專利名稱：蝦虎魚類線粒體nd1基因全序列擴增引物及其設計和擴增方法
技術領域：
本發明屬于魚類線粒體基因組研究領域，具體涉及一種高效擴增多種蝦虎魚類線粒體NADH還原酶復合體亞基I (NADH dehydrogenase subunits I ;ND1)基因全序列擴增引物及其設計和擴增方法。
背景技術：
魚類線粒體基因組由13個編碼蛋白質基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因(12SrRNA及16S rRNA)共37個編碼基因及一段主要的非編碼區(控制區)組成，具有結構簡單、拷貝數多、嚴格的母系遺傳、幾乎不發生重組、編碼效率高、進化速度快且不同區域進化速度存在差異等特點。由于魚類線粒體基因組所具有的這些特點，使其成為魚類分子群體遺傳學、系統發生學及保護生物學等研究領域的重要分子標記。蝦虎魚類隸屬于鱸形目、蝦虎魚亞目，是世界上種類最多，分布最廣的魚類類群之一。全世界的蝦虎魚種類估計有2000多種，它們形成一個龐大的生物類群，在水環境尤其是海洋生態環境中占有重要的地位。蝦虎魚多為肉食性的小型魚類，遍布全世界，尤以熱帶為多，主要為海水魚，大部分營底棲生活，主要特征是其腹鰭愈合成一吸盤狀。近年來，由于過度捕撈、氣候環境變化等原因，許多傳統的經濟魚種資源已經形不成漁訊，有些甚至枯竭，但蝦虎魚類因其適應能力強、生命周期短、繁殖力強等原因，資源量卻逐年增加。由于蝦虎魚類經濟價值不高，國內外有關于蝦虎魚類的研究相對較少，因其種類繁多，外部形態特征極為相似，導致不易鑒別和認定。目前，蝦虎魚類的分類還不甚清晰，很多種類的分類地位還比較混亂。
線粒體全基因組及線粒體基因組上的相關基因作為分子標記已被廣泛地用于魚類的群體遺傳學、系統發生學及保護生物學等研究領域。NDl作為脊椎動物線粒體蛋白質編碼基因中7個編碼NADH還原酶復合體亞基的基因之一，其進化上較為保守，可應用于動物的系統進化和分類研究。然而未曾有報道過擴增線粒體NDl基因全序列的通用引物，尤其是針對物種分布廣泛、種類眾多的蝦虎魚類。因此設計特異性擴增蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列的通用引物，從而為高效獲得蝦虎魚線粒體NDl基因全序列及線粒體基因組全序列奠定基礎。
發明內容
針對上述現有技術存在的空缺，本發明旨在提供一對可高效特異擴增多種蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列的核苷酸引物，從而為快速有效獲取蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列以進行系統進化和分類研究提供一個有力工具。本發明的目的還在于提供所述蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物的設計方法，以及利用所述的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物對蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列進行擴增的方法。為實現本發明的發明目的，發明人提供如下技術方案:蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物，由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。本發明的輕鏈引物Gobies-NDl-F (SEQ ID N0.1所示)有19個堿基:CGGAGAAATCCAGGTCAGT，位于 16S rRNA 基因上；重鏈引物 Gobies-NDl-R (SEQ ID N0.2 所示)有 19 個堿基:CCAACATGTTTGGGGTATG，位于 tRNA_Met 基因上。本發明所述的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物對在東海海域采集的15種蝦虎魚類，均能獲得片段長度為1300 bp左右的特異性擴增產物，經測序及與GenBank中同源序列的比較，確認為包含線粒體NDl基因全序列、tRNA-Val基因全序列、tRNA-1le基因全序列、tRNA-Gln基因全序列及長度為115 bp左右的16S rRNA基因3’端部分序列的擴增產物，體現出本發明較廣的擴增范圍與較強的擴增能力，從而為快速有效獲取蝦虎魚類線粒NDl基因全序列以進行系統進化及分類研究提供一個有力工具。作為優選，根據本發明所述的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物，其中所述的蝦虎魚類包括但不限于下述:中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚。本發明還提供了上述蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物的設計方法，即登錄NCBI網站中的GenBank數據庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)搜索已公布的其他物種的蝦虎魚類及近緣魚類物種的線粒體基因組的16S rRNA基因和tRNA_Met基因序列，經同源性比較，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0軟件設計出奸虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物。所用的Premier Primer5.0軟件在生物軟件網http://www.bio-soft,net/下載。本發明還提供了一種對蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列進行擴增的方法，包括采用上述的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物對待測樣品的DNA模板溶液進行PCR擴
