專利名稱：一種有機磷農藥降解酶突變體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體的說，涉及一種有機磷農藥降解酶突變體及其制備方法。
背景技術：
有機磷農藥(organophosphorus pesticides, OPs)是農業生產中使用最為廣泛的一大類農藥(Singh BK. 2009. Organophosphorus-degrading bacteria:ecology andindustrial applications. Nature Reviews Microbiology. 7:156-164)。自 1944 年德國拜耳公司首先發現有機磷具有殺蟲特性并制造出第一種殺蟲劑“1605-對硫磷”以來，有機磷作為一類高效、廣譜的殺蟲劑被廣泛應用，在很大程度上提高了農作物的產量。據統計，2010年我國農藥的總產量超過200萬噸(中華人民共和國國家統計局中國統計年鑒-2010。北京中國統計出版社，2011:14-221)，其中有機磷農藥產品占到其總量的80%。目前市場上有機磷農藥商品的種類達上百種之多，我國所廣泛使用的，包括毒死蜱、丙溴磷、乙酰甲胺磷、二嗪農和敵敵畏等殺蟲劑(巨修練，李常平2010。有機磷殺蟲劑的選擇性與安全性。農藥科學與管理。31:19-211)，稻瘟凈、克瘟凈等殺菌劑的種類就達到30多種。此外，在我國經常使用的其他有機磷產品還有有機磷滅鼠劑、有機磷除草劑、生長調節劑等(張嬋，廖曉蘭2010。有機磷農藥的微生物降解技術研究進展。廣西農業科學。41:1079-10821)。大部分有機磷農藥不溶于水(樂果、敵百蟲除外)，而易溶于有機溶劑，在中性和酸性條件下穩定，不易水解，在堿性條件下因水解而失效。有機憐農藥屬有機氣農藥的取代物，具有藥效聞，品種多，防治范圍廣，成本低，比有機氯農藥容易降解，對環境的污染及對生態系統的危害和殘留均未有機氯農藥普遍和突出等優點，為增加糧食生產、防治疾病傳播作出了巨大貢獻。但是，隨著農業的發展，有機磷農藥的使用量越來越大，大量有機磷農藥殘存于水和土壤中，不僅對地表農藥殘留量超標，造成食品污染，而且通過各種途徑和地下水資源造成污染。有機磷農藥是一種神經性毒物，在人體內長期蓄積滯留會引發慢性中毒，導致人體神經功能紊亂，發生出汗，遲鈍，神經失常和語言失常等癥狀。含有有機磷的農藥通過食物殘留等方式進入食物鏈，并在生物體中進行生物富積，從而造成致畸、致癌、致突變等危害，最終威脅到人類的生存與社會的可持續發展。因此，在日益重視環境保護能力的趨勢下，加強有機磷農藥降解方法的研究，解決有機磷農藥對環境及食物的污染問題，是人類當前迫切需要解決的問題之一。有機磷農藥污染降解技術可分為熱降解、光降解、化學降解和生物降解。生物降解是通過生物的作用將農藥分解為無毒或低毒小分子化合物，并最終降解為水、C02和礦物質的過程。相對于物理、化學降解技術，生物降解具有高效、徹底、無二次污染的優勢。作物本身、微生物都能夠降解有機磷農藥殘留，但植物的降解很緩慢，周期很長，微生物由于其強大的代謝多樣性，在有機磷農藥殘留降解中具有更大的優勢。現今，用微生物或微生物源酶制劑降解殘留農藥越來越受到重視，對微生物降解有機磷農藥的研究已成為環保的一大重要課題。有機磷農藥降解酶微生物對于農藥的降解可分為酶促和非酶促反應。所謂酶促反應是指微生物以胞內酶或分泌的胞外酶直接作用于農藥，經過一系列生理生化反應，最終將農藥完全降解或分解成分子量較小的無毒或毒性較小的化合物的過程。而非酶促形式指的是微生物通過代謝改變農藥的環境離子濃度、PH等物理、化學性質，從而間接促使降解農藥的過程。酶促反應是微生物降解農藥的主要形式。當有機磷農藥進入土壤后，微生物馬上能產生降解有機磷農藥的降解酶；另一種是微生物本身并無可降解該有機磷農藥的酶系，當農藥進入環境后，由于微生物生存的需要，微生物在適應環境的過程中基因發生重組或突變，產生新的降解酶系。有機磷農藥降解酶目前已被公認為是消除農藥殘留的最有潛力的新方法。常見的有機磷農藥降解酶主要是水解酶類，包括磷酸酶、對硫磷水解酶、酯酶、硫基酰胺酶、裂解酶等，它們主要通過裂解P-0，P-S, P-N等鍵，使有機磷農藥被降解，生成簡單無機化合物。由于各種有機磷農藥都有類似的結構，只是取代基不同，所以一種有機磷農藥降解酶往往可降解多種有機憐農藥(Theriot CM, Grunden AM. 2011. Hydrolysis of organophosphoruscompounds by microbialenzymes. Appl Microbiol Biotechnol.89，35-43)。最早發現有機磷農藥降解酶是在1973年前后。Sethunahan和Yoshida從土壤中分離出一株可以降解二嗪農和對硫磷的黃桿菌并發現其降解的原因是這些菌分泌一種水解憐酸酯鍵的酶，有機憐降解酶(Sethunahan N, Yoshida T. 1973. A Flavobacterium thatdegrades diazinon and parathion. Can. J. Microbiol. 19，873-875)。1974 年 Munnecke等從假單胞桿菌中檢測出磷酸酯酶的活性，發現其對對硫磷具有降解作用，同時對甲基對硫磷、二嗪農、毒死蜱等有機磷農藥均能有效降解，且該酶不為農藥及農藥制劑中溶劑所抑制(MunneckeD. M.，Hsieh P. D. 1974. Microbial decontamination of parathionandp-nitrophenoI in aqueous media. Applied Microbiol. 28:212-217)。20世紀80年代，Munnecke等發現有機磷農藥降解酶比產生這類酶的微生物菌體更能忍受異常環境條件，如來源于假單胞菌的降解酶在10%的無機鹽、1%的有機溶劑、50°C下都能保持高活性，而該酶的產生菌在同樣的條件下卻不能生長，而且，酶的降解效果遠遠勝于微生物本身，特別是對低濃度的農藥更有效。因此，人們的思路從應用微生物菌體凈化農藥污染轉向利用有機磷農藥降解酶。1980年，Brown等就對來源于黃桿菌的有機磷農藥降解酶進行了部分純化并對酶的性質進行了研究，發現酶反應的最適PH范圍為8-10 ;酶的活性不受金屬離子的影響，被非離子去污劑抑制(Brown KA. 1980. Phosphotriesterases ofFlavobacterium sp. SoilBiology and Biochemistry. 12:105-112)。1989 年,Dumas 等純化得到來源于假單胞菌的有機磷農藥降解酶，發現此酶是單體球蛋白，分子量為39kDa，有一個鋅離子，被巰基試劑競爭性抑制，金屬螯合劑、EDTA等可使其失活。除了對氧磷以外，此酶還可水解多種有機磷殺蟲劑如毒死蝶，對硫磷，蜆毒磷，二嗪農，甲基對硫磷等(Dumas, DP, Caldwell, SR, WildJR, RaushelFM. 1989. Purification and properties of the phosphotriesterasefromPseudomonas diminuta. J Biol Chem, 264, 19659-19665)。1996年，Vanhooke等對來源于黃桿菌的有機磷降解酶進行X光晶體衍射分析，發現此酶在自然條件下是二聚體，每個單體上含有2個鋅離子，構成酶催化反應所需要的雙金屬中心(Vanhooke, J. L. , Benning, Μ. Μ. , Raushel, F. Μ. andHolden, H.Μ. 1996. Three-dimensional structure of the zinc—containingphosphotriesterase with the bound substrate analog diethyI4~methylbenzyIphosphonate.Biochemistry, 35，6020-6025)。這些研究對有機磷農藥降解酶無論是在結構上還是在作用機理上都有了進一步的了解。我國近年來也在有機磷降解酶菌種篩選方面做了很多工作并取得了很大進展。楚曉娜等從假單胞菌中Pseudomonas sp. WBC—3中獲得了甲基對硫磷水解酶。動力學分析顯示該酶為非特異性有機磷降解酶，但最適底物為甲基對硫磷，對甲基對硫磷的耐受濃度在單純無機鹽培養基中可達800mg/L，在含有葡萄糖的培養基中可達2000mg/L (楚曉娜，張先恩，陳亞麗，劉虹，宋冬林。2003。假單胞菌WBC-23甲基對硫磷水解酶性質的初步研究。微生物學報，43:453— 456)。劉玉煥等從華麗曲霉菌中分離純化出有機磷農藥降解酶。此酶對有機磷農藥樂果具有較好的降解作用，該酶的最適反應溫度45° C，最適反應pH7. 2，對熱較穩定，并且能在pH 6-10范圍保持活性。重金屬Cu2+對該酶具有明顯的促進作用，而SDS對其具有抑制作用(劉玉煥和鐘英長。2000。華麗曲霉Z58有機磷農藥降解酶的純化和性質。微生物學報。40:430-434)。劉陽等對來源于米曲霉LY-128的有機磷農藥水解酶的性質進行了分析，底物的專一性實驗表明，該酶不僅可以作用于含P-O鍵的有機磷農藥；而且也能水解含P-S鍵的有機磷農藥。該酶的最適反應溫度為45°c，最適PH6. 8，在50°C以下及pH 6.0-9. 5范圍內活性穩定。