專利名稱：人胚中腦來源的神經干細胞體外定向分化為多巴胺能神經元方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種神經干細胞體外定向分化為多巴胺能神經元方法。
背景技術：
神經干細胞具有廣闊的臨床應用前景，細胞替代治療可以治療帕金森氏病、亨廷頓氏舞蹈病和阿耳茨海默氏病等神經退行性疾病以及腦卒中、腦外傷等引起的神經功能缺失，神經干細胞作為基因治療的載體，可以治療帕金森氏病、粘多糖病和顱內腫瘤等。但是，神經干細胞的研究目前尚處于初期階段，有許多問題還沒有得到解決，如神經干細胞如何在體內和體外定向分化為我們需要的某種特定的神經細胞，體外分離得到的神經干細胞與體內的是否有差異等等，這些都需要進一步的研究。神經干細胞的發現和研究是近十年來神經生物學領域最重要的進展之一，近年來不斷有實驗發現人胚腦和其它哺乳類動物一樣存在具有自我更新和廣泛分化潛能的神經干細胞，如何在體外通過安全有效的方法將干細胞定向誘導分化為多巴胺能神經元，并盡可能提高其分化比例，將為干細胞最終應用于臨床治療帕金斯氏病提供有力的理論支持。
發明內容
本發明將取自胚齡10-13周水囊引產的新鮮人胚胎中分離出中腦組織，培養出神經干細胞，然后將兩種安全的誘導分化方法進行組合，依次對干細胞進行多巴胺能神經元方向的分化，并用免疫組化方法予以鑒`定，進行細胞計數后明確該體外誘導分化方法的效率。具體的方法步驟包括S1:原代細胞的分離培養取胚齡10-13周水囊引產的新鮮人胚胎，無菌條件在顯微鏡下分離出胚胎中腦組織，剝離腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，洗去血細胞，用細吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開，離心洗滌后吹打制成懸液，經200目尼龍濾網過濾，制成單細胞懸液，加入含B27 (1:50) (GibcoBRL)和EGF(Serotec) 20ng/mL、bFGF-2 (Chemicon) 20ng/mL無血清培養基培養，臺盼藍染色計數活細胞，調整活細胞濃度為I X 105/mL,將原代細胞種植于25平方厘米培養瓶中(8mL細胞懸液/瓶)，37°C，5%C02條件下靜置培養；S2 :神經干細胞的傳代培養原代細胞培養出現大量懸浮克隆球后進行傳代培養，用O. 25%胰酶37°C消化15-30min(也可機械切割分離或吹打)，制成單細胞懸液，用含B27和EGF、bFGF的無血清培養基將細胞懸液按I X 106/mL濃度傳代接種于培養瓶，370C，5%C02條件下靜置培養，直至次代克隆球產生，平均5-7天傳代一次；S3 :含抗壞血酸培養液誘導分化將不同代數的神經球體外培養七天后種植入含不同濃度抗壞血酸培養基(DMEM/F12+B27+AA)的培養皿中；S4 :正常成人腦脊液分化培養在以上含抗壞血酸培養液分化培養后3天，向培養基中加入正常成人腦脊液，比例為DMEM/F12+B27+30%腦脊液，觀察其生長分化情況，在培養10天后進行免疫細胞化學染色；S5 :免疫細胞化學染色將含有分化細胞的培養板取出，4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗，每次5分鐘，O. 25%TritonX-100處理15min (破膜)，PBS洗三次，每次5min，羊血清封閉15min，加入兔抗人TH抗體(一抗)37°C處理I小時，PBS沖洗三次，每次5min，后加入生物素結合的羊抗兔IgG ( 二抗)37°C孵育45min，PBS洗三次，每次5min，滴加SABC后室溫下處理20min，PBS洗三次，每次5min，新鮮配制的DAB顯色劑顯色15min，PBS洗三次，每次5min，蘇木精復染，光鏡下觀察；S6 :細胞計數免疫細胞化學染色TH ( + )的細胞代表多巴胺能神經元，蘇木精復染，藍色細胞核數代表總細胞數。