專利名稱：一種乳桿菌及利用其發酵生產d-乳酸的方法
技術領域：
本發明屬于有機酸發酵技術領域，涉及D-乳酸的生產方法，具體涉及一種乳桿菌及利用其發酵生產D-乳酸的方法。
背景技術：
生物質是指以木質素、纖維素、半纖維素以及其他有機質為主的陸生植物和水生植物，是一種穩定的可再生能源資源，來源豐富，僅我國農作物秸桿產量每年約為7億噸。在上世紀石油危機后，人們開始重視由生物質為原料制備乳酸、燃料酒精的技術。乳酸(分子式C2H50C00H)，即為a -羥基丙酸，由于其分子中羧基a位碳原子為不對稱原子，因而具有旋光性，可分成L ( + )和D (_)兩種構型，L-乳酸為右旋型，D-乳酸為左旋型。乳酸已廣泛用于食品、飲料、飼料、現代醫藥、現代農藥、日用化工、造紙及電子等行業。高光學純度97%以上的D-乳酸或L-乳酸，是重要的手性中間體和有機合成原料，能廣泛應用于制藥、高效低毒農藥及除草劑、化妝品等領域的手性合成。D-乳酸在提高聚乳酸熱穩定性等方面也具有重要作用。目前限制D-乳酸的廣泛應用的主要原因有(I)D-乳酸的生產成本高，其發酵生產的原材料成本高，提純和精制成本高；(2)沒有篩選到合適的能發酵產生高光學純度D-乳酸的菌株，因為一般的乳酸菌主要以發酵產生L-乳酸為主；(3)現有已知的乳酸菌一般不能利用戊糖，例如木糖、核糖和阿拉伯糖作為碳源。微生物發酵法是目前制備D-乳酸的最主要方法之一，由于D-乳酸的理化性質與L-乳酸極其相似，在生產工藝上可以借助L-乳酸的，因此生產D-乳酸的關鍵在于篩選出高光學純度D-乳酸高產菌種，并應用低廉有廣泛來源的原料進行發酵，簡化發酵和提純工藝，降低成本。目前主要利用重組酵母、重組大腸桿菌、重組谷氨酸棒桿菌和菊糖芽孢乳桿菌發酵生產D-乳酸。如于培星[于培星，高產D-乳酸凝結芽孢桿菌發酵工藝條件的確立，中國食品添加劑，2010，2 :97-101]使用凝結芽孢桿菌，D-乳酸最高產量約為120 g/L ;中國專利03817294. I公開了利用重組酵母生產D-乳酸的方法；申請號為201010241912. X的中國發明專利公開了用菊糖芽孢乳桿菌發酵生產D-乳酸；申請號為201010101421.5的中國發明專利公開了利用重組大腸桿菌以甘油為原料發酵制備D-乳酸的方法，但是菌株對酸的耐受性差，生產率低，使得大腸桿菌在D-乳酸實際應用當中受到限制；申請號為201010247826. X的中國發明公開了利用基因工程手段，成功構建了產高光學純度D-乳酸的基因工程菌并利用其進行乳酸發酵生產，其D-乳酸產量達到40g/L以上，純度為99%以上；申請號為201010235511. 3的專利公開了利用同源重組的方法得到產純D-乳酸的基因工程菌并用其進行乳酸發酵生產，其D-乳酸產量僅為20g/L以上，純度為99%以上。上述現有技術中D-乳酸的產量不高，使用的碳源主要以葡萄糖為主，沒有涉及到更廣泛的生物質碳源。戊糖乳桿菌可抑制腐敗菌和致病菌的生長。如中國專利03126225. 2公開了 “一種戊糖乳桿菌菌株和以該菌株制成的發酵劑及該發酵劑在肉食品中的應用”；中國專利200510105985. 5公開了戊糖乳桿菌代謝產生的細菌素和戊糖乳桿菌作為發酵劑在發酵制品中的應用；專利號為200810247335.8的中國發明公開了戊糖乳桿菌和乳酸片球菌用于中、西肉制品中的加工應用。但上述專利都沒有涉及戊糖乳桿菌在D-乳酸發酵生產中的應用。
發明內容
本發明的目的在于針對上述現有技術的不足，提供一種乳桿菌O3Cte如CiJAz1Ssp.)及利用其發酵生產D-乳酸的方法，該方法中D-乳酸的產量高，碳源來源廣泛。為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案
一種乳桿菌iLactobacillus sp. ) DMDL 9010,由蒸枝汁分離篩選得到，并于2011年8月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC NO. 5172。該乳桿菌sp.) DMDL 9010 (CGMCC NO. 5172)菌株具有如下性質
(1)形態特征二聯桿菌，無芽孢，菌落表面光滑半透明，邊緣整齊，有光澤；
(2)生理特征接觸酶陰性，氧化酶陰性，不液化明膠，不還原硝酸鹽，精氨酸水解陰性，酪素水解陰性，V-P試驗陽性，革蘭氏染色為陽性菌，兼性厭氧菌，可利用阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、鹿糖、麥芽糖、核糖、山梨糖、海藻糖、七葉靈，不能利用鼠李糖和棉籽糖。能在15°C、37°C、40°C溫度下生長，在45°C溫度不生長。對該乳桿菌sp.) DMDL 9010 (CGMCC NO. 5172)菌株的初步鑒定結果如表I所不
表I MRS培養基分離菌株發酵特性
權利要求
1.一種乳桿菌，其特征在于，所述菌株為乳桿菌(LacioAaciBw1S 5/ . ) DMDL9010,于2011年8月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為 CGMCC NO. 5172。