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>曰ο作為優選，根據本發明所述的一種對蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列進行擴增的方法，其中PCR擴增的條件為:95°C預變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin30s，共35個循環，最后72°C延伸5min。作為優選，根據本發明所述的一種對蝦虎魚類線粒體NDl基因進行擴增的方法，其中PCR擴增的反應體系組成為:PCR反應體系為25μ ，內含dNTP (2.5mM) 2PL、10XTaqDNA聚合酶Buffer 2.5μ 、ΙΟμΜ的輕鏈引物和重鏈引物各 μ 、Taq DNA聚合酶(5U/ul)
0.2μ 、含 IOOng 的 DNA 模板溶液 WL 及 ddH20 17.3μ 。作為優選，根據本發明所述的一種對蝦虎魚類線粒體NDl基因進行擴增的方法，其中所述的蝦虎魚類包括但不限于下述:中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚。與現有技術相比，本發明具有如下優點:
本發明提供的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物，可以高效特異性地擴增多種蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列，而不是僅僅擴增NDl的部分片段序列，能應用于蝦虎類不同分類階元系統進化和分類研究。同時本發明所述通用引物及其設計方法也可作為通用引物PCR擴增原理及關鍵參數研究的具體實例，促進本發明所涉及領域的前進發展，因而具備重要發明價值和理論意義。
圖1為本發明蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物用以擴增不同蝦虎魚類線粒體ND I基因全序列的電泳圖譜。其中M =DNA分子量標準(DL2000)，1-15依次為:中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚。
具體實施例方式下面結合實施例和說明書附圖，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施并不局限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍。在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業 常用的。若無特別指明，實施例采用的方法為本領域通用技術。主要材料、試劑和儀器設備:
軟件及序列資源:Premier Primer5.0引物設計軟件(下載自生物軟件網http://www.bio-soft, net/),奸虎魚類線粒體基因組序列資源(下載自NCBI中Genbank數據庫http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/),序列分析軟件MEGA5.0(下載自生物軟件網 http: //www.bio-soft, net/)。PCR擴增檢測相關試劑儀器:海洋動物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，北京)，常規臺式離心機(Thermo)，Bio-Rad C1000TMThermal CycIer擴增儀器(Bio-Rad，美國)，微量移液器(Eenppdorf，德國)，96孔PCR板(Axygen)，dNTP (TIANGEN，北京)，IOXTaq DNA 聚合酶 Buffer (TIANGEN，北京)，Taq DNA 聚合酶(TIANGEN，北京)，滅菌雙蒸水，DL2000 DNA marker (TIANGEN,北京)，瓊脂糖(Biowest，香港)，電泳儀(DYY-6C型，北京六一)，凝膠成像儀(Bio-Rad⑶2000，美國)。