專利名稱：利用固定化酶合成膽紅素的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學與生物技術領域，具體地說，涉及利用固定化酶促合成膽紅素的方法。
背景技術：
:膽紅素是人膽汁中的主要色素，呈橙黃色。膽紅素具備多種藥理作用，是制造人工牛黃的主要原料。藥理實驗證明，它對W256瘤有較好的抑制作用；它對乙型腦炎病毒的滅活率，抑制指數比去氧膽酸和膽酸高I 1.5倍；它還是一種有效的肝臟疾病的治療藥物，在不破壞肝組織的情況下，有增殖新細胞的作用，可治療血清肝炎、肝硬變等病。此外，膽紅素具有鎮靜、鎮驚、解熱、降壓等作用。主要用于人工牛黃的原料及藥品、保健品、化妝品等行業。牛黃是牛的膽結石，在我國藥用已有二千多年歷史，是世界上公認的珍貴稀有藥料，以牛黃配制的中成藥方180多個品種，如日本的救心丹，我國的安宮牛黃丸等。目前市場上的牛黃有天然牛黃、人工合成牛黃及人工培育牛黃。市場上以人工牛黃為主。人工牛黃的純膽紅素含量只有0.7%。人工牛黃粉膽紅素含量太低，遠遠低于天然牛黃35%的含量標準，功效大打折扣是可想而知的。假定人工牛黃粉膽紅素含量按35%的膽紅素配制而成本增加不多，則人工牛黃市場會更大。按常規方法生產膽紅素(即以動物如豬膽為材料經化學方法提取)，由于技術門檻太低，毛利潤率極低，國內生產企業眾多，如四川什邡市康源植物原料有限公司、福建瑞國藥業有限公司/哈爾濱瑞國醫藥有限公司、四川菲德力制藥有限公司、安徽科寶生物工程有限公司等。目前，膽紅素是來自膽汁，一公斤膽紅素約需5萬個豬膽，故膽紅素成本較高，因而售價也高。酶催化生產高純度膽紅素之綜合成本較低，故經濟效益極佳
發明內容
:本發明的目的在于提供一種利用固定化酶促合成膽紅素的方法。本發明的另一目的還在于提供含有編碼本發明所述的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶的基因序列。本發明的再一目的在于同時利用固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶催化，以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下生產膽紅素。為實現本發明的上述目的，本發明人進行了大量深入的實驗，通過克隆較佳的血紅素加氧酶和膽綠素還原 酶的基因至適當的載體，轉入大腸桿菌后，本發明的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶在大腸桿菌中皆高表達。表達的重組蛋白菌體未破菌直接固定化、或破菌后粗蛋白直接固定化、又或破菌后粗蛋白經純化得純蛋白再固定化，進而形成固定化酶，并獲得了高活力的固定化血紅素加氧酶和高活力的固定化膽綠素還原酶，該固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶能以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下生產膽紅素。
本發明的血紅素加氧酶是來源于Clostridium tetani E88。序列表中的SEQ IDN0.:2代表本發明的血紅素加氧酶的氨基酸序列。本發明的膽綠素還原酶是來源于Synechocystis sp.PCC 6803。序列表中的SEQ ID N0.:4代表本發明的膽綠素還原酶的氨基酸序列。本發明的酶固定化載體是選擇了環氧型載體LX-3000，還可選用本領域的其它酶固定化載體，如傳統的無機載體材料二氧化硅、活性炭、玻璃珠等，再如有機高分子載體大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。通過與該類型載體結合，本發明獲得了高活力的固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶，該二酶以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下高轉化率(大于80% )生產膽紅素。附圖的簡要說明:
