專利名稱：棉花GhTCP2基因啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，具體地說，涉及棉花GhTCP2基因啟動子及其組織特異性表達模式的應用。
背景技術：
棉花(Gossypium Hirsutum)作為全球最重要的經濟作物之一,其纖維是人類紡織業的主要原材料。與此同時，棉花的種子和油料也是人們日常生產生活中不可或缺的優良資源，在畜牧業和柴油生產方面發揮著重要作用。但是，棉花病蟲害很多，尤其是蟲害，直接影響棉花產量。其中，棉鈴蟲是棉花蕾鈴期重要鉆蛀性害蟲，主要蛀食蕾、花、鈴，也取食嫩葉。該蟲是中國棉區蕾鈴期害蟲的優勢種，近年為害十分猖獗，搞好棉鈴蟲的預測預報及綜合防治顯得十分重要。
TCP2基因隸屬于TCP轉錄因子家族，最早發現的TCP家族成員包括玉米teosintebranched I (TBI )基因、金魚草的cycloidea (CYC)基因和水稻PCFl，PCF2基因，這三個成員的英文縮寫首字母組即位該家族名稱的由來。TCP轉錄因子蛋白成員有獨特的二級結構，其中部含有一個約60個氨基酸組成的保守的DNA結構域(TCPdomain),形成一個非典型的喊性螺旋 _ 環-螺旋結構[non-canonicalbasic-Helix-Loop-Helix (bHLH) structure]，可能參于蛋白質的二聚化和與DNA結合的功能。研究進展表明，TCP家族成員主要在植物的花器官、葉腋、頂端分生組織、腋芽等快速生長的部位表達，這一現象表明，TCP家族可能在細胞分裂和生長發育中起著重要的作用。蟲害是影響棉花產量的重要因素之一，棉鈴蟲主要取食棉花的嫩葉和棉蕾。轉基因抗蟲棉攜帶的Bt基因能有效抑制棉鈴蟲侵害。目前市場上銷售的轉基因抗蟲棉的Bt基因是由花椰菜病毒的35S啟動子驅動的，該啟動子在植物各個組織都有表達，使得不被棉鈴蟲取食的其他組織或器官過量表達異源Bt基因，可能對棉花的生長發育，抵御生物和非生物脅迫的能力造成影響。本發明涉及的GhTCP2啟動子可以取代目前市場上廣泛應用的轉基因棉花中的花椰菜病毒的35S啟動子，讓抗蟲基因Bt在棉鈴蟲取食的主要部位表達，降低了抗蟲基因對轉基因棉花除抗蟲能力外的其他能力的影響。
發明內容
本發明的目的是提供棉花GhTCP2基因啟動子序列、其組織特異性表達模式及應用。本發明提供棉花GhTCP2基因啟動子，其具有I) SEQ ID No. I所示的核苷酸序列；或2) SEQ ID No. I所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
本發明提供含有棉花GhTCP2基因啟動子的載體。在本發明的實施例中，含有棉花GhTCP2基因啟動子的載體為pBI121_GhTCP2。本發明還提供含有上述載體的宿主細胞。本發明還提供含有棉花GhTCP2基因啟動子的轉化植物細胞。本發明提供了棉花GhTCP2基因啟動子在制備轉基因植物中的應用。本發明提供了棉花GhTCP2基因啟動子在植物組織中表達模式的應用。其中，所述的植物組織為腋芽或花蕾。其中，所述的表達模式為表達抗蟲基因。 其中，所述的植物為擬南芥、水稻或棉花。本發明具有下列優點及有益效果(I)本發明提供了棉花GhTCP2基因啟動子(核苷酸序列如SEQID No. I所示)及其在植物腋芽及花蕾中組織特異性表達模式。(2)通過轉化擬南芥野生型Col-Ο，并進行⑶S染色，發現GhTCP2在植物腋芽和花蕾中特異表達(擬南芥、水稻、棉花等)，有望對為在棉花幼嫩的棉鈴中表達抗蟲基因提供特異的啟動子，以提聞棉花的抗蟲能力。
圖I為GhTCP2基因棉花不同部位半定量PCR結果。圖2為含有棉花GhTCP2基因啟動子的載體圖譜。圖3為含有棉花GhTCP2基因啟動子的載體酶切驗證結果；其中I為空載體pBI121用EcoRV和BamHI雙酶切的酶切結果；2為pBI121_GhTCP2載體用EcoRV和BamHI雙酶切酶切結果舊代表博邁德生物技術有限公司Ikb DNA ladder。圖4為棉花GhTCP2基因啟動子驅動⑶S基因轉化擬南芥后⑶S染色結果，其中
I.在擬南芥幼苗中表達；2.在幼嫩的根尖部分表達；3.在整個花器官中都有表達；4.在葉腋處表達；5.花器官放大后,發現在幼嫩的花蕾中表達量較強。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。實施例I棉花GhTCP2基因啟動子的獲得本發明的GhTCP2基因啟動子是采用Genome Walking法從市場上購得的陸地棉(Gossypium hirsutum)品種新陸早13號中克隆得到的。將本實驗室之前擴增獲得的GhTCP2基因中間保守序列(其序列如SEQ ID No. 2所示)、5’ RACE和3，RACE側翼序列用SeqMan軟件進行拼接，根據拼接得到的序列設計引物GhTCP2ProSPl、GhTCP2ProSP2和GhTCP2ProSP3。以棉花基因組總DNA為模板，用Genome Walking Kit同種AP引物進行3次巢式PCR反應擴增基因啟動子區。將IstPCR反應液稀釋1000倍后，取I μ L作為2nd PCR反應的模板，配制2ndPCR反應液。取2nd反應液稀釋1000倍后，取I μ L作為3rdPCR反應的模板，配制3rdPCR反應液。分別用試劑盒中提供的四種AP引物進行三次巢式PCR反應，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。操作步驟如下(I)配制 1st PCR 反應液
權利要求
1.棉花GhTCP2基因啟動子，其特征在于，其具有1)SEQ ID No. I所示的核苷酸序列；或2)SEQ ID No. I所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權利要求I所述基因啟動子的載體。
3.如權利要求2所述的載體，其為pBI121-GhTCP2。
4.含有權利要求2或3所述載體的宿主細胞。
5.含有權利要求I所述基因啟動子的轉化植物細胞。
6.權利要求I所述的基因啟動子在制備轉基因植物中的應用。
7.權利要求I所述的基因啟動子在植物組織中表達模式的應用。
8.如權利要求7所述的應用，所述的植物組織為腋芽或花蕾。
9.如權利要求7所述的應用，所述的表達模式為表達抗蟲基因。
10.如權利要求7-9任一所述的應用，所述的植物為擬南芥、水稻或棉花。
全文摘要
本發明涉及棉花GhTCP2基因啟動子及其應用。所述的棉花GhTCP2基因啟動子序列如SEQ ID No.1所示。本發明發現GhTCP2基因啟動子在植物(擬南芥、棉花等)的腋芽和花蕾中特異表達，可為在棉花腋芽和花蕾中特異性表達抗蟲基因提供啟動子，減小抗蟲基因在其他組織表達對棉花產生的負面影響，在不影響棉花產量的前提下，提高棉花的抗蟲能力。
文檔編號C12N15/63GK102943075SQ20121039233
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月16日 優先權日2012年10月16日
發明者李學勇, 邢進, 趙金鳳, 劉偉娜 申請人:中國農業科學院作物科學研究所