耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原I₁₂C及制備方法和應用的制作方法

專利名稱：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原I₁₂C及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術制藥領域，特別涉及一種用于人的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原I12C及制備方法和應用。
背景技術：
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌指的是對惡唑類青霉素如甲氧西林、苯唑西林和氟氯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌，是一種存在人和動物的體表、鼻咽、會陰部及腸道的革蘭陽性菌，通 常引發皮膚軟組織感染、菌血癥以及轉移并發癥，如肺炎、心內膜炎、膿毒性關節炎和骨髓炎。自1961年被英國學者Jevons首次發現，目前已成為全球ICU病房、燒傷、戰創傷等感染率最高的病原菌之一，其引起的局部感染經久不愈，全身感染死亡率高達20%。因其傳播途徑廣泛，易暴發流行，又由于其致病性強，變異性大，且呈多重耐藥而成為臨床上治療的難點，被稱為“超級細菌”，這一特點使其極有可能作為未來軍事斗爭的細菌武器和生物恐怖戰劑。當前，MRSA已與乙型肝炎、AIDS被列為世界三大最難解決的感染性疾病，并位居首位。在國外，2005年美國的MRSA感染監控資料顯示，美國全年的嚴重感染人數為9. 4萬多人，致死病例約為1. 9萬人，這一數字甚至超過艾滋病致死人數。在國內，2010年中國CHINET細菌耐藥性檢測網結果顯示，國內主要地區14所教學醫院，MRSA平均檢出率為51. 7%，最高為77. 6% ；2008年中國CHINET細菌耐藥性監結果顯示，國內主要地區12所教學醫院MRSA平均檢出率為55. 9%，最高為77. 5%，屬于MRSA感染的嚴重國家之一。以上海為例，2004年該地區14所醫院金黃色葡萄球菌中MRSA的平均檢出率為63. 9%，最高為86. 5%，而2006年MRSA的平均檢出率為64. 6%，最高達92. 5%。由此可見，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌正在全球蔓延，其感染率和死亡率不斷攀升，嚴重威脅人類健康。目前，萬古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最后一道防線，但1997年以來耐萬古霉素的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌相繼被分離出來，可見抗生素的發展遠遠跟不上細菌耐藥性的發展，使得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌即將面臨無抗生素可治的嚴峻挑戰。因此，加強對MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。目前，美國研發的MRSA疫苗已進入III期臨床試驗階段，因此，研發具有自主知識產權的、高效、安全、經濟的MRSA疫苗對控制MRSA感染、耐藥性發展、生物恐怖防御和提高國際競爭力具有重要意義。由于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌致病因子包括莢膜多糖、ClfA, IsdB、腸毒素、TSST-U α-溶血素以及凝固酶等數十種，且含量較低，直接從全菌中分離純化出保護性抗原的難度較大，方法繁瑣，不利于疫苗的產業化制備。利用基因工程技術將菌體有效的保護性抗原進行克隆表達使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌鐵離子表面決定蛋白IsdB是一種外膜蛋白抗原，IsdB不僅是MRSA —個重要外膜錨釘蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同時它也是MRSA從宿主獲得鐵的一個主要工具。細菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，這些外膜蛋白作為抗體和免疫細胞攻擊的主要靶標，可以介導對細菌最直接有效的殺滅作用，是決定免疫反應是否對人體具有保護性的關鍵因素。ClfA是一種調節金葡菌與纖維蛋白素的結合，促進金葡菌同生物材料表面、血塊、血小板、內皮表面結合的黏附素。在金葡菌與血小板的結合中ClfA也起著重要的作用，在導管誘導所致金葡菌心內膜炎的動物模型中，其相互作用也很關鍵。ClfA和IsdB都是MRSA的外膜蛋白成分，其編碼基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候選抗原。本研究利用生物信息技術篩選出ClfA和IsdB的活性功能片段，并將活性功能片段組合起來，目前尚未見使用ClfA、IsdB選擇兩個亞單位的活性功能片段的融合蛋白作為免疫原性材料，制備MRSA雙價疫苗的報道。

發明內容
