專利名稱：艱難梭菌腸毒素a、b雙重熒光定量pcr檢測方法及檢測用試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，特別是涉及艱難梭菌腸毒素A、B的檢測方法及檢測用試劑盒。
背景技術：
艱難梭菌(Clostridium difficile)是具有芽胞結構的革蘭氏陽性厭氧桿菌,是公認的院內感染和抗生素相關性腹瀉最重要的病原體，通過釋放細胞毒素可引起偽膜性腸炎，甚至可致死。艱難梭菌可釋放多種毒素，其中以A、B兩種毒素為主，這兩種毒素是導致腹瀉與腸炎癥的主要原因。艱難梭菌實驗診斷方法主要依靠傳統的厭氧培養、細胞毒性試驗、菌體及毒素抗 原檢測。其中，細菌厭氧培養和細胞毒素中和實驗是目前實驗室檢測艱難梭菌的“金標準”。細菌培養是傳統檢測方法中最靈敏的方法，但是必須進行二次檢測以判斷產物毒素是否存在，并且需要進行細胞毒素試驗以驗證是否為產毒艱難梭菌。該試驗的特異性和靈敏性較好，但是條件設備要求高，還需要專業的細胞培養技術和連續的組織培養，僅培養時間至少需要24h以上，影響臨床做出及時診斷和治療。因此傳統方法在日常監控、暴發事件病原體確定和溯源追蹤等方面存在著瓶頸。隨著免疫學和分子生物學的發展，近二十年來一系列的快速檢測方法被應用到微生物的檢測和鑒定中。這些快速檢測方法能夠在48小時內得到結果。現階段研究較為深入的快速檢測方法包括酶聯免疫吸附(ELISA)。谷氨酸脫氫酶(GDH)為艱難梭菌表面大量表達的抗原性酶蛋白，但免疫酶學試驗無法區分艱難梭菌產毒株與非產毒菌株。另外，目前商品化免疫學的艱難梭菌毒素診斷產品只能檢測A毒素，這導致臨床A-B+艱難梭菌引發的許多患者漏診，使A-B+型艱難梭菌引起的嚴重感染和爆發報道增多。
發明內容
本發明要解決的技術問題之一是提供一種艱難梭菌腸毒素A、B雙重熒光定量PCR檢測方法，它可以快速、簡便地檢測艱難梭菌，且檢測的靈敏性和特異性高。為解決上述技術問題，本發明的艱難梭菌腸毒素A、B雙重熒光定量PCR檢測方法，步驟包括I)提取待測樣品DNA ；2)以待測樣品DNA為模板，進行熒光定量PCR反應；3)對PCR反應中每個循環產物的熒光進行檢測，根據熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度，判斷待測樣品中是否含有艱難梭菌腸毒素A、B。本發明要解決的技術問題之二是提供用于上述方法的特異性擴增艱難梭菌腸毒素A基因的引物對。該引物對的上游引物具有如SEQ ID No: I所示的序列或其互補序列，下游引物具有如SEQ ID No:2所示的序列或其互補序列。
本發明要解決的技術問題之三是提供用于上述方法的特異性擴增艱難梭菌腸毒素B基因的引物對。該引物對的上游引物具有如SEQ ID No:4所示的序列或其互補序列，下游引物具有如SEQ ID No:5所示的序列或其互補序列。本發明要解決的技術問題之四是提供用于上述方法的特異性檢測艱難梭菌腸毒素A的熒光探針。該探針具有如SEQ ID N0:3所示的序列，序列的兩端分別帶熒光基團和淬滅基團。本發明要解決的技術問題之五是提供用于上述方法的特異性檢測艱難梭菌腸毒素B的突光探針。該探針具有如SEQ ID N0:6所不的序列,序列的兩端分別帶突光基團和淬滅基團。本發明要解決的技術問題之六是提供用于上述檢測方法的試劑盒。該試劑盒包括有上述特異擴增艱難梭菌腸毒素A、B基因的引物對和特異檢測艱難梭菌腸毒素A、B的熒光探針。與現有檢測方法相比，本發明的雙重熒光定量PCR檢測方法，不僅能檢測艱難梭菌腸毒素A，而且能同時檢測艱難梭菌腸毒素B，從而有助于臨床對由A-B+艱難梭菌引發的患者的及時診斷，減少A-B+型艱難梭菌引起的嚴重感染。另外，本發明的檢測方法不僅操作簡便、快速，而且檢測的靈敏性和特異性高，可應用于艱難梭菌引起突發疫情的實驗室應 急檢測。
圖I是艱難梭菌腸毒素A的熒光qPCR擴增曲線圖。曲線I至5依次為100000、10000、1000、100、10 拷貝數。圖2是艱難梭菌腸毒素A的熒光qPCR定量標準曲線。圖3是艱難梭菌腸毒素B的熒光qPCR擴增曲線圖。曲線I至5依次為100000、10000、1000、100、10 拷貝數。圖4是艱難梭菌腸毒素B的熒光qPCR定量標準曲線。
