專利名稱：具有溶解中肋骨條藻能力的庫氏鹽芽孢桿菌hsqay1及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl及其應用。
背景技術：
由于水體富營養化等原因導致的赤潮災害，對水生生態系統、水產養殖產業和人類健康造成嚴重影響，已經成為全球性的環境問題之一。采用硫酸銅等化學藥劑可以有效抑制和殺滅赤潮藻類，但易對環境產生二次污染。利用改性粘土等物理方法可以絮凝沉淀赤潮藻，但是可能對底棲生物造成負面影響。利用溶藻細菌抑制或防治赤潮藻類具有高效快速、安全可靠，對環境負面影響小的優點，已經成為國內外赤潮防治研究的熱點問題。采用微生物技術治理赤潮的關鍵之一便是獲得具有高效溶解赤潮藻能力的優良菌株。目前，國內外對赤潮的生物防治開展了大量的研究工作，多集中在銅綠微囊藻、藍藻和塔瑪亞歷山大藻等有毒藻類防治研究方面。而中肋骨條藻雖為無毒藻類，但其是廣泛分布于世界各個海域的廣溫廣鹽性種類，且是我國從渤海至南海沿海的主要赤潮種類，因此，對中肋骨條藻赤潮治理的研究也更為重要。本發明所獲得的溶藻細菌分泌物可高效溶解中肋骨條藻，因此，在實際應用中可發揮重要的作用。經檢索專利和其它相關文獻，尚未發現在好氧條件下應用庫氏鹽芽孢桿菌
(Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)溶解赤潮藻類-中肋骨條藻的報道；該溶藻菌
的發現對海洋細菌控藻技術的開發及探討赤潮治理的有效方法具有重要意義
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種庫氏鹽芽孢桿菌株，該菌株可以高效快速的溶解中肋骨條藻；并且不會帶來二次污染以及外種入侵等狀況。本發明所要解決的技術問題還在于提供上述庫氏鹽芽孢桿菌株在降解赤潮暴發海區中的中肋骨條藻中的應用。本發明的第一個技術問題是通過如下技術方案來實現的:一種庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAY1)，于 2012 年 6 月 12 日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2012221。本發明的第二個技術問題是通過如下技術方案來實現的:上述庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl在降解赤潮暴發海區中的中肋骨條藻中的應用。本發明的有益效果是:(I)本發明提供的庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAY1，該菌株能使條鏈狀排列的中肋骨條藻細胞斷裂，而后膨脹成圓球形并最終破裂死亡，經研究發現，實際上，該菌株主要通過其代謝的活性物質來溶解中肋骨條藻；(2)本發明提供的庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl為土著細菌，在實際應用中不會造成二次污染或外種入侵等污染情況；能夠在赤潮的生物治理的實踐中發揮重要作用。
圖1為實施例1中正常中肋骨條藻細胞(A)及庫氏鹽芽孢桿菌HSQAYl(Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)作用下的中肋骨條藻(B)細胞形態顯微照片；圖2 為實施例 2 中庫氏鹽芽抱桿菌HSQAYl(Halobacillus kuroshimensisHSQAYl)的系統發育樹圖；圖3 為實施例 3 中庫氏鹽芽抱桿菌HSQAYl(Halobacillus kuroshimensisHSQAYl)的透射電鏡照片；圖4 為實施例 5 中庫氏鹽芽抱桿菌(Halobacillus kuroshimensis HSQAYI)HSQAYl以10%的體積分數與中肋骨條藻混合時的藻菌數量變化圖；圖5 為實施例 5 中庫氏鹽芽抱桿菌(Halobacillus kuroshimensis HSQAYI)HSQAYl以5%的體積分數與中肋骨條藻混合時的藻菌數量變化圖；圖6 為實施例 5 中庫氏鹽芽抱桿菌(Halobacillus kuroshimensis HSQAYI)HSQAYl以1%的體積分數與中肋骨條藻混合時的藻菌數量變化圖；圖7為實施例5中中肋骨條藻初始密度及不同處理方式的細菌菌液作用48h的藻細胞密度圖(圖中相同字母表示無顯著差異P>0.05)。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。實施例1中肋骨條藻海洋溶藻細菌的篩選方法1.海洋細菌的分離及純化從深圳大鵬灣南澳赤潮爆發海域采集表層海水樣品，0.7 U m玻璃纖維素膜過濾后，梯度稀釋后涂布細菌分離培養基平板，28°C恒溫培養48h，挑取特征差異明顯的菌落劃線，28°C恒溫培養48h。重復以上操作兩次，得到純培養的細菌。所用的細菌分離培養基為2216E瓊脂培養基，成分為:蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高鐵0.lg，瓊脂粉20g，陳海水1000ml, pH 7.6 8.2。2.中肋骨條藻海洋溶藻細菌的篩選從固體斜面培養基上挑取I環菌落接種于50mL細菌活化液體培養基中，28°C恒溫培養48h后，獲得的細菌菌液備用，所用細菌活化液體培養基為2216E海水培養基，成分為蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高鐵0.lg，陳海水1000mL，pH 7.6 8.2。細菌菌液以10%的體積分數與處于對數生長期的無菌藻液(藻細胞濃度約1.0X104cells/mL)混合加到48孔細胞培養板的板孔中(每個板孔容積約1.2mL),每株菌加2個板孔作為篩選試驗組(對照組以無菌海水代替細菌懸液)。用石蠟密封篩選試驗的細胞培養板，置于光照培養箱中培養(溫度23°C，光暗循環比llh:13h)。連續觀察120h，每天用倒置顯微鏡(Olympus 1X70，日本)觀察板孔中的藻細胞形態變化及其存活情況并拍照。所用的藻類液體培養基為 f/2 培養基:75mg NaNO3>5mg NaH2PO4 H20、20mg Na2SiO3 9H20、
4.36mg Na2EDTA、3.15mg FeCl3 6H20、0.0lmg CuSO4 5H20、0.022mg ZnSO4 7H20、