克隆測序相關試劑儀器:高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO，日本)，加氨芐(Amp)抗生素的滅菌LB培養基，LB固體培養平皿(上海生工)，超凈工作臺(SW — CJ一IG型，名牌之星，中國)，恒溫水浴鍋(上海精宏)，DH5a感受態細胞(TIANGEN)，Amp抗生素(上海生工)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(上海生工)，異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(上海生工)，pGEM-T載體(Promega，美國)，恒溫培養箱(PH070A型，上海一恒科學儀器有限公司)，恒溫振蕩搖床(培英，太倉市實驗設備廠)自動DNA測序儀(ABI 3730型，美國)。實施例中未注明具體條件的實驗方法，是按照常規條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商說明書建議的條件。實施例11、蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物的設計和合成:登錄NCBI網站中的GenBank數據庫搜索已測定的其他物種的蝦虎魚類及近緣魚類物種的線粒體基因組的16S rRNA基因和tRNA-Met基因序列，將序列載入到分析軟件MEGA5.0中，利用ClustalW算法進行多序列對位比對分析，找到保守序列，將所找到的保守序列載入到Premier Primer5.0軟件在手動設計模式下(即在manual選項下選擇Low,具體參數為默認設置)設計出蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物:其中輕鏈引物Gobies-NDl-F(SEQ ID N0.1所示)有19個堿基:CGGAGAAATCCAGGTCAGT，位于16S rRNA基因上；重鏈引物Gobies-NDl-R (SEQ ID N0.2 所示)有 19 個堿基:CCAACATGTTTGGGGTATG，位于 tRNA-Met 基因上。由南京金斯瑞生物科技有限公司根據發明人的要求合成符合SEQ ID N0.1和SEQID N0.1所示核苷酸序列的引物。2、對蝦虎魚類線粒體NDl基因進行擴增
本發明中的15個待測樣本均采集于我國的東海海域。其中擴增的蝦虎魚類為以下種類:中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚。利用海洋動物基因組DNA提取試劑盒提取待測樣本的基因組DNA，方法按照試劑盒說明書進行，瓊脂糖電泳檢測提取的基因組DNA。用于擴增多種蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列的PCR反應體系和反應條件如下:PCR 反應體系為 25μ ，內含 dNTP (TIANGEN), IOXTaqDNA 聚合酶 Buffer (TIANGEN), ΙΟμΜ的輕鏈引物Gobies-NDl-F和 ΙΟμΜ的重鏈引物Gobies- NDl_R，Taq DNA 聚合酶(TIANGEN)，含IOOng的上述提取的基因組DNA模板溶液，ddH20，其中:
10 X TaqDNA 聚合酶 Buffer 2.5μdNTP2μ
Gobies- NDl-F μ
Gobies- NDl-R μ
Template DNAIM-L
ddH2017.3μ
Taq DNA 聚合酶0.2μ 。 擴增反應在Bio-Rad C1000 Thermal Cycler儀器上進行，擴增條件為:95°C預變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin30s，共35個循環，最后72°C延伸5min。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小和純度。不同蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增產物的電泳圖譜見圖1。運用設計的引物擴增多數蝦虎魚類線粒NDl基因全序列，均獲得了單一的目的片段，產物大小約為1300 bp，并對PCR擴增產物直接進行測序，其步驟為:PCR擴增產物初步定量后，濃度達到約lOOng/μΙ的樣品，寄送南京金斯瑞生物科技有限公司，委托其進行雙向測序，測序引物為Gobies- NDl-F (ΙΟμΜ)和Gobies- NDl-R (ΙΟμΜ)。經測序及與GenBank中的同源序列進行比對，確認為包含線粒體NDl基因全序列、tRNA-Val基因全序列、tRNA-1le基因全序列、tRNA-Gln基因全序列及長度為115 bp左右的16S rRNA基因3’端部分序列的擴增產物。
另外，運用設計的引物擴增普氏細棘蝦虎魚和青彈涂魚線粒體NDl基因，均獲得了單一的目的片段，產物大小約為1300 bp，并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，上海)對PCR擴增產物進行膠回收純化，純化產物與pGEM-T載體(Promega公司，美國)連接，轉化，鑒定陽性克隆并測序。其步驟為:經膠回收純化的PCR擴增產物在T4 DNA連接酶的作用下與PGEM-T載體進行連接反應。連接反應體系為載體 μ ，T4 DNA連接酶 μ ，連接Buffer 5ul，PCR純化產物3μ1。連接反應于冰上操作，反應液置于4°C冰箱連接過夜(至少12小時)。取DH5a感受態細胞(TIANGEN，北京)，熱激法進行轉化，用含有氨芐抗生素(Amp)LB平板(使用前預先均勻涂布40ul 20mg/ml的5-溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷(X-Gal)和30ul 0.2mol/L的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG))進行藍白篩選，并通過菌液PCR擴增確認挑取的陽性克隆子。陽性克隆子經擴大培養后的菌液寄送南京金斯瑞生物科技有限公司進行雙向直接測序。測序引物為SP6/T7。序列分析儀為ABI 3730全自動DNA測序儀。經測序及與GenBank中的同源序列進行比對，確認為包含線粒體NDl基因全序列、tRNA-Val基因全序列、tRNA-1le基因全序列、tRNA-Gln基因全序列及長度為115bp左右的16S rRNA基因3’端部分序列的擴增產物。實用性
