專利名稱：用于mst1基因定量檢測的標準質粒及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及用于定量檢測MSTl基因的標準質粒及試劑盒，本發明還涉及檢測MSTl基因的引物。
背景技術：
哺乳動物STE20相關激酶(MST)是哺乳動物系統中體內普遍泛素化表達的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括MST1、MST2、MST3和MST4四個成員。許多細胞系的研究表明，多種促凋亡刺激和細胞應激可激活MST1，激活的MSTl產生的片段可以入細胞核，從而與核內一些蛋白如DAP、H2b相互作用，引起染色質濃縮和DNA斷裂。也有報道指出，MSTl能專一性地被具有活性的蛋白酶Caspase3所剪切活化，過量表達的MSH也能誘導Caspase3活 性，由此MSIl和Caspase形成正向反饋回路，導致DNA片段化與核膜崩解，進一步增強了凋亡反應。近幾年，國內外研究MSTl激酶的凋亡作用，主要集中在蛋白結構變化和生物活性這兩方面，而對于組織或細胞中MSTl基因表達調控的影響研究較少。傳統的RT-PCR方法常被用于mRNA轉錄的檢測，但此方法是非定量的。實時熒光定量PCR可以通過標準曲線對未知模板進行定量分析，從而實現了 PCR技術從定性到定量的飛躍，利用實時熒光定量PCR技術對基因mRNA的表達水平進行研究非常可靠，其研究結果具有可比性和重復性。SYBR Green I實時熒光定量PCR是目前較為準確定量檢測核酸的一種方法。SYBRGreen I染料非特異地與雙股DNA分子結合，在適當的光源激發下放出熒光，其熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，即熒光信號的增加與PCR產物的增加同步，所以對不同模板不需要特別定制不同的特異性探針，其檢測范圍寬、靈敏度高、特異性強、成本低、易于標準化，是一種有效、快速和簡便的檢測方法。由于SYBR Green I沒有特異性，對PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光，會影響定量的精確性，因此該方法對PCR擴增特異性要求較高。目前，PCR產物的非特異性擴增以及引物二聚體的問題可以通過溶解曲線的分析得以解決，根據樣品的Ct值參照標準曲線，經軟件分析處理后可以精確的計算出樣品的拷貝數，因此，國內外在科研中使用比較普遍。SYBR Green I模式的熒光定量PCR是一種利用熒光染料非特異地與雙股DNA分子結合釋放熒光的一種基因表達定量方法，它具有檢測范圍寬、靈敏度高、特異性強、成本低等優點，但運用SYBR Green I實時熒光定量PCR技術檢測MSTl基因表達變化還未見報道。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供用于檢測MSTl基因的靶序列。本發明的第二個目的在于提供含有上述靶序列的重組質粒；本發明的第三個目的在于提供用于擴增上述靶序列的引物；本發明的第四個目的在于提供定量檢測MSTl基因表達變化的方法及試劑盒。基于以上目的，本發明對NCBI數據庫中的MSTl基因進行反復比對，篩選出MSTl基因高度保守的靶序列，其含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。進一步，本發明提供用于特異性擴征上述靶序列的引物。本發明提供的優選的弓I物序列為上游引物GATGGCTCCTGAAGTTAIT，(SEQID NO. 2)下游引物CTGGCTTACGGAATGTGGG，(SEQID NO. 3)。本發明還提供了含有上述靶序列的重組質粒。該重組質粒的構建方法為以哺乳動物組織或細胞的c DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增，反應條件為95°C熱啟動3min ;95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35個循環后72°C延伸5min，反應結束后，以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產物；回收PCR產物，將T載體與PCR產物進行連接，連接反應按照pEASY-Blunt試劑盒的說明書進行，后將連接產物轉化至感受態細胞，進行氨芐青霉素及藍白斑篩選，挑選白斑，37°C過夜培養10h-12h ;次日提取質粒，提取步驟按照試劑盒說明書進行。