50mL已滅菌的液體LB培養基中(氯化鈉5g I71, 酵母提取物5g L—1，胰蛋白胨IOg L-1，pH=7. O 7. 5)，28°C，160rpm振蕩培養；
(2)馴化當土懸液由原來的黃色變成灰綠色時，取上懸液接種至含Cr(VI)的液體LB培養基中，28°C，160rpm振蕩培養，當培養液再次由黃色變成灰綠色時，將其接種至另一含有更高Cr(VI)濃度的液體培養基中，以此逐步提高培養基中的Cr (VI)濃度，從而馴化目的菌株；馴化過程中所用的Cr (VI)以過濾滅菌后的1(2&207母液形式進行添加；馴化所用的 Cr(VI)濃度梯度依次為 5mM、8mM、10mM、12mM、15mM ；
(3)分離當馴化濃度為15mM Cr(VI)時，經過5d的培養，培養液變成灰綠色，以該菌液作為分離母液，取ImL按梯度稀釋成lO'lO'lO'lO'lO'lO-7 ;分別從10_5、10_6、 Kr7的稀釋液中吸取50uL涂布于含7mM Cr (VI)的固體培養基中，28°C倒置培養2 3d ;
(4)純化分別挑取不同形態的單菌落，于含有7mM Cr(VI)的固體培養基中進行劃線接種；28°C倒置培養2 3d后，再次挑取單菌落劃線于含鉻培養基中；如此純化3 4 代，獲得耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物。
本發明的有益效果是本發明篩選獲得一種新的耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物Pseudochrobactrum saccharolyticum LY10,該菌株為革蘭氏陰性菌，桿狀0. 5 1. O μ mX1. O 2. 5 μ m,在好氧條件下可將重鉻酸鉀和鉻酸鉀中的高毒性Cr (VI)還原為低毒性的Cr(III);該菌具有一定的耐鹽性和耐堿性；在培養基氯化鈉濃度為2 20g L_1,pH 7. O 10. 7的范圍內均可以很好地進行生長和Cr(VI)還原。該·菌株的Cr(VI)還原效率高，可用于制備水體或土壤中鉻污染的生物修復材料，應用于去除水中和土壤中的Cr (VI) 污染物。
Pseudochrobactrum saccharolyticum LYlO 菌種已于 2012 年 3 月 12 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo. 5873 ;分類命名為解糖假蒼白桿菌LY10,拉丁文學名為Pseudochrobactrum saccharolyticum LYlO0 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區北辰西路I號院 3號，郵編為100101。
圖1是本發明菌株的系統發育樹；
圖2是本發明菌株在不同pH條件下的生長情況圖3是本發明菌株在不同pH條件下的Cr(VI)還原情況柱狀圖4是本發明菌株在不同鹽度下的Cr(VI)還原情況柱狀圖。
具體實施方式
以下結合實施例進一步說明本發明，本發明的目的和效果將變得更加明顯。
實施例1 :本發明菌株的篩選與分離
1、富集采集杭州原紅星化工廠鉻渣堆場污染土壤，稱取5g土壤于50mL已滅菌的液體LB培養基中(氯化鈉5g L—1，酵母提取物5g ΙΛ胰蛋白胨IOglApH= . O 7. 5)，28°C， 160rpm振蕩培養。
2、馴化當土懸液由原來的黃色(Cr(VI)呈黃色)變成灰綠色(Cr(III)呈綠色)時，取上懸液接種至新配置的含Cr (VI)的液體LB培養基中，28°C，160rpm振蕩培養，當培養液再次由黃色變成灰綠色時，將其接種至含有更高Cr(VI)濃度的液體培養基中，以此逐步提高培養基中的Cr(VI)濃度，從而馴化目的菌株。馴化過程中所用的Cr(VI)以過濾滅菌后的K2Cr2O7母液形式進行添加。馴化所用的Cr (VI)濃度梯度依次為5mM、8mM、IOmM, 12mM、 15mM。
3、分離當馴化濃度為15mM Cr(VI)時，經過5d的培養，培養液變成灰綠色，以該菌液作為分離母液，取ImL按梯度稀釋成10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7。分別從10_5、10_6、 Kr7的稀釋液中吸取50uL涂布于含7mM Cr (VI)的固體培養基中，28°C倒置培養2 3d。