倒置顯微鏡下(20 X )對分化的細胞隨機選擇六個獨立視野計數TH ( + )細胞，及總細胞數；每次至少做四個獨立實驗。殘留在神經球中的神經干細胞因聚合密集，難以計數，排除在外；本發明的體外將神經干細胞定向分化為多巴胺能神經元的方法，先將無血清培養條件下的神經干細胞植入特定濃度的抗壞血酸培養基中誘導分化，然后加入一定濃度的正常成人腦脊液，利用腦脊液中現存的各種誘導因子進一步加速干細胞向神經元方向分化。該方法較前所報道的各種其他誘導方法明顯提高多巴胺能神經元的誘導成功比例。
通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發明的體外神經干細胞定向分化為多巴胺能神經元方法步驟流程圖。
具體實施例方式主要實驗儀器超凈工作臺(蘇州蘇凈安泰公司)、倒置顯微鏡(01ympusCK40)，熒光顯微鏡(Olympus BX51)，CO2培養箱(REVCO)，75cm2培直徑培養皿(Corning, NY)。細胞培養試劑和培養液的配制DMEM/F12、B27 (Gibco)、EGF(Serotec)和 bFGF(ChemiconInternational)、胎牛血清(Gibco)。有血清培養基DM EM/F12(1 l)+5%Fcs ;無血清培養基 DMEM/F12(1 1)+B27 (1:50 )+EGF (20ng/mL) +bFGF (20ng/mL) 免疫組化抗體一抗為兔抗人NF抗體(Sigma)，兔抗人GFAP抗體(Sigma),兔抗人TH抗體(Sigma), 二抗為FITC羊抗兔突光二抗(Chemicon )。所述人胚中腦來源的神經干細胞體外定向分化為多巴胺能神經元方法包括如下步驟S1:原代細胞的分離培養取胚齡10-13周水囊 引產的新鮮人胚胎，無菌條件在顯微鏡下分離出胚胎中腦組織，剝離腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，洗去血細胞，用細吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開，離心洗滌后吹打制成懸液，經200目尼龍濾網過濾，制成單細胞懸液，加入含B27 (1:50) (GibcoBRL)和EGF(Serotec) 20ng/mL、bFGF-2 (Chemicon) 20ng/mL無血清培養基培養，臺盼藍染色計數活細胞，調整活細胞濃度為I X 105/mL,將原代細胞種植于25平方厘米培養瓶中(8mL細胞懸液/瓶)，37°C，5%C02條件下靜置培養；S2 :神經干細胞的傳代培養原代細胞培養出現大量懸浮克隆球后進行傳代培養，用O. 25%胰酶37°C消化15-30min(也可機械切割分離或吹打)，制成單細胞懸液，用含B27和EGF、bFGF的無血清培養基將細胞懸液按I X 106/mL濃度傳代接種于培養瓶，370C，5%C02條件下靜置培養，直至次代克隆球產生，平均5-7天傳代一次；S3 :含抗壞血酸培養液誘導分化將不同代數的神經球體外培養七天后種植入含不同濃度抗壞血酸培養基(DMEM/F12+B27+AA)的培養皿中；S4 :正常成人腦脊液分化培養在以上含抗壞血酸培養液分化培養后3天，向培養基中加入正常成人腦脊液，比例為DMEM/F12+B27+30%腦脊液，觀察其生長分化情況，在培養10天后進行免疫細胞化學染色；S5 :免疫細胞化學染色將含有分化細胞的培養板取出，4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗，每次5分鐘，O. 25%TritonX-100處理15min (破膜)，PBS洗三次，每次5min，羊血清封閉15min，加入兔抗人TH抗體(一抗)37°C處理I小時，PBS沖洗三次，每次5min，后加入生物素結合的羊抗兔IgG ( 二抗)37°C孵育45min，PBS洗三次，每次5min，滴加SABC后室溫下處理20min，PBS洗三次，每次5min，新鮮配制的DAB顯色劑顯色15min，PBS洗三次，每次5min，蘇木精復染，光鏡下觀察；S6 :細胞計數免疫細胞化學染色TH ( + )的細胞代表多巴胺能神經元，蘇木精復染，藍色細胞核數代表總細胞數。