而后利用內切酶Hind III和Xba I進行酶切鑒定，最后對重組子T-MSTl測序；使用Vector NTI軟件進行核苷酸序列分析，獲得陽性重組質粒后測定質粒0D260和0D280值，并按照10D=50ii g/ml計算質粒質量濃度。本發明提供了上述重組質粒作為標準陽性參考物質用于哺乳動物MSTl基因的分子生物學檢測的用途。所述分子生物學檢測為PCR或熒光定量PCR檢測。進一步，本發明提供檢測MSTl基因的實時熒光定量PCR檢測方法，包括從動物組織或細胞中提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，利用本發明提供的引物進行實時熒光定量PCR，同時設立無模板對照和陽性對照，根據擴增曲線判定結果。其中，所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。其中，所述的陽性對照為本發明提供的標準質粒即含有上述MSTl基因靶序列的重組質粒。所述的實時熒光定量PCR，其20 ii L總工作體系為
試劑體積叫終濃度
SYBR Green Supennix 10.0 I x 上游引物0.5 5yM
下游引物0.5 SjiM
cDNA 模板1.0
去離子水叫L。所述的實時熒光定量PCR，其反應程序為50°C UNG酶孵育2min，95°C變性30sec ；95°C變性5sec，55°C退火20sec，72°C延伸30sec，84°C數據采集ls，40個循環；72°C延伸IOmin0實時熒光定量PCR結束后，對擴增產物(75°C 95°C )進行溶解曲線分析。反應結束后，系統自動生成溶解曲線及標準曲線。
本發明提供了一種用于檢測MSTl的試劑盒，其包括上述能特異地擴增出如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的特異性引物。本發明試劑盒的引物序列為上游引物GATGGCTCCTGAAGTTATT(SEQ ID NO. 2)，下游引物CTGGCTTACGGAATGTGGG(SEQ ID NO. 3)。本發明提供的試劑盒，還可進一步包括熒光定量反應液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為標準質粒即含有上述MSTl基因靶序列的重組質粒。本發明的試劑盒，其20 ii L總工作體系為
試劑體積卩L終濃度
SYBR Green Supermix 10.0 I x 上游引物0.5 5
下游引物0.5 5
cDNA 模板1.0
去離子水。其工作程序為50°C UNG酶孵育2min，95°C變性30sec ;95°C變性5sec，55°C退火20sec，72°C延伸30sec，84°C數據采集ls，40個循環；72°C延伸lOmin。本發明還提供了含有上述引物和探針的診斷試劑。本研究采用SYBR Green I染料法進行實時熒光定量PCR，由于Ct值相對固定，重復性好，以不同濃度標準品質粒DNA分別進行熒光定量PCR擴增，發現起始濃度越高，Ct值越小，即起始模板濃度與Ct值之間呈良好的線性關系，因此，制定的標準曲線具有很聞的線性相關性、敏感性，使得實驗結果更精確并具有很聞的可罪性。本研究中，目的基因MSTl為單一的溶點峰，表明實驗中無引物二聚體和非特異性條帶的擴增，產物純度高，特異性好，通過10倍遞減稀釋標準品質粒濃度所得到的Ct值繪制標準曲線的相關系數高達0. 997，說明質粒各個梯度間相關性較好，標準曲線的可靠性強，能夠保證數據的精確性。目前，在國內外尚未發現有針對MSTl基因mRNA進行熒光定量PCR檢測方法的報道，同時在國內外也未發現有商品化的檢測MSTl基因mRNA試劑盒出售。本發明根據實施
4、5、6、7實驗結果發現，本發明方法檢測靈敏度比普通PCR方法高100倍，最低限度可檢測到目的基因的10個拷貝，且可實時定量擴增的模板量；利用該方法比普通PCR方法檢測所用時間從原來的4小時縮減為2. 5小時,單一樣本所耗成本縮減三分之一,一次可檢測72個樣品，如若大批量進行檢測，不僅更加快速、費時少，同時極大地節約人力、物力和財力；以往普通PCR檢測方法極易出現假陽性，如環境、操作等對樣本的污染，檢測人員很難加以區別，而運用本發明的方法，根據溶解曲線圖(單一峰值)可很容易地加以分辨假陽性，且根據擴增曲線圖和標準曲線圖能夠準確地定量模板中基因的表達變化，可用于統計學分析及后續樣品的定量。
圖1為PCR擴增MSTl基因純化回收結果電泳圖，其中M:5000DNA Marker ;1:MST1。
圖2為Xba I和Hind III酶切鑒定結果電泳圖，其中M:5000DNAMarker ；1-4, 6-10:Xba I和Hind III酶切鑒定的陽性克隆;5:Xba I和Hind III酶切鑒定的陰性克隆。圖3為實時熒光定量熔解曲線圖，其中6個模板稀釋梯度的RT-qPCR溶解曲線均