0.0lmgCoCl2 6H20、0.18mg MnCl2 4H20、0.006mg Na2MoO4 2H20，陳海水 1000ml，經脫脂棉過濾后，121°C滅菌20min后，再添加0.1 y g鹽酸硫胺、0.5 u g生物素以及0.5 y gVB12。最終獲得能使條鏈狀排列的中肋骨條藻細胞斷裂成單個細胞，而后單個細胞膨脹成圓球形并最終破裂死亡的溶藻細菌，圖1為中肋骨條藻及該菌作用下的藻細胞形態變化顯微照片，其中A圖為正常中肋骨條藻細胞；圖B為庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl作用下的中肋骨條藻(B)細胞形態顯微照片。實施例2庫氏鹽芽孢桿菌HSQAYl的系統發育樹1.16S rDNA的基因序列測定采用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取庫氏鹽芽孢桿菌HSQAYl的DNA，對基因組DNA進行電泳分析后，以其為模板進行PCR擴增，擴增的上游引物為27F:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，下游引物為1492R:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反應過程包括:98°C 預變性 5min 后，95°C 變性 35S，55°C 退火35s以及72°C延伸90s共35個循環，最后一個循環在72°C保持8min使產物延伸完整。將 PCR 產物電泳純化后，測定其全序列。ATGCAAGTCGAGCGCGGGAAGCGAGTGGATCCCTTCGGGGTGAAGCTCGTGGAACGAGCG 60GCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGATCGGAATAACCCCGGGAAAC 120CGGGGCTAATGCCGGGTAATACTTTTCTTCGCATGAAGATAAGTTGAAAGATGGCTTCTC 180GCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCA 240AGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC 300CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGA 360GCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGAAGAAC 420AAGTACCGTGCGAATAGAGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGGAAGCCCCGGCTAACT 480ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA 540AAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGG 600TCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGGACAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGT 660GAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTTTCTG 720ACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG 780TAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGCTTCCACCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATT 840AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC 900CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT 960TGACATCCTTGGACCTCCCTAG AGATAGGGATTTCCCTTCGGGGACCAAGTGACAGGTGG 1020TGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA 1080CCCCTAATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC 1140CGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT 1200GCTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTGTAGCAAATCCCATAAAACC 1260ATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATC1320GCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC 1380ACGAGAGTTGGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAA14152.菌株的系統發育樹圖將庫氏鹽芽抱桿菌HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)的 16SrDNA基因序列同GenBank中的基因序列進行同源性比較，建立系統發育樹，圖2為該菌的系統發育樹圖。實施例3 庫氏鹽芽抱桿菌 HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)的菌落形態、生理和生化特征
庫氏鹽芽抱桿菌HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)菌落呈深黃色，圓形，不透明，邊緣整齊，光滑濕潤；電鏡觀察該菌體的形態為稍短粗桿菌，大小為(0.6
1.2) UmX (1.6 2.4) iim，有鞭毛，細胞形態見圖3，生理和生化特征見表I。結合細菌的16S rDNA序列分析結果，最終確定HSQAYl為庫氏鹽芽孢桿菌屬細菌。表I 庫氏鹽芽抱桿菌 HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)的生理生化特征
權利要求
1.一種庫氏鹽芽抱桿菌株 HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAY1),于 2012 年6月12日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2012221。
2.權利要求1所述的庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl在降解赤潮暴發海區中的中肋骨條藻中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAY1(Halobacillus kuroshimensisHSQAY1)，于2012年6月12日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM2012221。還公開了該菌株在降解赤潮暴發海區中的中肋骨條藻中的應用；該菌株能使條鏈狀排列的中肋骨條藻細胞斷裂，而后膨脹成圓球形并最終破裂死亡。并且該菌株為土著細菌，在實際應用中不會造成二次污染或外種入侵等污染情況，有望在赤潮的生物治理實踐中發揮重要作用。
文檔編號C12N1/20GK103114050SQ20121043937
公開日2013年5月22日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年10月23日
發明者黃洪輝, 史榮君, 齊占會, 胡維安 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所