具體實施例方式為對本發明的技術內容、特點與功效有更具體的了解，現結合附圖，詳述如下實施例II.實驗材料I. I細菌株與待測樣品腸道腺病毒40/41、星狀病毒和札如病毒的陽性核酸(均通過基因測序鑒定)來源于江蘇省疾病控制預防中心。待測樣品來源于近期江蘇省患者的糞便樣本，樣本采集后帶冰運送到實驗室。I. 2引物與探針從美國的NCBI基因庫上下載世界各地的艱難梭菌腸毒素A、B基因序列，對其進行同源性比較，在對應病毒基因組的保守基因區設計特異性引物與Taqman熒光探針，具體序列如下針對腸毒素A基因的特異性引物和探針
上游引物Toxa-FP :TTTTATGCCAGAAGCTCGCT (SEQ ID No: I)下游引物Toxa-RP :AATCTGATGCTTTTAAAGTTTTTTC (SEQ ID No:2)特異性探針Toxa-P :FAM-AGTGGTCCAGGAGCTTATGCATCAGC-BHQ1 (SEQ ID No:3)針對腸毒素B基因的特異性引物和探針上游引物Toxb-FP :ACTTTGGAATGATGGTATCTGGA (SEQ ID No:4)
下游引物Toxb-RP :AATTGAAGCAGCTCCACCAT (SEQ ID No:5)特異性探針Toxb-P :HEX-CTGGATTTGTGACTGTAGGCGATGA-BHQ1 (SEQ ID No:6)上述弓I物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。2.實驗方法2. I提取待測樣品DNA采用上海輝睿生物科技有限公司的DNA Mini KU，按試劑盒說明書提取待測樣品的DNA，得到102ng/ μ L細菌DNA，儲以備用。2. 2 熒光 qPCR 反應以待測樣品DNA為模板，選用上海輝睿生物科技有限公司的HR qPCR Master Mix(Code =HR-RTO 1-50)為緩沖液，進行qPCR (實時熒光定量聚合酶鏈式擴增反應)反應，分別對艱難梭菌腸毒素A、B的基因進行擴增。PCR 反應體系為 25 μ 1，其中2XHR qPCR Master Mix 12. 5 μ 1，上、下游引物(lOymol/L)各 I μ l,10ymol/L 探針 O. 5 μ 1，DNA 模板 2-3 μ 1，DEPC 水補足 25 μ I。PCR反應條件為95°C 5min ;然后95°C 10s，55°C 40s，共進行40個循環。在PCR反應中每個循環的55°C用ABI7500熒光檢測系統對qPCR反應產物進行雙重熒光檢測。熒光檢測模式選擇FAM、VIC，熒光基線調整取3-15個循環的熒光信號平均值，閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照品的最高點。2. 3結果判定根據熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度，判斷待測樣品是否含有艱難梭菌腸毒素A、B。若熒光檢測結果呈典型的擴增曲線，如圖1、3所示，判斷為陽性，所測樣品含有對應的腸毒素；若沒有典型的擴增曲線，判斷為陰性，所測樣品不含對應的腸毒素。3.熒光qPCR特異性、敏感性和重復性試驗3. I特異性實驗選擇腸道腺病毒、星狀病毒和札如病毒的陽性核酸(均通過基因測序鑒定)和來源于近期江蘇省腹瀉患者的臨床糞便標本，對上述樣本提取核酸，用本發明的雙重熒光qPCR方法進行檢測，驗證方法的特異性。結果顯示，近期采集的腹瀉患者的糞便標本檢測出陽性反應，而其他腸道細菌則沒有交叉反應，表明本發明建立的雙重熒光qPCR方法對艱難梭菌腸毒素A、B具有較好的特異性。3. 2敏感性實驗用梯度濃度的標準品DNA溶液，在相同條件下進行PCR擴增反應，以標準品DNA溶液拷貝濃度的對數值為橫坐標，標準品Ct值為縱坐標，繪制標準曲線。根據樣品DNA測得的Ct值，對照標準曲線，獲得樣品DNA的拷貝濃度。標準品的序列如下Toxa