為單一峰。圖4為實時熒光定量動力學曲線圖，其中6個模板稀釋梯度的RT-qPCR擴增曲線間距相同，擴增曲線均呈指數上升，標準品質粒10倍遞減稀釋，每條曲線由左至右分別為Io6UO5UO4UO3UO2UO1 拷貝 / 反應。
圖5為實時熒光定量標準曲線圖，其中6個模板稀釋梯度的RT-qPCR呈一次遞減函數。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例中使用的材料、試劑和儀器如下小鼠神經瘤細胞系N2a(ATC-CCCL-131TM)，購自中國科學院細胞生物所；RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；ReVertAidFirstStrand cDNA Synthesis Kit 購自 Thermo 公司；iQ SYBR GreenSupermix 購自BIO-RAD 公司、Trans5 a 感受態細胞、pEASY-Blunt 克隆載體(T 載體)、2 X Taq PCR MasterMix、質粒小量提取試劑盒,均購自北京全式金生物技術有限公司；DNA marker、內切酶HindIII和Xba I均購自TaKaRa公司。實時熒光定量PCR儀，0PTIC0N2型，MJ Research公司。實施例1MSTl特異序列的確定本發明對NCBI上所有的MSTl基因核苷酸序列進行反復比對和篩選，發現MSTl基因(GenBank中登錄號為AF271360.1)的序列中173bp長度的序列具有高度的保守性，可以用于檢測MSTl基因在體內的表達變化。實施例2MST1特異性引物和探針的設計本發明經反復篩選和驗證，利用引物設計軟件Vector NTI，按照已經發表的鼠MSTl基因相應mRNA序列，分析并設計一對用于檢測MSTl基因特異性保守序列的的熒光定量PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為上游引物5’-GATGGCTCCTGAAGTTATT-3’(SEQ IDN0. 2)，下游引物5’-CTGGCTTACGGAATGTGGG-3’(SEQ IDN0. 3)。 實施例3MST1基因組DNA標準品質粒的構建l、N2a細胞的復蘇與培養取出液氮罐中裝有N2a細胞的凍存管，立即放入預熱至37°C的水浴中并搖動，使管中細胞懸液快速融化，然后后低速800r/min離心5min，離心后棄去凍存液，取Iml完全DMEM培養基加至管中反復吹打，吸出吹打后的液體加至培養瓶中，重復沖洗吹打一次。用含20%胎牛血清的完全DMEM培養基5ml，37°C、5%C02、飽和濕度培養。12h待細胞貼壁后，更換新鮮培養液繼續培養。2、N2a細胞總RNA的提取及反轉錄用0. P/oDEPC水處理所有實驗用具(37°C，2h)，塑料器皿高壓滅菌，其他用品180°C烘烤3h。于1. 5ml EP管總放入約IO5細胞，加入Iml Trizol用振蕩器充分振蕩混勻，使細胞充分裂解，冰浴5min ;加入200 ill氯仿，充分振蕩振搖15s，靜置3min ；4°C 12000r/min離心lOmin，吸取最上層透明液體400iU，移取至新的1. 5EP管中，加入等體積70%的乙醇，顛倒混勻，而后加入到RA吸附柱中；4°C離心12000r/min離心45s，棄去廢液，加入500iil去蛋白RE, 12000r/min離心45s,棄去廢液；加入500 U I漂洗液，離心12000r/min離心45s,棄廢液后重復一次，將RA吸附柱13000r/min離心2min盡量去除漂洗液，最后加入無RNA酶的 DEPC 水 50 u I 溶解 RNA。參照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行反轉錄，反轉錄反應總體系為20 ii 1，獲得cDNA。3、普通PCR擴增 引物序列見實施例2 ；以cDNA為模板進行PCR擴增，模板0. 5 U 1，上、下游引物均為 1.5iil，2XTaq PCR Master Mix 10 yl，補水至 20 yl，反應條件為95°C 熱啟動 3min ;95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35個循環后72°C延伸5min，反應結束后，以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產物。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得了預期目的基因產物特異性條帶，且無引物二聚體，即成功擴增了 MSTl基因的173bp特異性條帶，見圖1，該特異性條帶的序列如SEQ ID NO.1所示。4、重組質粒的制備及鑒定PCR產物回收按照童貽剛等人發明的方法進行膠回收，然后將pEASY-Blunt克隆載體(T載體)與PCR產物進行連接，連接反應按照pEASY-Blunt試劑盒的說明書進行。后將連接產物轉化至Trans5 a感受態細胞，進行氨芐青霉素及藍白斑篩選，挑選白斑，37°C過夜培養12h。次日，提取質粒，提取步驟按照試劑盒說明書進行；而后利用內切酶Hind