倒置顯微鏡下(20X )對分化的細胞隨機選擇六個獨立視野計數TH ( + )細胞，及總細胞數；每次至少做四個獨立實驗。殘留在神經球中的神經干細胞因聚合密集，難以計數 ，排除在外；實驗結果及分析如下1.人胚中腦神經干細胞體外分化產生多巴胺能神經元隨傳代次數增加而逐漸減少。在原代神經干細胞(Ptl)分化十天后，免疫細胞化學染色示TH(+)細胞占總細胞比例約5. 65%土1. 39%，體外培養7天后傳代得到P1代神經干細胞分化十天后免疫細胞化學染色是TH ( + )細胞占總細胞比例降至1. 56%±0. 37%。隨著體外培養時間及傳代次數的增加，TH(+ )細胞也迅速下降，至第三代以后TH ( + )細胞減少至O. 01%。2.不同濃度的抗壞血酸增加原代神經干細胞分化細胞中TH ( + )細胞的比例作用不同。10_4M濃度的抗壞血酸是所誘導出的TH(+)細胞比例最高，達到12. 72%±1. 29%，遠優于其它濃度的抗壞血酸。3.早期加入抗壞血酸對神經干細胞的誘導作用明顯高于后期，在分化起始階段(三天內)即加入抗壞血酸誘導十天后免疫化學染色TH ( + )細胞的比例達12. 80%，而于分化一定時間(五天)后再加入同樣濃度的抗壞血酸十天后免疫化學染色TH ( + )細胞的比例為8. 90%, 二者有顯著性差異(P〈0. 05)。4.抗壞血酸結合成人腦脊液協同誘導人胚中腦神經干細胞向多巴胺能神經元分化作用要優于單一的誘導方案，聯合誘導的TH ( + )細胞的比例平均達到14. 73%，優于抗壞血酸的誘導比例12. 80%，優于成人腦脊液的誘導轉化率8. 76% (P〈0. 05)。由于人們對神經干細胞的認識還不夠全面和深入，目前神經干細胞尚無準確的定義，一般認為神經干細胞終身具有自我更新能力和多分化潛能，能通過對稱和不對稱分裂進行增殖，損傷或疾病能刺激干細胞分化。在體外條件下，它能分化成神經元，星形膠質細胞，少突膠質細胞，移植入動物體內它能遷移，增殖，與宿主細胞形成突觸聯系。基于這些特點，神經干細胞成為移植入腦內進行細胞替代治療和轉基因治療，從而達到神經修復的最有前景的細胞來源之一。然而，神經干細胞要想廣泛成功應用于臨床治療，必須要解決的首要難題是神經干細胞的分化尤其是定向分化問題。神經干細胞體外誘導分化一是在撤離有絲分裂原后的自然分化，這主要是其自身分泌的內源性因子起作用；第二是研究外部因子對神經干細胞分化的影響，目前研究比較多的主要有血清蛋白，全反式維甲酸，一些造血因子及某些神經營養因子如BDNF、CNTF對神經干細胞的體外分化也有影響。另有人將神經干細胞與其他組織共培養誘導來誘導神經干細胞想特定神經元分化獲得成功，這說明局部微環境在神經干細胞分化中起著重要作用。神經細胞移植是神經修復的一種極有前景及行之有效的方法。曾有用胚胎中腦細胞移植治療帕金森氏病患者獲得癥狀明顯改善的報道，PET示移植細胞存活并發揮了作用，此方法的缺點是胚胎來源不足 ，應用胚胎涉及倫理問題，且胎腦組織含有多量可表達MHC的腦膜等可導致不必要的免疫排斥反應。本發明采用無任何毒性的抗壞血酸及正常成人新鮮采集的腦脊液進行聯合誘導胚胎中腦來源的神經干細胞，獲得了向多巴胺能神經元最大比例分化的能力，為不久的將來神經移植治療帕金森氏病找到了一種可靠的細胞來源。本發明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。