4、純化分別挑取不同形態的單菌落，于含有7mM Cr(VI)的固體培養基中進行劃線接種。28°C倒置培養2 3d后，再次挑取單菌落劃線于含鉻培養基中。如此純化3 4 代，獲得具有高濃度Cr (VI)耐受能力的菌株，命名為LY10。
實施例2 :菌株的生理生化及16S分子鑒定
1、生理生化特征
菌株LYlO在不含鉻的LB固體平板上生長24h后，菌落呈不透明的圓形，表面光滑濕潤，呈乳白色。將菌株LYlO劃線至含7mM Cr(VI)的固體培養基中，培養72h后，菌落因富集了一定量的鉻而呈淡黃色。該菌株為革蘭氏陰性菌，桿狀，無鞭毛，大小為O. 5 1.0X1. O 2. 5um。該菌株的檢測鑒定委托中國科學院微生物研究所進行(2011微檢字第 243號)。細菌的氧化酶試驗結果為陽性，接觸酶試驗結果為陽性。其BIOLOG鑒定結果如表
表1. LYlO對BIOLOG GN板上95種碳底物的利用能力
權利要求
1.一株耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物，其特征在于，它的16S rRNA基因具有SEQ IDNo.1所示的基因序列；該耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物保存在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號為=CGMCC No. 5873。
2.—種權利要求1所述耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物的篩選方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (O富集稱取5g鉻污染土壤于50mL已滅菌的液體LB培養基中(氯化鈉5g I71,酵母提取物5g L—1，胰蛋白胨IOg 171，？!1=7.0 7.5)，281，160印111振蕩培養； (2)馴化當土懸液由原來的黃色變成灰綠色時，取上懸液接種至含Cr(VI)的液體LB培養基中，28°C，160rpm振蕩培養，當培養液再次由黃色變成灰綠色時，將其接種至另一含有更高Cr (VI)濃度的液體培養基中，以此逐步提高培養基中的Cr (VI)濃度，從而馴化目的菌株；馴化過程中所用的Cr(VI)以過濾滅菌后的K2Cr2O7母液形式進行添加；馴化所用的Cr (VI)濃度梯度依次為 5mM、8mM、10mM、12mM、15mM ； (3)分離當馴化濃度為15mMCr(VI)時，經過5d的培養，培養液變成灰綠色，以該菌液作為分離母液，取ImL按梯度稀釋成lO'lO'lO'lO'lO'lO-7 ;分別從10_5、10_6、10_7的稀釋液中吸取50uL涂布于含7mM Cr (VI)的固體培養基中，28°C倒置培養2 3d ; (4)純化分別挑取不同形態的單菌落，于含有7mMCr(VI)的固體培養基中進行劃線接種；28°C倒置培養2 3d后，再次挑取單菌落劃線于含鉻培養基中；如此純化3 4代，獲得耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物。
全文摘要
本發明公開了一株耐鹽耐堿的Cr(VI)還原微生物及其篩選方法，該菌株為桿狀革蘭氏陰性菌，耐鹽耐堿，對鉻污染物耐受濃度高，能在好氧條件下將高毒性Cr(VI)還原為低毒性的Cr(III)；當pH為8.5，NaCl濃度為20gL-1時，菌株經114h培養后，可將Cr(VI)濃度從130mgL-1降至9.1mgL-1，還原率高達95.2%；本發明所提供的菌株具有高的Cr(VI)還原效率，可作為鉻污染水體與土壤的生物修復材料，用于去除水中和土壤中的Cr(VI)污染物。
文檔編號C12N1/20GK103013850SQ201210356338
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者龍冬艷, 蔡寬, 劉磊 申請人:杭州高博環保科技有限公司