III和Xba I進行酶切鑒定。經酶切后，T-MSTl所含片段大小為283bp，剩余質粒片段為3819bp，見圖2，與預測結果相同。最后對重組子T-MSTl測序；經測序，利用Vector NTI軟件與GenBank中相應的基因序列(登錄號為AF271360.1)進行比對，本發明所擴增的基因序列與GenBank中相應的MSTl基因序列完全一致。結果表明，成功構建了 MSTl基因的重組質粒。獲得陽性重組質粒后測定質粒0D260和0D280值，并按照10D=50 u g/ml計算質粒質量濃度，經測得質粒濃度為107. 4ng/u I0實施例4檢測MSTl的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的建立以10倍遞減稀釋的標準品質粒(IO6拷貝/反應 IO1拷貝/反應)為模板，采用實施例2的引物，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。每個標準品設3個重復。RT-PCR總反應體系為20iU，包括IOu liQ SYBR Green Supermix、上游下游引物各0. 5 yl、IcDNA和8 u I雙蒸水。熒光定量PCR反應條件為50°C UNG孵育2min ;95°C初始變性30s ;95°C變性5s，55°C退火20s，72°C延伸30s，84°C數據采集ls，40個循環；72°C最終延伸lOmin。然后對擴增產物(75°C 95°C )進行溶解曲線分析。反應結束后，系統自動生成溶解曲線(見圖3)及標準曲線(見圖4、圖5)。圖3的熔解曲線結果顯示MSTl特異性條帶為單峰，且峰值單一，說明產物特異。
由圖4和圖5可知，⑴總體看所有曲線拐點清楚，指數期明顯，擴增曲線整體平行性好；(2)相鄰濃度標準品擴增曲線與曲線之間的間距都十分接近理想值，說明擴增效率較高；(3)低濃度樣本擴增曲線指數期明顯，一方面不易出現假陰陽性誤判，另一方面說明靈敏度高；(4)起始模板濃度與循環數(Ct值)之間呈良好的線性關系，擴增曲線的Ct值范圍都大致在10 30范圍內，保證了定量準確性。成功建立了 MSTl基因SYBR Green I實時熒光PCR定量標準曲線方程y=-0. 24x+8. 45，R2=O. 997。其線性范圍可達6個數量級，Ct值和起始模板拷貝數的相關性均較好(R2=O. 997)，實驗建立的克隆質粒標準品檢測范圍寬、靈敏度高，IO1數量級拷貝數的初始模板也可準確檢測到，定量結果可靠。實施例5MST1熒光定量PCR檢測方法的特性評價1、靈敏度評價
取質粒標準品1. OX IO1 1. OX 101°拷貝/ ill，共10個濃度梯度作為模板進行實時熒光PCR檢測。當質粒標準品濃度為1. OX IO6 1. OX IO1拷貝/iil時，根據系統自動生成的動力學曲線觀察，所有曲線均呈平滑的指數生長，且曲線間距為3. 32，說明質粒模板以10倍遞減稀釋；進一步分析模板1.0X101拷貝數即最低質粒模板拷貝數時，該曲線仍然與此前5個高拷貝模板質粒所得到的擴增曲線相一致，即該模板在1. OX IO1拷貝/yl時仍呈特異性擴增的指數生長期，由此表明通過該方法，在模板僅有1. OX IO1拷貝/Ul時，仍可通過該方法對細胞或組織表達的mRNA進行精確定量。在該PCR檢測體系中，靶基因擴增反應的Ct值與模板濃度之間均存在良好的線性關系，相關系數為0. 997。圖1和圖2比較發現，本發明建立的實時熒光PCR檢測體系對MSTl質粒標準品的檢測靈敏度比普通PCR方法高100倍。2、特異性評價將本發明擴增的MSTl基因序列送上海生物工程技術有限公司測序，結果顯示，與目的基因同源性為100%。同時，發明人將此序列在Genbank中進行比對，發現本序列與小鼠(GenBank 號AF271360.1),人(GenBank 號NM 006282. 2)，獼猴屬(GenBank 號NM_001168677.1)，牛(GenBank 號NM_001015602.1)的覆蓋率分別為 100%，100%，100% 和98%。