權利要求
1.一種將人胚中腦來源的神經干細胞體外定向分化為多巴胺能神經元的方法，其包括如下步驟51:原代細胞的分離培養取胚齡10-13周水囊引產的新鮮人胚胎，無菌條件在顯微鏡下分離出胚胎中腦組織，剝離腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，洗去血細胞，用細吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開，離心洗滌后吹打制成懸液，經200目尼龍濾網過濾，制成單細胞懸液，無血清培養基培養，臺盼藍染色計數活細胞，調整活細胞濃度為IXlO5/ mL,將原代細胞種植于25平方厘米培養瓶中，37°C，5%C02條件下靜置培養；52:神經干細胞的傳代培養原代細胞培養出現大量懸浮克隆球后進行傳代培養，用胰酶消化制成單細胞懸液，無血清培養基將細胞懸液按I X IOVmL濃度傳代接種于培養瓶， 370C，5%C02條件下靜置培養，直至次代克隆球產生，平均5-7天傳代一次；53:含抗壞血酸培養液誘導分化將不同代數的神經球體外培養七天后種植入含不同濃度抗壞血酸培養基(DMEM/F12+B27+AA)的培養皿中；54:正常成人腦脊液分化培養在以上含抗壞血酸培養液分化培養后3天，向培養基中加入正常成人腦脊液，比例為DMEM/F12+B27+30%腦脊液，觀察其生長分化情況，在培養10 天后進行免疫細胞化學染色；55:免疫細胞化學染色將含有分化細胞的培養板取出，4%多聚甲醛固定15min，PBS 沖洗，TritonX-1OO處理，羊血清封閉，加入兔抗人TH抗體(一抗)37°C處理I小時，PBS沖洗后加入生物素結合的羊抗兔IgG(二抗)37°C孵育45min，PBS沖洗后滴加SABC，最后DAB 顯色，蘇木精復染，光鏡下觀察；56:細胞計數免疫細胞化學染色TH ( + )的細胞代表多巴胺能神經元，蘇木精復染，藍色細胞核數代表總細胞數。倒置顯微鏡下(20X )對分化的細胞隨機選擇六個獨立視野計數TH ( + )細胞，及總細胞數；每次至少做四個獨立實驗。殘留在神經球中的神經干細胞因聚合密集，難以計數，排除在外。
2.如權利要求1所述的一種將人胚中腦來源的神經干細胞體外定向分化為多巴胺能神經元的方法，其中所述步驟I細胞的無血清培養基DMEM/F12中加入B27 (1:50)和 EGF20ng/mL、bFGF20ng/mL。
3.如權利要求1所述的一種將人胚中腦來源的神經干細胞體外定向分化為多巴胺能神經元的方法，其中所述步驟3不同濃度抗壞血酸增加原代神經干細胞分化細胞中TH(+) 細胞的比例作用不同，10_4M濃度時所誘導的TH(+)細胞比例最高。
4.如權利要求1所述的一種將人胚中腦來源的神經干細胞體外定向分化為多巴胺能神經元的方法，其中所述步驟6細胞計數結果表明，早期加入抗壞血酸對神經干細胞的誘導作用明顯高于后期，在分化起始階段(三天內)即加入抗壞血酸誘導的最終TH(+)細胞比例最聞。
全文摘要
本發明提出一種將人胚中腦來源的神經干細胞體外定向分化為多巴胺能神經元的方法，其步驟包括原代細胞的分離培養；神經干細胞的傳代培養；含抗壞血酸培養液誘導分化培養；正常成人腦脊液分化培養；免疫組化染色檢測；細胞計數。本發明的體外誘導形成多巴胺能神經元的方法，先采用一定濃度的抗壞血酸誘導分化，后采用正常成人腦脊液進一步使胚胎中腦來源的干細胞向多巴胺能神經細胞方向分化，可以獲得最高比例的多巴胺能神經元，這為體內外更有效地產生DA神經元，以用于臨床移植治療帕金森氏病提供新的思路。
文檔編號C12N5/0793GK103045538SQ201210505420
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月2日 優先權日2012年12月2日
發明者徐杰, 房文峰, 朱愛華 申請人:吳衛江