ttttatgccagaagctcgctccacaataagtttaagtggtccaggagcttatgcatcagcttactatgatttcataaatttacaagaaaatactatagaaaaaactttaaaagcatcagatt (SEQ ID No:7)Toxb actttggaatgatggtatctggattaatatatattaatgatteattatattattttaaaccaccagtaaataatttgataactggatttgtgactgtaggcgatgataaatactactttaatccaattaatggtggagctgcttcaatt (SEQ IDNo:8)對已標定拷貝數(2X108COpieS/ml)的腸道腺病毒、星狀病毒和札如病毒，分別稀釋100000、10000、1000、100、10倍后，平行進行熒光qPCR反應。結果顯示，熒光qPCR方法檢測敏感性達到2X 10Copies/ml。3.3重復性實驗取濃度為2X107Copies/ml的艱難梭菌，按10倍梯度稀釋成3個不同的濃度，對 每一個濃度的病毒稀釋液作5次重復檢測，得到的Ct值計算標準差，驗證方法的重復性。結果顯示，不同核酸濃度各自的檢測Ct值標準差在O. 10 O. 31之間，具有較好的重復性(見表I)。表I熒光RT-PCR法檢測艱難梭菌的重復性試驗
權利要求
1.艱難梭菌腸毒素A、B雙重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取待測樣品DNA; 2)以待測樣品DNA為模板，進行熒光定量PCR反應； 3)對PCR反應中每個循環產物的熒光進行檢測，根據熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度，判斷待測樣品中是否含有艱難梭菌腸毒素A、B。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，PCR反應體系為2XHRqPCR MasterMixl2. 5iil，10iimol/L 上、下游引物各 I yl，10 y mol/L 熒光探針 0. 5 yl，DNA 模板2-3 u I, DEPC 水補足 25 u I0
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為95°C5min ;然后95°C10s，55で40s，共40個循環。
4.用于特異擴增艱難梭菌腸毒素A基因的引物對，其特征在于，該引物對的上游引物具有如SEQ ID No: I所示的序列或其互補序列，該引物對的下游引物具有如SEQ ID No:2所示的序列或其互補序列。
5.用于特異擴增艱難梭菌腸毒素B基因的引物對，其特征在于，該引物對的上游引物具有如SEQ ID No:4所示的序列或其互補序列，該引物對的下游引物具有如SEQ ID No:5所示的序列或其互補序列。
6.用于特異檢測艱難梭菌腸毒素A基因的熒光探針，其特征在干，該探針具有如SEQIDN0:3所示的序列，序列的兩端分別帶熒光基團和淬滅基團。
7.用于特異檢測艱難梭菌腸毒素B基因的熒光探針，其特征在干，該探針具有如SEQIDN0:6所示的序列，序列的兩端分別帶熒光基團和淬滅基團。
8.用于權利要求1-3任何ー項所述檢測方法的試劑盒，其特征在于，包括權利要求4和5的引物對，以及權利要求6和7的探針。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括用作陽性質控品的艱難梭菌腸毒素A、B基因標準品。
10.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括脫氧三磷酸核苷混合物、氯化鎂、DNA聚合酶。
全文摘要
本發明公開了一種艱難梭菌腸毒素A、B雙重熒光定量PCR檢測方法，步驟包括1)提取待測樣品DNA；2)以待測樣品DNA為模板，進行熒光定量PCR反應；3)對PCR反應中每個循環產物的熒光進行熒光，根據熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度，判斷待測樣品中是否含有艱難梭菌腸毒素A、B。本發明還公開了用于上述方法的特異引物、熒光探針和檢測用試劑盒。本發明的檢測方法操作簡便、快速，能同時檢測艱難梭菌腸毒素A、B，且檢測靈敏性和特異性高，可應用于艱難梭菌引起突發疫情的實驗室應急檢測。
文檔編號C12N15/11GK102952886SQ201210496620
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者邵景東, 王毅謙, 李輝, 傅春玲, 吳福平, 郭旸 申請人:中華人民共和國張家港出入境檢驗檢疫局