按照實施例4的方法，用優化了的real-time PCR檢測包括MSTl在內的哺乳動物相關激酶的其他蛋白酶，評價本發明的實時熒光PCR體系的特異性。用實施例3制得的MSTl基因組質粒標準品為陽性對照，結果除陽性對照擴展外，其他蛋白酶均出現溶解曲線，說明其余檢測結果均為陰性。可見本發明的檢測MSTl的實時熒光PCR方法的特異性為100%。實施例6檢測動物細胞中的MSTl以本發明實施例3構建的標準質粒為陽性對照，以雙蒸水為陰性對照，利用實施例4建立的熒光定量方法，用PrP多肽對N2a細胞樣品進行攻毒，同時設立對照組細胞，24小時后用本發明熒光定量PCR方法進行檢測，檢測結果為攻毒組細胞和對照組細胞CT值分別為7. 76967和8. 28667，經計算后發現，用PrP多肽對N2a細胞樣品進行攻毒，與未攻毒的對照組N2a細胞樣品相比，MSTl的mRNA表達量提高了1. 43097倍。說明本發明的SYBRGreen I實時熒光定量PCR方法能夠定量檢測MSTl在體內的表達量變化。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳細的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做 的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.用于檢測MSTl基因的靶序列，其特征在于，其含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述靶序列的重組質粒。
3.權利要求2所述的重組質粒作為標準陽性參考物質用于哺乳動物MSTl基因的分子生物學檢測的用途。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述分子生物學檢測為PCR或熒光定量PCR 檢測。
5.可特異性擴增MSTl基因的引物，其特征在于，具有如SEQIDNO. 2和SEQ ID NO. 3 PJf 示的核苷酸序列，所述的MSTl基因含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
6.一種檢測MSTl基因的方法，其特征在于，從動物組織或細胞中提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，利用權利要求5所述的引物進行實時熒光定量PCR，同時設立無模板對照和陽性對照，根據擴增曲線判定結果。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其20μ L總工作體系為試劑體積μ 終濃度SYBR Green Supennix 10.0 I χ上游鑰物0.5 5μΜ下游引物0.5 5μΜcDNA 模板1.0去離子水
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其反應程序為50°CUNG酶孵育2min，95°C 變性30sec ;95°C變性5sec, 55°C退火20sec, 72°C延伸30sec，84°C數據采集Is, 40個循環； 72°C延伸 IOmin0
9.一種檢測MSTl基因的試劑盒，其特征在于，含有權利要求5所述的引物。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，還包括熒光定量反應液、陰性模板、陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為權利要求2所述的重組質粒。
全文摘要
本發明提供了用于MST1基因定量檢測的標準質粒及試劑盒，還提供了檢測MST1基因的引物，其具有如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。利用本發明的引物摸索出合適的實時熒光定量PCR反應體系與反應條件，實現對MST1基因的定量檢測。本發明的檢測方法及其試劑盒具有檢測準確，靈敏度高、特異性強，簡便快速的優點，能夠很好地檢測哺乳動物組織或細胞中MST1基因的表達量，為進一步研究MST1基因在哺乳動物系統中的調控作用提供有效工具。
文檔編號C12N15/11GK103014032SQ20121049488
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者楊利峰, 趙德明, 潘博, 尹曉敏, 王進, 王繼宏, 王運盛, 周向梅, 趙化粉 申請人:中國農業大學