Hg2+、Fe3+、碘乙酸和N-乙基馬來酰亞胺對該酶有強烈的抑制作用，而Cu2+、巰基試劑和去污劑對酶有不同程度的激活作用(劉陽，劉玉煥，陳志仕，廉婕，羅維佳，黃曉，鐘英長。2003。米曲霉LY-128廣譜有機磷農藥水解酶的純化和鑒定。菌物系統。22,557-564)。由此可看出，已純化和鑒定的幾種有機磷農藥水解酶在底物特異性、對化學物質的敏感性等方面存在明顯差異。伍寧豐等從農藥廠被污染的土壤中分離到一株降解有機磷農藥的高效菌株，假產堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)C2-1,并對其酶學性質進行了研究。其降解甲基對硫磷的最適溫度為65°C，最適pH為9，并且此酶具有很好的熱穩定性和pH穩定性，對大多數金屬離子和化學試劑不敏感。該酶氨基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列分析表明，此酶與目前發表的有機磷降解酶沒有同源性(伍寧豐，鄧敏捷，史秀云，梁果義，姚斌，范云六。2003。一種新的有機磷降解酶的分離純化及酶學性質研究。科學通報48，2446-2450)。同一實驗室其后還進一步做了大量的基因表達工作。為了使有機磷農藥降解酶在農業生產中得到更好地應用，其降解機理也受到人們很大的關注。這種作用方式其實主要是一系列的酶促水解反應。要使進入土壤中的有機磷農藥完全被分解為二氧化碳等簡單的無毒性的化合物，其整個過程如下首先農藥吸附于微生物表面，然后穿透細胞膜進入細胞膜內部，最后在膜內與微生物所產生的降解酶結合發生酶促反應，以達到降解農藥的目的。微生物直接作用于有機磷農藥常見的方式主要有氧化、脫氫、還原、水解、合成等反應類型。目前，微生物對有機磷農藥的代謝途徑研究比較清楚的是甲基對硫磷。微生物代謝甲基對硫磷，初始反應一般為水解反應，產物為二甲基硫代磷酸(dimethylthiophosphoricacid, DMTP)和對硝基苯酌'(P-Iiitrophenol, PNP), DMTP 為無毒化合物，PNP的毒性與其母體甲基對硫磷相比下降了 100倍，PNP通過產生4-硝基鄰苯二酌· (4-nitrocatechol, 4_NC)和 I, 2, 4-苯三酌· (I, 2, 4-benzenetriol)的途徑完全降解(柏文琴，李梅，邱星輝，何鳳琴，冷欣夫.。2004.。蒼白桿菌B2對甲基對硫磷降解途徑研究·農藥學學報.6 :48-54)。有機磷農藥降解酶在原始天然菌株中含量太低，難以大量生產，且生產成本高昂。應用有機磷農藥降解酶制劑就必須解決一個關鍵性的問題一如何工業化廉價生產有機磷農藥降解酶制劑。近年來隨著分子生物學及基因工程的發展，為有機磷降解酶制劑的基因工程大規模廉價生產奠定了基礎，人們試圖構建高效生物反應器來提高有機磷農藥降解酶的表達量。目前已從不同的微生物中分離到多種有機磷農藥降解基因并進行了基因表達。1985年Serdar等首次嘗試在大腸桿菌中表達有機磷農藥降解酶，表達產物雖具有生物學活性，但表達量還未到原始天然菌株的1/10 (Serdar CM and GibsonDT. 1985. Enzymatichydrolysis of organo—phosphates: cloning andexpression of a parathion hydrolasegene from Pseudomonas diminuta, Bio/Technol.3:567-571)。劉智等從降解菌Peudomonas putida克隆到一個甲基對硫磷水解酶基因，并將其轉化至大腸桿菌中。同時他還構建了能降解有機氯及有機磷和同時降解3種以上有機磷農藥的降解菌各I株，能同時高效降解甲基對硫磷和呋喃丹農藥的工程菌I株，在實驗室條件下降解性能顯著，酶活性提高6倍，獲得既有農藥降解能力又有生物防治功能的工程菌株(劉智，洪青，徐劍宏，武俊，張曉舟，張小華，馬愛芝，朱軍，李順鵬。2003。甲基對硫磷水解酶基因的克隆與融合表達。遺傳學報9:1020—1026)。傅國平等用PCR方法獲得甲基對硫磷水解酶編碼基因，構建了重組表達質粒pET29a-mpd，將其轉化至Escherichia coli BL21(DE3)中表達。該酶最適pH8. 6-8. 8，最佳反應溫度15。C ;Mn2+、Zn2+、Cu2+可使酶活性增力口 15% 20% (傅國平，崔中利，徐瑋，吳旭平，李順鵬。2004。甲基對硫磷水解酶的重組表達及其純化和性質研究。微生物學報。44:357-360)。Yang等利用pET表達系統，將甲基對硫磷水解酶(MPH)的mpd基因異源表達于大腸桿菌，其表達的酶比活性為1.4xl04U/mg蛋白。在50mM的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH8. 0)中的粗酶能夠降低約98%的噴霧在甘藍上的有機磷類農藥，解毒效率優于水，洗漆劑，和市售的酶產品(Yang J, Yang C，Jiang H, Qiao C. 2008. Overexpression of methylparathion hydrolase and its applicationin detoxification of organophosphates.Biodegradation. 19:831-9)。中國農科院生物技術研究所范云六院士、伍寧豐研究員從被有機磷農藥污染的土壤中篩選出能夠降解多種有機磷農藥的細菌，從中克隆出了有機磷降解酶的編碼基因(鄧敏捷，伍寧豐，梁果義，初曉宇，姚斌，范云六。2004。一種新的有機磷降解酶基因ophc2的克隆與表達。科學通報49:1068-1072)，并成功的利用“畢赤酵母”高效表達了有機磷降解酶，其表達量在在3升高密度發酵罐中為5. 5g/L (Chu XY1Wu NF, Deng MJ, TianJ, Yao B, Fan YL. 2006. Expressionof organophosphorus hydrolase 0PHC2 in Pichiapastoris:purification andcharacterization. Protein Expr Purif. 49:9-14)。該成果已在3t發酵罐的中試水平上確立了基因工程酵母菌生產有機磷降解酶的穩定的發酵工藝，其商品“比亞蔬菜瓜果農藥降解酶”生物制劑也已進入市場天然菌株中的有機磷農藥降解酶，大多對有機磷農藥的降解率較低或作用較慢，不能達到期望的效果，可以通過基因工程或蛋白質工程的辦法，改造降解酶的催化活性。有機磷農藥降解酶OPH的254和257位組氨酸殘基位于每個單體雙金屬活性位點的附近，這些殘基決定了活性位點與底物的相互作用。diSioudi等利用基因工程技術定點改造oph，產生的突變體H254R、H257L、H254R/H257L的每個活性位點只含有I個金屬離子，改變后的酶對內吸磷(P-S健)的水解作用提高了 2 30倍，而對二異丙基氟磷酸(P-F鍵)水解作用下降，H257L和H254R/H257L突變體對NPPMP (神經毒劑梭曼的類似物)水解能力分別提高了 11倍和18倍。這些結果表明，通過對H254和/或H257位點的定點修飾可以改變OPH對底物的專一性，這意味著對金屬含量要求的改變增加了酶分子結構的靈活性，使得大底物易進入到活性位點，同時降低對小底物的催化效率，從而改變了酶的催化特性(diSioudiB,Grimsley JK, Lai K, Wild JR. 1999.Modificationof near active site residues inorganophosphorus hydrolase reduces metalstoichiometry and alters substratespecificity.Biochemistry. 38:2866-2872).Rochu等2004年報道有機磷農藥降解酶活性中心的兩個鋅離子可由其他過渡金屬陽離子取代，而不喪失活性，但顯示不同的催化性能。高效酶突變體的先決條件是要求高的熱穩定性。通過對金屬陽離子鋅2+，鈷2+和Cd2+ —系列實驗，他們發現鋅2+胃獲得最高的酶穩定性，而鈷 2+可獲得最高酶活性(Rochu D, ViguieN, Renault F, Crouzier D, FromentMT, Masson P.2004. Contribution of theactive-site metal cation to the catalyticactivity and to theconformational stability of phosphotriesterase:temperature—andpH-dependence. Biochem J. 380:627-363)。尤其是Dong等于2005年確定了 Pseudomonas sp. WBC-3的甲基對硫磷水解酶為酶的基因改變奠定了基礎。該酶是一個鋅(II) 二聚體，每個亞基包含混合的雙核鋅中心。這兩種離子被配位體以八面體結構所包圍。離子之間距離為3. 5埃并由氨基酸殘基Hisl47, Hisl49, Aspl51, Hisl52, His234 和 His302 和一個水分子環繞。Asp255 和一個水分子作為鋅離子之間的橋梁。在催化中心的入口處存在著芳香族氨基酸Trpl79，Phel96和Phell9。