本發明所述的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物對在東海海域采集的15種海洋蝦虎魚類的DNA模板溶液進行PCR擴增，均能獲得片段在1300 bp左右的特異性擴增產物，經測序及與GenBank中同源序列的比較，確認為包含線粒體NDl基因全序列、tRNA-Val基因全序列、tRNA-1le基因全序列 、tRNA-Gln基因全序列及長度為115 bp左右的16S rRNA基因3’端部分序列的擴增產物，體現出本發明較廣的擴增范圍與較強的擴增能力，由于本發明所選用的15種蝦虎魚類分別屬于蝦虎魚亞目下面不同科屬的物種，因此，本發明所述的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物在蝦虎魚類不同分類階元系統進化及分類研究領域均可予以應用。盡管發明人已經對本發明的技術方案做了較為詳細的闡述和列舉，應當理解，對于本領域一個熟練的技術人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發明精神的實質，本發明中出現的術語用于對本發明技術方案的闡述和理解，并不能構成對本發明的限制。
權利要求
1.蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物，其特征是由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物，其特征是所述的蝦虎魚類包括中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚。
3.—種如權利要求1所述的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物的設計方法，其特征是登錄NCBI網站中的GenBank數據庫搜索已測定的其他物種的蝦虎魚類及近緣魚類物種的線粒體基因組的16S rRNA基因和tRNA_Met基因序列，經同源性比較，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0軟件設計出奸虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物。
4.一種對蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增的方法，其特征是采用如權利要求1所述的蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列擴增引物對待測樣品的DNA模板溶液進行PCR擴增。
5.如權利要求4所述的一種對蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列進行擴增的方法，其特征是PCR擴增的條件為:95°C預變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin30s，共35個循環，最后72°C延伸5min。
6.如權利要求4所述的一種對蝦虎魚類線粒體NDl基因全序列進行擴增的方法，其特征是PCR擴增的反應體系組成為:PCR反應體系為25μ ，內含2.5mM的dNTP 2PL、10XTaqDNA聚合酶Buffer 2.5μ 、ΙΟμΜ的輕鏈引物和重鏈引物各lPL、5U/ul的Taq DNA聚合酶0.2μ 、含 IOOng 的 DNA 模板溶液 WL 及 ddH20 17.3μ 。
7.如權利要求4所述 的一種對蝦虎魚類線粒體NDl基因全序進行擴增的方法,其特征是所述的待測樣品來自中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚。
全文摘要
本發明屬于魚類線粒體基因組研究領域，具體涉及一種蝦虎魚類線粒體ND1基因全序列擴增引物，由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本發明還提了該擴增引物的設計方法和擴增方法。本發明可高效特異性地擴增多種蝦虎魚類線粒體ND1基因全序列，能應用于蝦虎類不同分類階元系統進化和分類研究。
文檔編號C12N15/11GK103074336SQ20121048283
公開日2013年5月1日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者徐田軍, 孫悅娜, 王日昕, 金逍逍 申請人:浙江海洋學院