圖1A:重組的血紅素加氧酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果，圖中右邊條帶M并配有數字(單位是“KD”)是蛋白分子量標準，左邊主帶是重組的血紅素加氧酶(粗提蛋白)，具體參見實施例3;圖1B:重組的膽綠素還原酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果，圖中右邊條帶M并配有數字(單位是“KD”)是蛋白分子量標準，左邊主帶是重組的膽綠素還原酶(粗提蛋白)，具體參見實施例4;
具體實施方式
:利用本領域已知的技術，先分別構建含有編碼血紅素加氧酶和膽綠素還原酶的基因的載體質粒，然后轉入大腸桿菌后，無須誘導培養，將表達的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶提取并固定于適當的環氧型酶載體，從而獲得高活力的固定化血紅素加氧酶和高活力的固定化膽綠素還原酶。該固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶雙酶合力催化，以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下生產膽紅素。本發明所獲得的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶基因可以在原核細胞或真核細胞胞內表達，也可采用本領域已知的任何其它適當方法實現在原核細胞或真核細胞胞外表達。在本發明制備血紅素加氧酶和膽綠素還原酶的方法中，所述載體的宿主細胞為原核細胞或真核細胞。所述原核細胞包括但不限于大腸桿菌(如HB101，BL21，JM109，DH5a)、凝結芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌和鏈霉菌。所述真核細胞包括但不限于釀酒酵母和畢赤巴斯德酵母(如畢赤巴斯德酵母GS115/9891)。本發明用于克隆血紅素加氧酶和膽綠素還原酶基因的載體包括但不限于pRSET系列、pGEM_T系列等。本發明用于固定化血紅素加氧酶和膽綠素還原酶基因的載體包括但不限于環氧型載體等。在本申請文本中所用的氨基酸三字母或單字母表達方式，采用IUPAC規定的氨基酸代碼(Eur.J.Biochem.，138:9_37，1984)。下列實施例僅用于說明本發明而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按常規條件或制造商建議的條件進行。實施例1:血紅素加氧酶編碼基因的擴增與克隆
根據基因庫(GenBank NC_004557)基因序列設汁引物H0-F:5’ AACATATGTCAATAATTAATAATTATAT3’ 和 HO-R:5’ AAGGCGCGCCCTATTTAAATCTATCAAATTCT3’。用引物對HO-F和HO-R從Clostridium tetani E88中擴增血紅素加氧酶編碼基因。擴增條件為:20mMTris-HCl (pH8.8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4,0.1%Triton Χ_100，50μΜ dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP，400nM 引物 HO-F，400nM引物HO-R, 1.0 U Pfu DNA 聚合酶(Promega,USA),用接種環挑取少許Clostridium tetaniE88菌體，再用無菌水調反應體積至50 μ I。PCR擴增反應程序為:95°C 3分鐘，35圈循環:95°C 50秒、50°C 30秒和72°C I分鐘，最后72°C 10分鐘。擴增的產物經限制性內切酶NdeI和AscI酶切后與經同樣限制性內切酶NdeI和AscI酶切的載體pRSET-A(源自Invitrogen，USA)連接，得質粒pRSET-HO。經DNA測序，確定該被克隆的血紅素加氧酶的核苷酸序列，具體示于序列表中序列1，相應的氨基酸序列為序列表中的序列2。實施例2:膽綠素還原酶編碼基因的擴增與克隆根據基因庫(GenBank NC_000911)基因序列設計引物BR-F:5’ AACATATGTCTGAAAATTTTGCAGTT3’ 和 BR R:5’ AAGGCGCGCCCTAATTTTCAACCTTATATCCA3’。用引物對BR-F和BR-R從Synechocystis sp.PCC 6803中擴增膽綠素還原酶編碼基因。