這三個氨基酸由丙氨酸置換導致酶的K(m)顯著增加，但催化活性消失，表明這些芳香族氨基酸在酶對甲基對硫磷的親和性方面具有重要的作用(Dong YJ, Bartlam M, SunL, Zhou YF, ZhangZP, Zhang CG, Rao Z, Zhang XE. 2005. Crystal structure of methylparathionhydrolase from Pseudomonas sp. WBC-3. J Mol Biol.353:655-663)。Reeves等2008年報道通過位點定向誘變和生物物理分析，可以使有機磷水解酶(OPH)突變體在保持酶穩定性的同時，提高酶的催化能力(Reeves TE, WalesME, GrimsleyJK, Li P,Cerasoli DM, Wild JR. 2008. Balancing the stabilityand the catalyticspecificities of OP hydrolases with enhanced V-agentactivities. Protein Eng DesSel.21:405-12)。Su等2011年報道通過提高增加酶表面上的離子鍵，可以提高酶的熱穩定性。通過比較耒自假單胞菌C2-1的有機磷水解酶0PHC2(具高熱穩定性)和耒自蒼白桿菌屬甲基對硫磷水解酶(MPH 0CH)，對位于蛋白質表面上的兩個脯氨酸(Pro76和Pro78)進行了突變。雙位點突變(P76D/P78K)，在失活50%(T50)的溫度約為68° C，高于野生型酶(64° C)，P76D
7(67° C)，P78K (59° C)。結構分析顯示P76D/P78K被取代的殘基(Asp76和Lys78)可能產生了離子鍵并增加了靜電能量，然后增加了酶的穩定性(Su Y, Tian J, Wang P，Chu X，LiuG, Wu N, FanY. 2011. Improving the thermostability of a methyl parathion hydrolasebyadding the ionic bond on protein surface. Appl Biochem Biotechnol. 165:989-97)。Tian等2010年報道甘氨酸脯氨酸突變也可增加酶的熱穩定性。在蒼白桿菌屬M231的甲基對硫磷水解酶(MPH)，使用同源建模和分子動力學模擬，精心挑選適當的甘氨酸的突變位點，他們發現G194P具有較高的熱穩定性(Tian J, Wang P, Gao S，ChuX，Wu N, Fan Y.2010. Enhanced thermostability of methylparathion hydrolase fromOchrobactrum sp. M231 by rational engineeringof a glycine to proline mutation.FEBS J. 277:4901-4908)。同一研究組還發現假單胞菌C2_l中的0PHC2具有較高熱穩定性的原因可能是 C110-C146 二硫鍵構像(Chu XY, Tian J，Wu NF, Fan YL. 2010. Anintramolecular disulfidebond is required for the thermostability of methylparathion hydrolase, 0PHC2. Appl Microbiol Biotechnol.88:125-31X在已知的有機磷降解酶中，雖然其氨基酸序列，三維結構以及酶催化機理不同，但它們具有某些共同特性。所有這些酶是金屬依賴型的水解酶，含有疏水的活性中心，其活性中心擁有3個口袋狀空間，以結合有機磷農藥的3個磷酯鍵基團。隨著越來越多的有機磷降解酶晶體結構得到闡述，有機磷降解酶的活性中心和催化機理得到進一步了解。其中最重要而且研究得最多的是酯酶類中的磷酸三酯酶(phosphotriesterase, PTE)。此酶的晶體具有8次交替出現的α螺旋和β面片，也就是TIM-桶(TIM-Barrel)結構，由于多種不同耒源的酶晶體的報道，酶活性部位以及催化機制都較為清晰(Bigley AN, Raushel FM. 2012.Catalyticmechanisms for phosphotriesterases. Biochim. Biophy. Acta, doi:10:1016/j. bbapap. 2012. 04. 004)。相對于磷酸三酯酶PTH,甲基對硫磷水解酶(Methyl parathionhydrolase, MPH)所知的信息有限。含有此酶的多種細菌可以甲基對硫磷作為唯一的碳源和氮源。通過晶體結構分析，此酶是一個2聚體，每個單體為α β/β α結構，中央為β面片，周邊為三明治式的α螺旋，金屬離子位于中央的活性區，是一種典型的β_內酰胺酶結構。分子模擬研究預測有機磷農藥的解離基團與由氨基酸殘基F119，W179, F196組成的口袋相互作用；其它2個口袋位點分別由R72，L258, L273 ;和L65，L167組成。兩金屬位點中的α位點與H152，H302，D151 連接，β 位點與 Η147, Η149, Η234 連接(Dong YJ, Bartlam M, Sun L, ZhouYF, Zhang ZP,Zhang CG, Rao Z, Zhang XE. 2005. Crystal structure of methylparathionhydrolase from Pseudomonas sp. WBC-3. J Mol Biol. 353:655-663)。最近 Huang 等報道使用分子動力學模擬，通過選擇性地改變堿性氨基酸酸性，甲基對硫磷水解酶(OCHR-MPH)的酸性穩定性得到改善。三個突變體(K208E，K277D，和K208E/K277D)比野生型更穩定。他們的酶半衰期在pH值5. O時分別為64，68，65分鐘，而野生型為39分鐘(Huang L, WangP, Tian J, Jiang H, Wu N, YangP, Yao B, Fan Y. 2012. Improving the acidic stabilityof a methyl parathionhydrolase by changing basic residues to acidic residues.BiotechnolLett. 34:1115-1121)。但綜觀PMH酶研究現狀，不僅沒有此酶催化機理方面的報道，而且對酶動力學也所知甚少(Bigley AN, Raushel FM. 2012. Catalytic mechanisms forphosphotriesterases.Biochim. Biophy. Acta, doi : 10:1016/j. bbapap. 2012. 04. 004)。綜上所述，各種降解酶的酶學性質、底物范圍等方面存在差異，但通過分子進化和定向突變，完全可以獲得具有特殊性能(例如更高酶活性，更佳的酶耐受性等)的酶(Khare SD, Kipnis Y, Greisen PJr, Takeuchi R, AshaniY, Goldsmith M, Song Y, Gallaher JL, Silman I, Leader H, SussmanJL, Stoddard BL, Tawfik DS,Baker D. 2012. Computational redesign of amononuclearzinc metalloenzyme for organophosphate hydrolysis. Nat ChemBiol. 8:294-300)。
發明內容
針對上述問題，本發明提供了一種具有更優良酶活性的有機磷農藥降解酶突變體及其制備方法。通過分析降解酶的活性中心，獲得多個酶的突變體，結果發現突變體M164F和L116M，尤其是M164F具有更優良的酶活性。本發明還提供了一種經畢赤酵母密碼子優化后的降解酶突變體基因序列及利用酵母表達該基因的方法，其制備方法簡單，由于使用畢赤酵母優化后的密碼子，產量更高。獲得有機磷農藥降解酶可以應用在水果，蔬菜，茶葉等農產品農藥殘留處理等領域，具有廣泛的應用前景，經濟意義和社會意義。有機磷農藥降解酶蛋白具有300個氨基酸殘基，其基因序列和氨基酸序列分別如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。發明人通過比較并分析其它有機磷農藥降解酶包括甲基對硫磷水解酶，選取可能位于酶活性中心或者附近的氨基酸殘基進行突變，意外發現在確定活性中心的基礎上，當對以下兩個氨基酸殘基進行點突變(L116或M164)時，所獲的有機磷農藥降解酶突變體比未突變的酶蛋白的生物學活性至少要增強10%以上。因此，本發明的一個目的是提供一種有機磷農藥降解酶突變體，其對有機磷農藥降解酶164位的蛋氨酸(M)或第116位的亮氨酸(L)進行突變，所述突變體具有如Seq IDNo. 8或Seq ID No. 13所述的氨基酸序列。其中所述Seq ID No. 8中第164個氨基酸X1為苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或異亮氨酸(I)，優選為苯丙氨酸。當X1為苯丙氨酸時，所述的有機磷農藥降解酶突變體具有如Seq ID No. 6所述的氨基酸序列。