針對耐 甲氧西林金黃色葡萄球菌的高耐藥性的問題，本發明提供一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)重組融合蛋白I12C,該融合蛋白表達量高，便于分離純化，高效安全。本發明所述耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)重組融合蛋白I12C,由MRSA鐵離子表面決定蛋白IsdB的兩個活性片段與ClfA抗原分子的一個活性片段組成，各片段通過連接肽融合。所述重組蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。所述連接肽為Linker,該連接肽的氨基酸序列結構-(GGGGS)η,其中較好的技術方案是η為1。活性片段IsdBl的氨基酸如SEQ ID NO: 3所示，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:4所示；活性片段IsdB2的氨基酸如SEQ ID NO: 5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示。所述的Clfa,的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，核苷酸序列如SEQ ID N0:8所
/Jn ο上述重組融合蛋白的制備方法包括以下步驟I)構建融合基因(并加入Linker)使用的引物如下
權利要求
1.一種重組融合蛋白I12C,其特征在于該融合蛋白由MRSA鐵尚子表面決定蛋白IsdB的兩個活性片段IsdBl、IsdB2與ClfA抗原分子的一個活性片段組成，各片段通過連接肽融口 O
2.根據權利要求1所述的重組融合蛋白I12C,其特征在于，所述重組蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:1 所示。
3.根據權利要求1所述的重組融合蛋白I12C,其特征在于，所述連接肽為Linker，該連接肽的氨基酸序列結構-(GGGGS)η，η為I。
4.根據權利要求1所述的重組融合蛋白I12C,其特征在于活性片段IsdBl的氨基酸如SEQ ID NO:3所示；活性片段IsdB2的氨基酸如SEQ ID NO:5所示。
5.根據權利要求1所述的重組融合蛋白I12C,其特征在于所述的Clfa的氨基酸序列如 SEQ ID NO:7 所示。
6.權利要求1-5任一所述的重組融合蛋白I12C的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 O構建融合基因使用的引物如下Pl :5，-GCGGATCCATGGGCAGCGCACCAAACTCTCG-3’I12-Linker-P2 :5’ -GCTTCTTTACTGCTGCTGCCACCGCCACCGGCATTGGCTTTAGTAAA-3’P3 :5’ -GCCAATGCCGGTGGCGGTGGCAGCAGCAGTAAAGAAGCAGATGCA-3， -Linker-Cl fA97_639P4 :5’ -ATGCGGCCGCTTATCACTCGAGCATACGAGGCGCAC-3’ 2)使用步驟I)設計的引物Pl及P2，通過PCR擴增出編碼I12-Linker-的基因片段；使用P3及P4，擴增出編碼-Linker-ClfA97_639的基因片段；再以擴增出的基因片段為模板，用引物Pl及P4擴增出編碼I12C的基因片段； 3)將步驟2)所獲得的基因片段克隆至表達重組載體，然后將該重組載體轉化至宿主菌； 4)誘導轉化后的宿主菌表達I12C重組蛋白； 5)純化重組蛋白。
7.—種表達載體，其特征在于包含編碼權利要求1所述重組蛋白的核酸序列。
8.根據權利要求7所述的表達載體,其特征在于,所述表達載體為pGex系列載體、pET系列載體及PQE系列載體，優選為pGeX-6P-2。
9.一種表達如權利要求7或8所述表達載體的宿主菌。
10.如權利要求9所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌XLl-blue、BL21系列或HMS174系列，優選為大腸桿菌XLl-blue。
11.權利要求1所述的重組蛋白在制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗中的應用。
12.權利要求1所述的重組蛋白在制備耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白I12C的制備方法和應用，該融合蛋白由MRSA鐵離子表面決定蛋白IsdB的兩個活性片段與ClfA抗原分子的一個活性片段組成，各片段通過連接肽融合。該融合蛋白純度高，表達量高，便于分離純化，高效安全，其制備方法簡捷、容易放大、重復性好，所述融合蛋白輔以鋁佐劑后，可制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗以及制備耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測試劑盒，通過動物試驗驗證，可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好抗MRSA感染的免疫保護作用。
文檔編號C12R1/19GK103059139SQ20121037501
公開日2013年4月24日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者曾浩, 鄒全明, 馮強, 樊紹文, 盧陸, 蔡昌芝, 吳翼, 顧江, 章金勇 申請人:重慶原倫生物科技有限公司, 中國人民解放軍第三軍醫大學