擴增條件為:20mMTris-HCl (pH8.8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO1^mM MgSO4,0.1%Triton Χ_100，50μΜ dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP，400ηΜ 引物 BR-F，400ηΜ引物 BR-R, 1.0 U Pfu DNA 聚合酶(Promega, USA),用接種環挑取少許 Synechocystissp.PCC 6803菌體，再用無菌水調反應體積至50 μ I。PCR擴增反應程序為:95°C 3分鐘，35圈循環:95°C 50秒、50°C 30秒和72°C I分鐘，最后72°C 10分鐘。擴增的產物經限制性內切酶NdcI和AscI酶切后與經同樣限制性內切酶NdeI和AscI酶切的載體pRSET-A(`源自Invitrogen，USA)連接，得質粒pRSET-BR。經DNA測序，確定該被克隆的膽綠素還原酶的核苷酸序列，具體示于序列表中序列3，相應的氨基酸序列為序列表中的序列4。實施例3:血紅素加氧酶的提取血紅素加氧酶的提取與純化主要參考Hong-Bo Hu, et al.Bioprocess BiosystEng.2007，30:87_90。具體過程如下:將含血紅素加氧酶基因的質粒pRSET-HO轉化感受態細菌細胞E.coli HB101，在Luria broth(LB)平板(含100mg/L卡那霉素)上37°C培養24小時。接種單個克隆于5毫升LB液體培養基(含100mg/L卡那霉素)中于30°C培養20-24小時。離心收集菌體，并懸浮于I毫升IOOmM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)中。然后用超聲波裂解細菌細胞。離心(10°C, 17, 800g, 10分鐘)并收集上清液，即為粗提蛋白(或稱粗提物)。圖1A顯示了重組的血紅素加氧酶粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果，表明血紅素加氧酶(目標帶大小約為26.5kD)在大腸桿菌HB101中有相當高的表達水平。實施例4:膽綠素還原酶的提取膽綠素還原酶的提取與純化主要參考Aya ffatanabe, et al.Acta Cryst.2011,F67，313-317。具體過程如下:將含膽綠素還原酶基因的質粒pRSET-BR轉化感受態細菌細胞E.coli HB101，在Luria broth (LB)平板(含100mg/L卡那霉素)上37°C培養24小時。接種單個克隆于5毫升LB液體培養基(含100mg/L卡那霉素)中于30°C培養20-24小時。離心收集菌體，并懸浮于I毫升IOOmM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)中。然后用超聲波裂解細菌細胞。離心(10°C, 17, 800g, 10分鐘)并收集上清液，即為粗提蛋白(或稱粗提物)。圖1B顯示了重組的膽綠素還原酶粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果，表明膽綠素還原酶(目標帶大小約為36.6kD)在大腸桿菌HB101中有較高表達水平。實施例5:血紅素加氧酶活性的測定配制底物溶液:含50 μ M的血紅素、50 μ M的抗壞血酸和IOOmM Tris鹽酸緩沖液，調pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升血紅素加氧酶粗提蛋白，于30°C進行30分鐘反應。離心(l(TC，17，8(K)g，15分鐘)并收集上清液。通過高壓液相色譜(HPLC)測定所得上清液中膽綠素的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定酶蛋白濃度。一單位酶比活性定義為在上述條件下每分鐘轉化一微摩爾血紅素為膽綠素所需之酶量。血紅素加氧酶(粗提蛋白)特異性活力為0.6U/mg。實施例6:膽綠素還原酶活性的測定配制底物溶液:含20mM的膽綠素、5mM NADP、50mM磷酸鉀緩沖液和終濃度為IOmM之MgCl2,調pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升膽綠素還原酶粗提蛋白，于37°C進行30分鐘反應。離心(l(TC，17，8(K)g，15分鐘)并收集上清液。