其中所述Seq ID No. 13中第116個氨基酸X1為蛋氨酸(M)、，異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)，優選為蛋氨酸。當X1為蛋氨酸時，所述的有機磷農藥降解酶突變體具有如Seq ID No. 11所述的氨基酸序列。本發明還提供了編碼上述有機磷農藥降解酶突變體蛋白的基因序列，所述的基因序列具有如Seq ID No. 12或Seq ID No. 7所述的核苷酸序列。所述序列Seq IDNo. 12中第346-348位的核苷酸N1N2N3為分別編碼蛋氨酸(M)、，異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)的密碼子。當編碼蛋氨酸時，所述的突變體基因具有如Seq ID No. 10所述的核苷酸序列。所述序列Seq ID No. 7中第490-492位的核苷酸N1N2N3為分別編碼苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或異亮氨酸(I)的密碼子。當編碼苯丙氨酸時，所述的突變體基因具有如Seq IDNo. 5所述的核苷酸序列。本發明還提供了一種制備有機磷農藥降解酶突變體蛋白的方法，所述方法包括如下步驟(I)在有機磷農藥降解酶突變體基因的兩端引入限制性酶切位點，通過酶切操作連接到酵母表達載體上，(2)將表達載體轉化導入酵母菌中，經篩選得到重組基因工程菌；
9
(3)高密度發酵重組酵母菌，誘導表達后離心收集發酵上清液，經分離純化獲得重組有機磷農藥降解酶突變體蛋白。上述方法步驟(I)中，可根據全球公共序列數據庫GeneBank記載序列號為AJ605330. I的有機磷農藥降解酶的核苷酸序列為模板，分別在成熟有機磷農藥降解酶兩端引入限制性酶切位點，優選在前端加入限制性內切酶Xh0 I的酶切位點，后端加入限制性內切酶Xba I的酶切位點，并在限制性內切酶Xba I的酶切位點前端連續加入兩個終止密碼子。Xho I所導致的兩個氨基酸(LE)和引入的兩個堿性氨基酸(KR)密碼子屬于畢赤酵母α信號肽，也是畢赤酵母內在酶切位點。按照畢赤酵母的密碼子偏好性改變核苷酸序列，將設計好的有機磷農藥降解酶cDNA序列(SEQ ID No. I)進行化學合成。此DNA序列在畢赤酵母表達時最前面編碼的4個氨基酸屬于信號肽而被酶切除去，最后得到有機磷農藥降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。如前所述，有機磷農藥降解酶突變體基因的操作與此基本類似。上述化學合成的有機磷農藥降解酶基因可用本領域公知的方法克隆到各種表達載體中去。所用標準的分子克隆過程見J.薩姆布魯克等(J薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1995.)的敘述。許多表達載體和其對應的宿主可以從公司購得，如酵母表達載體 pPICZ- a -A, pHIL_D2, pPIC9, pHIL-Sl (Invitrogen Corp. San Diego.California. USA),動物細胞表達載體 pSVK3、pMSG (Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。優選的方法是將編碼本發明中的目標蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表達載體pPICZ-α -A，該質粒為酵母整合型質粒，帶有醇氧化酶操縱子(AOXl) 5’序列和3’序列，用于方便編碼基因整合至酵母染色體，和控制編碼基因的表達。這些質粒及對應的宿主菌等可以從 Invitrogen Corp. San Diego. California. USA 構得，優選的啟動子為 AOXl。在一個優選的實施例中，對有機磷農藥降解酶基因和酵母表達載體pPICZ-a -A進行雙酶切，優選用限制性內切酶Xho I和限制性內切酶Xba I分別對有機磷農藥降解酶基因和酵母表達載體pPICZ-a-A進行雙酶切，將酶切后的有機磷農藥降解酶基因與酵母表達載體pPICZ-a-A進行連接，將連接后的產物轉入大腸桿菌DH5a內。選取重組菌落pPICZ a A-OP,提取質粒經過雙酶切證實并進行序列測定，經確認無誤后，繼續下面突變工作。通過比較并分析其它有機磷農藥降解酶包括甲基對硫磷水解酶，選取可能位于酶活性中心或者附近的氨基酸殘基進行突變，尤其是以下兩個氨基酸殘基進行點突變L116或M164，更優選的是進行如下的點突變L116M或M164F。點突變可通過本領域常用的基因定點突變技術進行，優選按照碧云天生物技術研究所的《基因定點突變試劑盒》，對這些突變位點合成引物。此試劑盒的原理是只需通過基于PCR的突變質粒的合成，和基于Dpn I的模板質粒的消化，轉化培養以及后續的酶切或測序鑒定，即可得到預期的突變質粒。使用此試劑盒時需要先設計長度通常為30個堿基以上的互補的兩個引物，在引物中含有預期的突變位點。然后以待突變的質粒為模板，用這兩個引物進行PCR擴增反應。這樣可以產生含有預期的突變位點的雙鏈質粒，但這個雙鏈質粒中有兩個裂口(nick)位點。待突變的質粒通常耒源于大腸桿菌等細菌，在細菌中會被甲基化修飾，而在體外通過PCR擴增得到的質粒不會被甲基化。這樣用甲基化酶Dpn I處理，可以消化掉待突變的質粒模板，而使通過PCR擴增出來的含有突變位點的質粒被選擇性地保留下來。把Dpn I處
10理過的產物轉化細菌后，質粒中有兩個裂口(nick)位點可以被大腸桿菌修復，得到的克隆就會含有預期的突變質粒。按照試劑盒要求，合成以下所需的引物
I、L116M
I.pL116M_F 5cacggtcttgctgactcatATGcaccctgatcatgcatgc 3’ ；
2.pL116M_R 5gcatgcatgatcagggtgCATatgagtcagcaagaccgtg 3’ ；
II.、M164F
3.pM164F_F :5ccagaaggaatgcaaggaTTCttcaaaatggctcaacaggc 3，；
4.pM164F_R :5gcctgttgagccattttgaaGAAtccttgcattccttctgg 3’ ；
以前述制備得到的含有有機磷農藥降解酶基因的質粒為模版，進行常規的基因定
點突變PCR反應。PCR反應后，直接在PCR反應體系中加入Dpn I孵育，DpnI消化完畢后可以直接用于轉化，或者_20°C保存備用。根據所使用的感受態細菌，加入盡量多的經過Dpn I消化后的突變產物用于轉化。通常每100微升感受態細菌中可以加入5-10微升經過Dpn I消化后的突變產物。按照所使用的感受態細菌的操作方法進行操作，在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉化后的細菌，全部涂布到含有適當抗生素的平板上，培養過夜。對于得到的克隆，可以先提取少量質粒酶切鑒定，以確認得到的質粒的大小和質粒中插入片斷的大小與預期結果是否相符。取3-5個酶切鑒定正確的克隆去測序，以最終確認得到的克隆是符合預期序列的突變克隆。載體可經轉化或轉染至原核生物或真核生物宿主。轉化所需核酸至宿主細胞中去可用通常的方法，如電穿孔，制備感受態的原生質球等。成功轉化的細胞，即含有本發明DNA構建體的細胞，可通過人們熟知的技術加以鑒定，如細胞經收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鑒定。表達目標蛋白的宿主可以是酵母、哺乳動物細胞、細菌、動物、植物等，優選為酵母菌，如釀酒酵母、畢赤酵母、念珠菌屬酵母、漢遜酵母、克魯維亞酵母、孢圓母屬酵母或裂殖酵母等，更優選為畢赤酵母。目標蛋白或多肽可以存在于宿主細胞內，也可以是從宿主中分泌出來，優選的，是從宿主中分泌出來。分泌所用的信號肽，優選的是酵母MFa信號肽。編碼目標蛋白的核酸，可以插入至宿主染色體，或以游離質粒形式存在。可以通過培養含有本發明DNA構建體的宿主，如重組酵母、重組哺乳動物細胞、重組細菌、轉基因動植物等，生產本發明的有機磷農藥降解酶突變體。具體的培養方法，可以用搖瓶或生物反應器等，生產時優選的為生物反應器。培養基應能提供菌體(或細胞)生長和產物表達所需的物質,應包含氮源、碳源、pH緩沖成分等，培養基配方一般應根據不同培養對象，通過試驗獲得。培養可分兩個階段，第一階段主要用于菌體(或細胞)的生長，第二階段主要用于誘導表達目標產物。將構建完成的基因工程菌進行液體培養和發酵，通過甲醇誘導。將經甲醇誘導后的培養液離心，收集上清液。可以用各種蛋白分離的方法分離純化蛋白，如鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術及這些技術的組合。其中液相層析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術。在一個優選的實施例中，通過加入70%飽和度的硫酸銨，4° C，I小時后離心沉淀，使用ImM Tris-HCl (pH8. O)緩沖液透析。純化后的重組酶經SDS-PAGE電泳分析為均一條帶，純度超過95%。以牛血清白蛋白為標準，計算有機磷農藥降解酶，兩突變體的的含量均超過6.5克/升，高于Chu等報道的5. 5g/L產量(Chu XY,ffu NF, Deng MJ, TianJ, Yao B, Fan YL. 2006. Expression of organophosphorushydrolase 0PHC2 in Pichiapastoris!purification andcharacterization.Protein Expr Purif. 49:9-14)。對表達產物有機磷農藥降解酶OP及其突變體進行聚丙烯酰胺電泳檢測，在凝膠成像系統中確認上樣液中含有表達產物農藥降解酶OP以及突變體，其檢測分子量與理論值一致，約為32. 4kDa。通過使用甲基對硫磷作底物測試重組降解酶活性，結果顯示與野生型有機磷降解酶OP相比，突變體M164F的酶比活提高23. 6%，L116M的酶比活提高了 13. 2%。為了了解突變酶對其它有機磷農藥的降解活性，使用液相識譜方法，對三唑磷、對氧磷、毒死稗進行了測試，結果證明突變體M164F的酶比活提高>20%，L116M的酶比活>10%。M164和LI 16其他突變體與野生型有機磷降解酶OP相比，其酶比活性均有一定程度的增加。例如M164W，M164I的酶比活性與野生型有機磷降解酶OP相比超過8% ；L116其他突變體例如L116I，L116F，L116Y，與野生型有機磷降解酶OP相比超過5%。