2.—種利用權利要求I所述的乳桿菌{Lactobacillus sp. )DMDL9010發酵生產D-乳酸的方法，其特征在于，包括如下步驟和工藝條件 第一步將乳桿菌Oacio如ci77m sp. )DMDL9010的凍干粉O. Γθ. 5g置于種子培養基中，每5 10 mL培養基加入凍干粉O. Γ0. 5g，于20 35°C靜止培養20 28h，制成第一次種子液； 第二步以體積比為5 10 :100的比例，將第一次種子液接入種子培養基中，于2(T35°C靜止培養2(T28h，制成第二次種子液； 第三步以體積比為5 10 :100的比例，將第二次種子液接入種子培養基中，于2(T35°C靜止培養2(T28h，制成第三次活化液； 第四步以體積比為(21) :100的比例，將第三步得到的第三次活化液接入到發酵培養基中，加入中和劑調節發酵培養基的PH為6. (Γ7. 0，于2(T35°C下，在攪拌轉速為100^150rpm的發酵罐中發酵，得到D-乳酸。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述種子培養基的配方為以重量份數計，蛋白胨O. 8 I. 2份，酵母粉O. 2 O. 8份，葡萄糖I. 5 2. 5份，檸檬酸三胺O. Γθ. 3份，七水合硫酸鎂O. ΟΓΟ. 03份，牛肉膏O. 5^1. 5份，磷酸氫二鉀O. 05、. 35份，四水合硫酸錳O. 001 O. 009份，乙酸鈉O. 05 O. 35份，吐溫80 O. 05 O. 15份，蒸餾水92. 8 96. 7份；所述種子培養基的制備方法為按配方稱取上述原料攪拌溶解均勻后用O. 08、. IOMPa滅菌15 20min，冷卻至20 35°C備用；所述種子培養基的pH為6. 0 7. O。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的配方為以重量份數計，糖度為15 25%的淀粉質水解液或生物質糖液6(Γ80份，蛋白胨O. 8^1. 2份，酵母粉O.2 O. 8份，牛肉膏O. 5 I. 5，葡萄糖I. 5 2. 5份，檸檬酸三胺O. Γθ. 3份，七水合硫酸鎂O.01 O. 03份，磷酸氫二鉀O. 05 O. 35份，四水合硫酸錳O. 001 O. 009份，乙酸鈉O. 05 O. 35份，吐溫80 O. 05、. 15份，抗壞血酸O. 02、. 04份，蒸餾水10. 8^35. 9份；所述發酵培養基的制備方法為按配方稱取上述原料攪拌溶解均勻后用O. 08、. 10 MPa滅菌15 20 min，冷卻至2(T35 °C，加入O. 5^2. O份的95%的乙醇，攪拌均勻后備用；所述發酵培養基的pH為6.0 7· O。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述淀粉質水解液的制備方法為將60^200目的淀粉質粉體加水配制成體積百分比為15 30%的溶液，以每IOOg干淀粉加入α -淀粉酶為 O. 02 O. 04mL，在 7(T80°C保溫 3(T40min，然后在 9(Tl00°C液化 6(T90min，降溫至60 65°C，以每IOOg干淀粉加入糖化酶O. 05 O. 15mL，于60 65°C保溫3(T60min后離心取上清液即為淀粉質水解液；所述淀粉質粉體為玉米淀粉、木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、大米粉或糙米粉中的一種或兩種以上。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物質糖液為甘蔗糖液、蔗糖液、纖維素水解液、半纖維素水解液、半乳糖液或木糖液，以及由纖維二糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、核糖或山梨糖中的一種或兩種以上糖組成的混合液。
7.根據權利要求2飛所述的方法，其特征在于，第四步中所述攪拌的過程中采用氧化還原電位的變化進行轉速控制，使氧化還原電位為-150'180，同時利用手性柱高效液相色譜法測定D-乳酸的含量確定發酵終點。
8.根據權利要求2飛任意一項所述的方法，其特征在于，第四步中發酵時間為IOf144h0
9.根據權利要求2飛任意一項所述的方法，其特征在于，所述中和劑為已滅菌的堿土金屬氫氧化物、堿土金屬碳酸鹽或氨水中的一種或兩種以上；所述中和劑加入的方式為一次性加入、分批加入或流加入；所述分批加入為每發酵12 24小時加入一次中和劑，每次加入量不超過發酵培養基總體積的O. 5^1. O % ;所述流加入的流速為O. 5 2mL/min。
10.根據權利要求2飛任意一項所述的方法，其特征在于，第三步所述第二次種子液與種子培養基的體積比為5 :100，發酵溫度為30°C ;第一步、第二步和第三步的發酵溫度均為30°C，培養時間均為24h。
全文摘要
本發明公開了一種乳桿菌及利用其發酵生產D-乳酸的方法，用于本發明的菌株為乳桿菌(Lactobacillussp.)DMDL9010，保藏號為CGMCC No.5172，先將該菌株經過三次活化培養，然后于20~35℃發酵108~144h得到高光學純度的D-乳酸。本發明中乳桿菌DMDL9010能夠利用五碳糖和六碳糖發酵生產D-乳酸，穩定高產，產量為65~85g/L；所產生的D-乳酸具有高光學純度，達到80~90%；發酵所用的原料來源廣泛，價格低廉；菌株發酵周期僅為108~144h；利用本發明的方法發酵生產D-乳酸，能夠節約成本，提高生產效率，具有重要的工業應用價值。
文檔編號C12P7/56GK102978134SQ20121047241
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者劉冬梅, 周勁松, 尚雍賀 申請人:華南理工大學