通過高壓液相色譜(HPLC)測定所得上清液中膽紅素的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定酶蛋白濃度。一單位酶比活性定義為在上述條件下每分鐘轉化一微摩爾膽綠素為膽紅素所需之酶量。結果，膽綠素還原酶(粗提蛋白)特異性活力為0.2U/mg。實施例7:血紅素加氧酶固定化取血紅素加氧酶粗提蛋白，用洗酶緩沖液(0.02M Tris-HCl/0.001MEDTA,pH7.0溶液)稀釋至蛋白含量5 10mg/ml。將酶稀釋液與PB溶液(2.0mol/L磷酸二氫鉀，pH7.5)等體積混合，加入環氧型固定化酶載體LX-3000 (10毫克酶/克載體),于搖床(轉速IOOrpm)中25V反應20小時。反應完成后用濾袋過濾，用洗酶緩沖液清洗5 6次，得到固定化血紅素加氧酶。實施例8:膽綠素還原酶固定化取膽綠素還原酶粗提蛋白，用洗酶緩沖液(0.02M Tris-HCl/0.001MEDTA,pH7.0溶液)稀釋至蛋白含量5 10mg/ml。將酶稀釋液與PB溶液(2.0mol/L磷酸二氫鉀，pH7.5)等體積混合，加入環氧型固定化酶載體LX-3000 (10毫克酶/克載體),于搖床(轉速IOOrpm)中25V反應20小時。反應完成后用濾袋過濾，用洗酶緩沖液清洗5 6次，得到固定化膽綠素還原酶。實施例9:用固定化血紅素加氧酶和膽綠素還原酶制備膽紅素配制底物溶液:含IOOuM的血紅素、100 μ M的抗壞血酸、ImM的NADP、IOOmM Tris鹽酸緩沖液和終濃度 為IOmM之MgCl2，調pH至7.5。取底物溶液10毫升，然后加入0.5克固定化血紅素加氧酶和0.5克固定化膽綠素還原酶，于35°C進行反應2-20小時。離心(10°C，17，800g，15分鐘)并收集上清液。通過高壓液相色譜(HPLC)測定所得上清液中膽紅素的含量。結果，血紅素轉化為膽紅素的轉化率超過80%。本發明不受上述具體文字描述的限制，本發明可在權利要求書所概括的范圍內做.各種改變。這些改變均在本發明的范圍之內。
權利要求
1.一種利用固定化酶促合成膽紅素的方法，其特征在于同時利用固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶，以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II(NADP)輔助下生產膽紅素。
2.權利要求1所述的血紅素加氧酶是在大腸桿菌中表達的重組蛋白。
3.權利要求2所述的重組蛋白在大腸桿菌中表達后，未破菌直接固定化、或破菌后粗蛋白直接固定化、又或破菌后粗蛋白經純化得純蛋自再固定化，進而形成固定化酶。
4.權利要求3所述的重組蛋白是由源自Clostridiumtetani E88的血紅素加氧酶基因編碼，具有序列表中SEQ ID N0.:2所示的氨基酸序列。
5.權利要求1所述的膽綠素還原酶是在大腸桿菌中表達的重組蛋白。
6.權利要求5所述的重組蛋白在大腸桿菌中表達后，未破菌直接固定化、或破菌后粗蛋白直接固定化、又或破菌后粗蛋白經純化得純蛋白再固定化，進而形成固定化酶。
7.權利要求6所述的重組蛋白是由源自Synechocystissp.PCC6803的膽綠素還原酶基因編碼，其具有序列表 中SEQ ID N0.:4所不的氣基酸序列。
全文摘要
本發明涉及一種膽紅素生產方法技術領域。本發明公開利用固定化酶促合成膽紅素的方法。該方法包括如下步驟a)分別克隆血紅素加氧酶基因和膽綠素還原酶基因；b)于大腸桿菌中分別表達重組的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶；c)提取血紅素加氧酶的粗提物或其純酶以及膽綠素還原酶的粗提物或其純酶；d)固定化血紅素加氧酶的粗提物或其純酶以及膽綠素還原酶的粗提物或其純酶；e)同時用固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶催化，以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下制備膽紅素。
文檔編號C12P17/16GK103114110SQ20121039568
公開日2013年5月22日 申請日期2012年10月17日 優先權日2012年10月17日
發明者張琦 申請人:邦泰生物工程(深圳)有限公司