圖I有機磷農藥降解酶和突變體表達質粒的構建過程。圖2重組有機磷農藥降解酶突變體M164F的SDS-PAGE凝膠電泳圖。圖中標號樣品槽I為蛋白分子量標準品(kDa)，自上而下依次為71，55，35，26 ;樣品槽2，酵母經甲醇誘導后的2ul培養液(第O天)；樣品槽3，4和5 :酵母經甲醇誘導后的2ul培養液(第3，4和5天)。
具體實施例方式實施例I、有機磷農藥降解酶突變體M164F的制備方法I、密碼子優化后的有機磷農藥降解酶基因OP的設計和合成根據全球公共序列數據庫GeneBank記載序列號為AJ605330. I的有機磷農藥降解酶的核苷酸序列為模板，分別在成熟有機磷農藥降解酶前端加入限制性內切酶Xho I的酶切位點，后端加入限制性內切酶Xba I的酶切位點，并在限制性內切酶Xba I的酶切位點前端連續加入兩個終止密碼子。Xho I所導致的兩個氨基酸(LE)和引入的兩個堿性氨基酸(KR)密碼子屬于畢赤酵母α信號肽，也是畢赤酵母內在酶切位點。按照畢赤酵母的密碼子偏好性改變核苷酸序列，將設計好的有機磷農藥降解酶cDNA序列(SEQ ID No. I)進行化學合成。此DNA序列在畢赤酵母表達時最前面編碼的4個氨基酸屬于信號肽而被酶切除去，最后得到有機磷農藥降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。2、重組質粒構建有機磷農藥降解酶以及突變體基因的重組質粒構建如圖I所示。(I)將化學合成的有機磷農藥降解酶基因OP用Xho I和Xba I進行雙酶切將含有OP基因的質粒pUC57-0P (上海生物工程有限公司)進行雙酶切20ug質粒DNA，20ul IOX酶切緩沖液，5ul Xho I和5ul Xba I，加水至總體積200ul，37° C，6小時。
(2)將載體質粒pPICZ a A用Xho I, Xba I進行雙酶切將pPICZ a A 進行雙酶切20ug 質粒 pPICZ a A (Invitrogen 公司)，20ul IOX 酶切緩沖液，5ul Xho I和5ul Xba I，加水至總體積200ul，37° C，6小時。3.用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的有機磷農藥降解酶基因和載體質粒進行回收、純化稱取O. 5克瓊脂糖粉末加到含有50毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入5μ I的溴化乙錠溶液，混合均勻，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現一排點樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點樣孔中分別加入10 μ I的酶切混合物和2 μ IDNA分子量標準品，打開電脈儀開關，在電泳儀電壓為100伏特時開始電泳。取I. 5ml離心管并稱其重量，在全自動紫外與可見分析儀將所需的目的DNA條帶，從凝膠上切下，稱取I. 5ml離心管總量并計算出從凝膠上切下來的凝膠重量。按照“DNA凝膠回收試劑盒”方法(上海生物工程有限公司)，回收有機磷農藥降解酶基因OP和載體質粒DNA。4.有機磷農藥降解酶基因和載體質粒DNA片段的體外連接將有機磷農藥降解酶基因和載體質粒DNA片段按4:1摩爾數比混合，加入1μ I Τ4DNA連接酶，在IX Τ4 DNA連接酶緩沖液中，16° C保育過夜，待作轉化。5.大腸桿菌DH5a感受態細胞的制備在7ml試管中加入3ml LB液體培養基和一個大腸桿菌DH5 α單菌落，混合均勻，在搖床(轉速為180轉/分鐘，370C )培養過夜。第二天，在250ml三角瓶中將O. 5ml培養過夜的菌液加入到50ml LB液體培養基，在同樣條件下培養大約3小時。檢測菌液體的0D600值，待菌液的0D600=0. 4時，將含有菌液體的三角瓶置于0° C冰水混合物中，放置20分鐘，備用。將25ml菌液加入到50ml離心管中，離心5分鐘(4000轉/分鐘，4°C )，棄去上清液，加入IOml冰冷的CaCl2溶液(50mM)，混合均勻，4° C保育30分鐘。半小時后，離心(4000轉/分鐘，4° C)，去掉上清液，加入新鮮的IOml冰冷的CaCl2溶液(50mM)。經過第3次離心后，感受態細菌液最終溶解在2ml冰冷的CaCl2溶液(50mM)。放置過夜后待用。6.大腸桿菌DH5a感受態細胞的轉化在I. 5ml離心管中加入100 μ I大腸桿菌DH5 α感受態細胞和8 μ I質粒連接混合物，混合均勻，將I. 5ml離心管置于冰水混合物中，放置20分鐘,后取出將I. 5ml離心管置于42° C的水浴鍋內，放置90秒，取出，再將I. 5ml離心管置于冰水混合物中，放置5分鐘后。加入Iml LB液體培養基，混合均勻，37° C搖床溫育I小時，3000轉/分離心5分鐘后，棄去上清液，將管底的菌體涂布于含25 μ g/ml博萊霉素的LB固體培養基上，放置20分鐘，后置于37° C條件下，培養16小時，形成菌落。7.重組質粒的篩選和鑒定選取含有質粒pPICZ a A-OP的重組菌落，用上海生物工程有限公司的UNIQ-10柱式質粒抽提試劑盒提取質粒。重組質粒經過雙酶切證實后，再送至上海生工生物技術有限公司序列測定，經確認后，繼續下面突變工作。8.有機磷農藥降解酶突變體M164F基因的設計和制備
分析比較多種有機磷農藥水解酶，選取比較保守并可能屬于酶活性中心或者附近的氨基酸殘基，將第164的蛋氨酸改變為苯丙氨酸，即M164F。按照碧云天生物技術研究所 《基因定點突變試劑盒》的要求，對這些突變位點合成以下所需的引物。5’端引物5’ ccag aaggaatgcaaggaTTCttcaaaatggctcaacaggc 3，；3，■弓L :5，gcctgttgagccattttgaaGAAtc cttgcattccttctgg 3’。突變后所產生的基因序列如SEQ ID No. 5所示,而所產生的重組酶氨基酸序列如SEQ ID No. 6。
(I)基因定點突變反應
去核酸酶水37ul
反應緩沖液(IOX) 5uI
引物(10μ M each) 2ul
dNTP 混合物(2. 5mM each) 4ul
待突變模板質粒(0. 5ug) Iul
總體積49ul
(2)按照上面的順序依次加入各種試劑，使總體積為49微升。混勻后，加入Iul Pfu DNA聚合酶混勻。
按照如下參數設置PCR儀步驟1(最初變性):循環為1，溫度95° C，時間40秒； 步驟2 (擴增)循環為18，溫度95° C，40秒，變性；60° C I分鐘退火；68° C I. 5分鐘/ kb延伸；步驟3 (延伸和補全)循環為1，溫度95° C，時間40秒；72° C 10分鐘；步驟4 (暫時存放)循環為1，溫度4° C長時間保持。
(3) Dpn I消化PCR反應后，直接在PCR反應體系中加入I微升Dpn I,混勻后 37° C孵育I小時。Dpn I消化完畢后可以直接用于轉化，或者_20°C保存備用。
(4)轉化，挑克隆鑒定根據所使用的感受態細菌，加入盡量多的經過Dpn I消化后的突變產物用于轉化。通常每100微升感受態細菌中可以加入5-10微升經過Dpn I消化后的突變產物。按照所使用的感受態細菌的操作方法進行操作，在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉化后的細菌，全部涂布到含有適當抗生素的平板上，培養過夜。對于得到的克隆，可以先提取少量質粒酶切鑒定，以確認得到的質粒的大小和質粒中插入片斷的大小與預期結果是否相符。取3個酶切鑒定正確的克隆去測序，最終確認全部3個克隆都是預期的突變克隆，選取PPICZ a A-M164F作進一步工作。
9、畢赤酵母基因工程菌構建
(I)重組質粒的線性化
在I. 5ml離心管中加入50 μ g重組質粒pPICZ a A-M164F、10 μ I限制性酶切酶Sac Ι、20 μ I的IOX限制性酶切酶Sac I緩沖液和170 μ I去離子水，混合均勻，置于37°C水浴鍋內，放置4小時。加入12 μ I 5Μ NaCl，再加入636 μ I 95%乙醇，-20° C放置15min，離心5min (12000rpm)。用1200 μ I 75%乙醇洗滌3次，室溫晾干后，溶解在20 μ I的無菌水-20°C保存，待電轉化。
(2)酵母菌X-33感受態細胞的制備
在YPDS固體培養基(1%酵母浸出+2%胰蛋白胨+2%右旋葡萄糖+IM山梨醇+2%瓊脂)上，接種畢赤酵母X-33 (Invitrogen公司)，置于30° C條件下培養72小時，觀察到白色單個菌落。在IOml離心管中加入3ml的YPDS液體培養基和一個巴斯德畢赤酵母X_33菌的單菌落，混合均勻，30° C條件下培養12小時。在250ml三角瓶中加入O. 5ml菌液和50ml YPDS液體培養基，30。C條件下培養3小時，檢測菌的0D600值。待0D600=1. 5時，在50ml離心管中加入45ml菌液,4。C離心(2500rpm,5分鐘),棄上清液,加入45ml去離子水，離心(1500rpm, 5分鐘)，再次用去離子水清洗(共三次)。將菌體溶解在IOml 0° C的D-山梨醇(1M)，4° C離心(1500rpm，5分鐘)。最后制得的感受態細胞溶解在IM的D-山梨醇(0D600=1)，備用。(3)酵母陽性重組子的備制及篩選在4ml離心管中加入10 μ g線性化的載體質粒和100 μ I的畢赤酵母Χ-33菌感受態細胞(0D600=1)，混合均勻。載體質粒含有機磷農藥降解酶基因突變體M164F。在0° C條件下，將電擊杯放于濃度為70%的乙醇中，浸泡30分鐘后，取出，在電擊杯內放入105 μ I混合液，將電擊杯放置5分鐘，后將電擊杯放到電轉化儀內，進行電擊，電脈沖為25微法，電壓為I. 4千伏，電阻為200歐姆，電擊時間為O. 05秒。電擊結束后,取出含有混合液的電擊杯，后在電擊杯內加入Iml D-山梨醇(IM)，將混合物加到I. 5ml離心管中，30° C搖床中，轉速為225rpm，培養I小時后，取100 μ I培養后的混合物，并將其涂布于含有濃度為25 μ g/mlZeocin的YPDS固體培養基上，將涂布后的YPDS固體培養基置于30° C培養箱內，培養4天，得到白色單菌落。將以上得到的全部白色單菌落接種到含500 μ g/ml博萊霉素的YPDS固體培養基上，置于30° C培養箱內，培養3天，觀察到單個菌落，即得到的陽性重組子。10、陽性酵母重組子的誘導表達(I)搖瓶誘導培養將表達的有機磷農藥降解酶突變體M164F的酵母菌，接種到IOOml錐形瓶中的20ml BMGY液體培養基(1%酵母浸出物,2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀PH6. O, I. 34%YNB 4X 10、生物素，1%甘油)，將菌液置于30° C條件下，搖床培養(200轉/分鐘)至0D600=5時，取8ml菌液離心(4000rpm，3分鐘)，將菌體轉移到IOOml錐形瓶中的20ml BMMY培養基(1%酵母浸出物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀pH6. O, I. 34%YNB 4X 1(Γ5%生物素，O. 5%甲醇),30。C繼續培養120小時，在培養過程中每隔12小時添加O. Iml濃度為100%的無水甲醇。培養結束后，取20ml菌液，離心10分鐘(12000rpm)，得到上清液，即為表達的有機磷農藥降解酶突變體M164F。(2)發酵罐誘導培養將菌種接種至IOml YPD培養液(1%酵母浸出+2%胰蛋白胨+2%右旋葡萄糖)，30° C，240rpm,培養過夜，將將其轉入含有新鮮YPD培養液(200ml)，同樣條件培養過夜。培養液然后轉至含有2升基礎無機鹽培養基的3升發酵罐中繼續培養。基礎無機鹽培養基85%磷酸26. 7ml/L，硫酸鈣O. 93g/L，硫酸鉀18. 2g/L，七水硫酸鎂14. 9g/L，氫氧化鉀4. 13g/L，葡萄糖50g/L和4. 4ml/L的稀有金屬培養基PTMl。PTMl由以下成分組成五水硫酸銅6. Og/L,碘化鈉O. 08g/L, 一水硫酸錳3. Og/L, 二水鑰酸鈉O. 2g/L，硼酸O. 02g/L,氯化鈷O. 5g/L，氯化鋅20g/L，七水硫酸亞鐵65. Og/L,生物素O. 2g/L，硫酸5. 0ml/L。將發酵罐pH設置為5.0，溶氧量>20%，溫度為30° C，750rpm。待葡萄糖消耗完畢，以每小時每升36ml加入含有I. 2%PTM1的25%葡萄糖溶液，持續6小時，進行葡萄糖培養以增加菌體量。待葡萄糖消耗完畢，進入甲醇誘導培養。首先進行甲醇適應階段，以每小時每升加入含有11. 1%甲醇和12ml/L PTMl的葡萄糖，持續4小時。之后以每小時每升3ml加入含有12ml/L PTMl的甲醇進行誘導培養直至發酵結束。
11、重組有機磷農藥降解酶和突變體的分離和純化。
將經甲醇誘導后的培養液，離心(IOOOOrpm, 4° C，10分鐘)，收集上清液，加入70% 飽和度的硫酸銨，4° C，I小時后離心沉淀，使用ImM Tris-HCl (pH8. O)緩沖液透析。純化后的重組酶經SDS-PAGE電泳分析為均一條帶，純度超過95%。以牛血清白蛋白為標準，計算有機磷農藥降解酶突變體M164F的含量達6. 8克/升，高于Chu等報道的5. 5g/L產量 (Chu XY, Wu NF, Deng MJ, Tian J, Yao B, FanYL. 2006. Expression of organophosphorus hydrolase OPHC2 in Pichiapastoris!purification and characterization. Protein Expr Purif. 49:9-14)。
12、對表達產物有機磷農藥降解酶突變體M164L進行聚丙烯酰胺電泳檢測
(I)凝膠的配制
取一個干凈50ml離心管，按以下成份加入，充分混合
分離膠濃度12% :6. 5ml去離子水，4. 5ml 40%丙烯酰胺混合液，3. 9ml I. 5MTris-HCl ρΗ8· 8,150 μ I 10%十二烷基磺酸鈉，9 μ I TEMED,最后加入 150 μ I 10%過硫酸銨
積層膠濃度5% 2. 96ml去離子水,0. 5ml 40%丙烯酰胺混合液,0. 5ml I. 5M Tris-HCl ρΗ6· 8，40 μ I 10%十二烷基磺酸鈉，4 μ I TEMED,最后加入40 μ 110%過硫酸銨·
(2)聚丙烯酰胺電泳檢測
I)考馬斯亮蘭染色液配制
取IOOmg考馬斯亮蘭、加入95%乙醇50ml和IOOml乙酸，混合均勻，用去離子水稀釋至1000ml中，過濾，得到考馬斯亮蘭染液。
2)取4%的十二烷基磺酸鈉、12%的甘油、50mM Tris-HCl,2%的疏基乙醇和0. 05% 的溴酚藍，混合均勻，用鹽酸將其pH值調至6. 8，形成樣品緩沖液，備用；
3)取6ul的樣品緩沖液和2ul的表達產物有機磷農藥降解酶OP或其突變體，混合均勻
4)在凝膠的點樣孔中分別加入5μ I的上樣液和5μ I蛋白分子量標準品，打開電脈儀開關，在電泳儀電壓為100伏特時開始電泳，電泳3小時后關閉電泳儀，后通過考馬斯亮蘭染液染色30分鐘、脫色液脫色，在凝膠成像系統中確認上樣液中含有表達產物農藥降解酶突變體，其檢測分子量為34kDa，與理論值一致。
13、有機磷農藥降解酶突變體M164F活性檢測
(I)使用甲基對硫磷作底物測試重組降解酶活性。
I)用甲醇配制2ml甲基對硫磷(10mg/ml)
2)配制IOml甲基對硫磷降解反應液-J. 5ml去離子水+0. 5ml IMTris-HCl (pH8. 0) 緩沖液+Iml 甲醇+0. IM ZnCl2 (IOul) +10mg/ml 甲基對硫憐(50ul)。
3)實驗步驟
取各重組有機磷降解酶和突變體10ul，加入到990ul去離子水，配制成10_2酶液； 再取IOOul I(T2酶液加入到900ul去離子水，配制成I(T3酶液。在I. 5ml離心管加入900ul 甲基對硫磷降解反應液和10_3酶液(IOOul )，混勻后加入轉移到分光光度計中在412nm波長下，測量光密度。用I. 5ml離心管加入900ul甲基對硫磷降解反應液和IOOul去離子水作為對照。結果顯示與野生型有機磷降解酶OP相比，突變體M164F的酶比活提高23. 6%((ρ〈0· 05)。(2)使用液相識譜方法，對三唑磷、對氧磷、毒死稗進行了測試，結果表面突變體M164F的酶比活與野生型有機磷農藥降解酶比較均超過>20%(ρ〈0. 05)。實施例2有機磷農藥降解酶突變體L116M的制備方法I、密碼子優化后的有機磷農藥降解酶基因OP的設計和合成根據全球公共序列數據庫GeneBank記載序列號為AJ605330. I的有機磷農藥降解酶的核苷酸序列為模板，分別在成熟有機磷農藥降解酶前端加入限制性內切酶Xho I的酶切位點，后端加入限制性內切酶Xba I的酶切位點，并在限制性內切酶Xba I的酶切位點前端連續加入兩個終止密碼子。Xho I所導致的兩個氨基酸(LE)和引入的兩個堿性氨基酸(KR)密碼子屬于畢赤酵母α信號肽，也是畢赤酵母內在酶切位點。按照畢赤酵母的密碼子偏好性改變核苷酸序列，將設計好的有機磷農藥降解酶cDNA序列(SEQ ID No. I)進行化學合成。此DNA序列在畢赤酵母表達時最前面編碼的4個氨基酸屬于信號肽而被酶切除去，最后得到有機磷農藥降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。2、重組質粒構建有機磷農藥降解酶以及突變體基因的重組質粒構建如圖I所示。(I)將化學合成的有機磷農藥降解酶基因OP用Xho I和Xba I進行雙酶切將含有OP基因的質粒pUC57-0P (上海生物工程有限公司)進行雙酶切20ug質粒DNA，20ul IOX酶切緩沖液，5ul Xho I和5ul Xba I，加水至總體積200ul，37。C，6小時。(2)將載體質粒pPICZ a A用Xho I, Xba I進行雙酶切將pPICZa A進行雙酶切20ug質粒pPICZaA，20ul IOX酶切緩沖液，5ul XhoI和5ul Xba I，加水至總體積200ul，37° C，6小時。3.用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的有機磷農藥降解酶基因和載體質粒進行回收、純化稱取O. 5克瓊脂糖粉末加到含有50毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入5μ I的溴化乙錠溶液，混合均勻，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現一排點樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點樣孔中分別加入10 μ I的酶切混合物和2 μ IDNA分子量標準品，打開電脈儀開關，在電泳儀電壓為100伏特時開始電泳。取1.5ml離心管并稱其重量，在全自動紫外與可見分析儀將所需的目的DNA條帶，從凝膠上切下，稱取I. 5ml離心管總量并計算出從凝膠上切下來的凝膠重量。按照“DNA凝膠回收試劑盒”方法(上海生物工程有限公司)，回收有機磷農藥降解酶基因OP和載體質粒DNA。4.有機磷農藥降解酶基因和載體質粒DNA片段的體外連接將有機磷農藥降解酶基因和載體質粒DNA片段按4:1摩爾數比混合，加入I μ IT4DNA連接酶，在IX Τ4 DNA連接酶緩沖液中，16° C保育過夜，待作轉化。5.大腸桿菌DH5a感受態細胞的制備在7ml試管中加入3ml LB液體培養基和一個大腸桿菌DH5 α單菌落，混合均勻，在搖床(轉速為180轉/分鐘，37° C)培養過夜。第二天，在250ml三角瓶中將0.5ml培養過夜的菌液加入到50ml LB液體培養基，在同樣條件下培養大約3小時。檢測菌液體的 0D600值，待菌液的0D600=0. 4時，將含有菌液體的三角瓶置于0° C冰水混合物中，放置20 分鐘，備用。將25ml菌液加入到50ml離心管中，離心5分鐘(4000轉/分鐘，4° C)，棄去上清液，加入IOml冰冷的CaCl2溶液(50mM)，混合均勻，4° C保育30分鐘。半小時后，離心(4000轉/分鐘，4° C)，去掉上清液，加入新鮮的IOml冰冷的CaCl2溶液(50mM)。經過第3次離心后，感受態細菌液最終溶解在2ml冰冷的CaCl2溶液(50mM)。放置過夜后待用。
6.大腸桿菌DH5a感受態細胞的轉化
在I. 5ml離心管中加入100 μ I大腸桿菌DH5 a感受態細胞和8 μ I質粒連接混合物，混合均勻，將I. 5ml離心管置于冰水混合物中，放置20分鐘,后取出將I. 5ml離心管置于42° C的水浴鍋內，放置90秒，取出，再將I. 5ml離心管置于冰水混合物中，放置5分鐘后。加入Iml LB液體培養基，混合均勻，37° C搖床溫育I小時，3000轉/分離心5分鐘后，棄去上清液，將管底的菌體涂布于含25 μ g/ml博萊霉素的LB固體培養基上，放置20分鐘，后置于37° C條件下，培養16小時，形成菌落。
7.重組質粒的篩選和鑒定
選取重組菌落pPICZ a Α-0Ρ，用上海生物工程有限公司的UNIQ-10柱式質粒抽提試劑盒提取質粒。重組質粒經過雙酶切證實后，再送至上海生工生物技術有限公司序列測定，經確認后，繼續下面突變工作。
8.有機磷農藥降解酶突變體L116M基因的設計和制備
分析比較多種有機磷農藥水解酶，選取比較保守并可能屬于酶活性中心或者附近的氨基酸殘基，將第116的亮氨酸改變為蛋氨酸，即L116M。按照碧云天生物技術研究所《基因定點突變試劑盒》的要求，對這些突變位點合成以下所需的引物
5’ 端引物5，cacggtcttgctgactcatATGcaccctgatcatgcatgc 3，；3，端引
物5’ gcatgcatgatcagggtgCATatgagtcagcaagaccgtg 3’
突變后所產生的基因序列如SEQ ID No. 10所示，而所產生的重組酶氨基酸序列如SEQ IDNo.11。
(I)基因定點突變反應
去核酸酶水37ul
反應緩沖液(IOX) 5uI
引物(IOuM each) 2ul
dNTP 混合物(2. 5mM each) 4ul
待突變模板質粒(O. 5ug) Iul
總體積49ul
(2)按照上面的順序依次加入各種試劑，使總體積為49微升。混勻后，加入IulPfuDNA聚合酶混勻。
按照如下參數設置PCR儀步驟1(最初變性):循環為1，溫度95° C，時間40秒;步驟2 (擴增)循環為18，溫度95° C，40秒，變性；60° C I分鐘退火；68° C I. 5分鐘/ kb延伸；步驟3 (延伸和補全)循環為1，溫度95° C，時間40秒；72° C 10分鐘；步驟4 (暫時存放)循環為1，溫度4° C長時間保持。
(3) Dpn I消化PCR反應后，直接在PCR反應體系中加入I微升Dpn I,混勻后37° C孵育I小時。Dpn I消化完畢后可以直接用于轉化，或者-20° C保存備用。(4)轉化，挑克隆鑒定根據所使用的感受態細菌，加入盡量多的經過Dpn I消化后的突變產物用于轉化。通常每100微升感受態細菌中可以加入5-10微升經過Dpn I消化后的突變產物。按照所使用的感受態細菌的操作方法進行操作，在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉化后的細菌，全部涂布到含有適當抗生素的平板上，培養過夜。對于得到的克隆，可以先提取少量質粒酶切鑒定，以確認得到的質粒的大小和質粒中插入片斷的大小與預期結果是否相符。取3個酶切鑒定正確的克隆去測序，最終確認2個克隆都是預期的突變克隆，選取pPICZ a A-Ll 16Μ作進一步工作。9.畢赤酵母基因工程菌構建(I)重組質粒的線性化在I. 5ml離心管中加入50 μ g重組質粒pPICZ a A-Ll 16Μ、10 μ I限制性酶切酶Sac1>20μ I的IOX限制性酶切酶SacI緩沖液和170 μ I去離子水，混合均勻，置于37° C水浴鍋內，放置4小時。加入12 μ I 5Μ恥(1，再加入636“1 95%乙醇，-20° C放置15min，離心5min (12000rpm)。用1200 μ I 75%乙醇洗滌3次，室溫晾干后，溶解在20 μ I的無菌水-20° C保存，待電轉化。(2)酵母菌Χ-33感受態細胞的制備在YPDS固體培養基(1%酵母浸出+2%胰蛋白胨+2%右旋葡萄糖+IM山梨醇+2%瓊脂)上，接種畢赤酵母Χ-33，置于30° C條件下培養72小時，觀察到白色單個菌落。在IOml離心管中加入3ml的YPDS液體培養基和一個巴斯德畢赤酵母X_33菌的單菌落，混合均勻，30° C條件下培養12小時。在250ml三角瓶中加入0.5ml菌液和50mlYPDS液體培養基，30° C條件下培養3小時，檢測菌的0D600值。待0D600=1. 5時，在50ml離心管中加入45ml菌液，4° C離心(2500rpm, 5分鐘),棄上清液，加入45ml去離子水,離心(1500rpm,5分鐘)，再次用去離子水清洗(共三次)。將菌體溶解在IOml 0° C的D-山梨醇(1M)，4° C離心(1500rpm，5分鐘)。最后制得的感受態細胞溶解在IM的D-山梨醇(0D600=1 )，備用。(3)酵母陽性重組子的備制及篩選在4ml離心管中加入10 μ g線性化的載體質粒和100 μ I的畢赤酵母Χ_33菌感受態細胞(0D600=1)，混合均勻。載體質粒含有機磷農藥降解酶基因突變體L116M。在0° C條件下，將電擊杯放于濃度為70%的乙醇中，浸泡30分鐘后，取出，在電擊杯內放入105 μ I混合液，將電擊杯放置5分鐘，后將電擊杯放到電轉化儀內，進行電擊，電脈沖為25微法，電壓為I. 4千伏，電阻為200歐姆，電擊時間為O. 05秒。電擊結束后,取出含有混合液的電擊杯，后在電擊杯內加入Iml D-山梨醇(IM)，將混合物加到I. 5ml離心管中，30° C搖床中，轉速為225rpm，培養I小時后，取100 μ I培養后的混合物，并將其涂布于含有濃度為25 μ g/mlZeocin的YPDS固體培養基上，將涂布后的YPDS固體培養基置于30° C培養箱內，培養4天，得到白色單菌落。將以上得到的全部白色單菌落接種到含500 μ g/ml博萊霉素的YPDS固體培養基上，置于30° C培養箱內，培養3天，觀察到單個菌落，即得到的陽性重組子。10.陽性酵母重組子的誘導表達(I)搖瓶誘導培養將表達的有機磷農藥降解酶突變體L116M的酵母菌，接種到IOOml錐形瓶中的20ml BMGY液體培養基(1%酵母浸出物,2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀PH6. O, I. 34%YNB 4X 10、 生物素，1%甘油)，將菌液置于30°C條件下，搖床培養(200轉/分鐘)至0D600=5時，取8ml 菌液離心(4000rpm，3分鐘)，將菌體轉移到IOOml錐形瓶中的20ml BMMY培養基(1%酵母浸出物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀ρΗ6· O, I. 34%ΥΝΒ 4X10、生物素，O. 5%甲醇)，30°C繼續培養120小時，在培養過程中每隔12小時添加O. Iml濃度為100%的無水甲醇。培養結束后， 取20ml菌液，離心10分鐘(12000rpm)，得到上清液，即為表達的有機磷農藥降解酶突變體 L116M。
(2)發酵罐誘導培養
將菌種接種至IOml YPD培養液(1%酵母浸出+2%胰蛋白胨+2%右旋葡萄糖)，30° C，240rpm，培養過夜，將將其轉入含有新鮮YI3D培養液(200ml)，同樣條件培養過夜。培養液然后轉至含有2升基礎無機鹽培養基的3升發酵罐中繼續培養。基礎無機鹽培養基85%磷酸26. 7ml/L，硫酸鈣O. 93g/L，硫酸鉀18. 2g/L，七水硫酸鎂14. 9g/L，氫氧化鉀 4. 13g/L，葡萄糖50g/L和4. 4ml/L的稀有金屬培養基PTMl。PTMl由以下成分組成五水硫酸銅6. Og/L,碘化鈉O. 08g/L, 一水硫酸錳3. Og/L, 二水鑰酸鈉O. 2g/L，硼酸O. 02g/L,氯化鈷O. 5g/L，氯化鋅20g/L，七水硫酸亞鐵65. Og/L,生物素O. 2g/L，硫酸5. 0ml/L。
將發酵罐pH設置為5.0，溶氧量>20%，溫度為30° C，750rpm。待葡萄糖消耗完畢， 以每小時每升36ml加入含有I. 2%PTM1的25%葡萄糖溶液，持續6小時，進行葡萄糖培養以增加菌體量。待葡萄糖消耗完畢，進入甲醇誘導培養。首先進行甲醇適應階段，以每小時每升加入含有11. 1%甲醇和12ml/L PTMl的葡萄糖，持續4小時。之后以每小時每升3ml加入含有12ml/L PTMl的甲醇進行誘導培養直至發酵結束。
11.重組有機磷農藥降解酶突變體的分離和純化。
將經甲醇誘導后的培養液，離心(IOOOOrpm, 4° C，10分鐘)，收集上清液，加入70% 飽和度的硫酸銨，4° C，I小時后離心沉淀，使用ImM Tris-HCl (pH8. O)緩沖液透析。純化后的重組酶經SDS-PAGE電泳分析為均一條帶，純度超過95%。以牛血清白蛋白為標準，計算有機磷農藥降解酶突變體L116M的含量達7. 2克/升，高于Chu等報道的5. 5g/L產量 (Chu XY, Wu NF, Deng MJ, Tian J, Yao B, FanYL. 2006. Expression of organophosphorus hydrolase 0PHC2 in Pichiapastoris!purification and characterization. Protein Expr Purif. 49:9-14)。
12.對表達產物有機磷農藥降解酶突變體L116M進行聚丙烯酰胺電泳檢測
(I)凝膠的配制
取一個干凈50ml離心管，按以下成份加入，充分混合.
分離膠濃度12% :6. 5ml去離子水，4. 5ml 40%丙烯酰胺混合液，3. 9ml I. 5MTris-HCl ρΗ8· 8,150 μ I 10%十二烷基磺酸鈉，9 μ I TEMED,最后加入 150 μ I 10%過硫酸銨。
積層膠濃度5% 2. 96ml去離子水,0. 5ml 40%丙烯酰胺混合液,0. 5ml I. 5M Tris-HCl ρΗ6· 8，40 μ I 10%十二烷基磺酸鈉，4 μ I TEMED,最后加入40 μ 110%過硫酸銨。
(2)聚丙烯酰胺電泳檢測
I)考馬斯亮蘭染色液配制
取IOOmg考馬斯亮蘭、加入95%乙醇50ml和IOOml乙酸，混合均勻，用去離子水稀釋至IOOOml中，過濾，得到考馬斯亮蘭染液。2)取4%的十二烷基磺酸鈉、12%的甘油、50mM Tris-HCl,2%的疏基乙醇和O. 05%的溴酚藍，混合均勻，用鹽酸將其pH值調至6. 8，形成樣品緩沖液，備用；3)取6ul的樣品緩沖液和2ul的表達產物有機磷農藥降解酶OP或其突變體，混合均勻4)在凝膠的點樣孔中分別加入5 μ I的上樣液和5 μ I蛋白分子量標準品，打開電脈儀開關，在電泳儀電壓為100伏特時開始電泳，電泳3小時后關閉電泳儀，后通過考馬斯亮蘭染液染色30分鐘、脫色液脫色，在凝膠成像系統中確認上樣液中含有表達產物農藥降解酶突變體，其檢測分子量與理論值一致，為32kDa。13.有機磷農藥降解酶突變體LI 16M活性檢測(I)使用甲基對硫磷作底物測試重組降解酶活性。I)用甲醇配制2ml甲基對硫磷(10mg/ml)2)配制IOml甲基對硫磷降解反應液7. 5ml去離子水+0. 5ml IMTris-HCl (pH8. O)緩沖液+Iml 甲醇+0. IM ZnCl2 (IOul) +10mg/ml 甲基對硫憐(50ul)。3)實驗步驟取各重組有機磷降解酶和突變體10ul，加入到990ul去離子水，配制成10_2酶液；再取IOOul 10_2酶液加入到900ul去離子水，配制成10_3酶液。在I. 5ml離心管加入900ul甲基對硫磷降解反應液和10_3酶液(IOOul)，混勻后加入轉移到分光光度計中在412nm波長下，測量光密度。用I. 5ml離心管加入900ul甲基對硫磷降解反應液和IOOul去離子水作為對照。結果顯示與野生型有機磷降解酶OP相比，突變體L116M的酶比活提高13. 2%(p<0. 05)。(2)使用液相識譜方法，對三唑磷、對氧磷、毒死稗進行了測試，結果表面突變體L116M的酶比活與野生型有機磷農藥降解酶比較均超過>10%(p〈0. 05)。
2權利要求
1.一種有機磷農藥降解酶突變體，所述突變體具有如Seq ID No. 8或Seq ID No. 13所述的氨基酸序列；其中所述Seq ID No. 8中第164個氨基酸X1為苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或異亮氨酸(I);其中所述Seq ID No. 13中第116個氨基酸X1為蛋氨酸(M)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)。
2.根據權利要求I所述的有機磷農藥降解酶突變體，其特征在于其中所述SeqIDNo. 8中第164個氨基酸X1為苯丙氨酸(F)，該突變體具有如Seq ID No. 6所述的氨基酸序列。
3.根據權利要求I所述的有機磷農藥降解酶突變體，其特征在于其中所述SeqIDNo. 13中第116個氨基酸X1為蛋氨酸(M)，該突變體具有如Seq ID No. 11所述的氨基酸序列。
4.編碼如權利要求I所述的有機磷農藥降解酶突變體蛋白的基因，所述的基因具有如Seq ID No. 12或Seq ID No. 7所述的核苷酸序列；所述序列Seq ID No. 12中第346-348位的核苷酸N1N2N3為分別編碼蛋氨酸(M)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)的密碼子；所述序列Seq ID No. 7中第490-492位的核苷酸N1N2N3為分別編碼苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或異亮氨酸(I)的密碼子。
5.根據權利要求4所述的基因，其特征在于所述基因序列SeqID No. 12中第346-348位的核苷酸N1N2N3為編碼蛋氨酸(M)的密碼子。
6.根據權利要求5所述的基因，其特征在于所述突變體基因具有如SeqID No. 10所述的核苷酸序列。
7.根據權利要求4所述的基因，其特征在于所述基因序列SeqID No. 7中第490-492位的核苷酸N1N2N3為編碼苯丙氨酸(F)的密碼子。
8.根據權利要求7所述的基因，其特征在于所述突變體基因具有如SeqID No. 5所述的核苷酸序列。
9.攜帶有如權利要求4-8任一項所述基因序列的載體。
10.一種制備如權利要求I所述有機磷農藥降解酶突變體蛋白的方法，所述方法包括如下步驟 (1)在有機磷農藥降解酶突變體基因的兩端引入限制性酶切位點，通過酶切操作連接到酵母表達載體上， (2)將表達載體轉化導入酵母菌中，經篩選得到重組基因工程菌； (3)高密度發酵重組酵母菌，誘導表達后離心收集發酵上清液，經分離純化獲得重組有機磷農藥降解酶突變體蛋白。
全文摘要
本發明提供了一種具有更優良酶活性的有機磷農藥降解酶突變體及其制備方法。通過分析降解酶的活性中心，獲得多個酶的突變體，結果發現突變體M164F和L116M,尤其是M164F具有更優良的酶活性。本發明還提供了一種經畢赤酵母密碼子優化后的降解酶突變體基因序列及利用酵母表達該基因的方法，其制備方法簡單，由于使用畢赤酵母優化后的密碼子，產量更高。獲得有機磷農藥降解酶可以應用在水果，蔬菜，茶葉等農產品農藥殘留處理等領域，具有廣泛的應用前景，經濟意義和社會意義。
文檔編號C12R1/38GK102925419SQ201210458400
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者徐建華, 胡德峰, 徐卡爾·翰 申請人:紹興華泰生物科技有限公司