專利名稱：一種高產延胡索酸米根霉工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種高產延胡索酸米根霉，特別是一種通過代謝工程手段過量表達ScPYCl基因提高胞內丙酮酸羧化酶活性來強化三羧酸循環的回補途徑，從而調控碳代謝流從丙酮酸進入TCA還原途徑，實現延胡索酸過量積累的方法。
背景技術：
延胡索酸(fumaric acid)是一種重要的二元羧酸,廣泛用于樹酯合成、食品添加齊U、飼料添加劑、醫藥、航空材料等工業生產中。米根霉(Rhizopus deIemar)作為大量積累延胡索酸的主要微生物之一，廣泛用于有機酸、酶、抗體、低膽固醇的生產。R. delemar胞內存在TCA氧化途徑及胞液中TCA還原途徑。丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下，與CO2相互作用形成草酰乙酸。同時，作為TCA氧化途徑中間代謝產物的草酰乙酸，在菌體生長過程中作為前體物質用于菌體物質的合成。當微生物生長環境中氮源成為菌體生長的限制條件時， 菌體停止生長，葡萄糖代謝過程中的CO2固定途徑仍然繼續作用，此時C4化合物積累。在非菌體生長時期，Imol葡萄糖分解代謝,在丙酮酸羧化酶作用下固定2mol CO2,形成2mol延胡索酸。然而，如果米根霉菌體代謝只有TCA還原途徑，則無法合成供物質運輸及維持機體正常生理代謝的ATP，因此，延胡索酸合成過程伴隨著TCA氧化途徑。此外，研究表明米根霉新陳代謝，碳代謝流從丙酮酸節點流向TCA氧化途徑的代謝通量遠超過流向TCA還原途徑。因此，通過分子改造或者改變培養條件調節碳代謝流向過量積累延胡索酸成為眾多研究者探討的熱點。但是，針對米根霉的基因操作技術及遺傳改造技術相對薄弱，且米根霉是多核細胞，重組細胞有絲分裂不穩定。因此，針對米根霉外源基因的表達直到近10年才有一點突破，而碳代謝流的細節至今仍不明確。
發明內容
本發明要解決的技術問題是一種高產延胡索酸米根霉，通過過量表達丙酮酸羧化酶基因，強化胞液中TCA還原途徑，增強丙酮酸節點流向胞液中TCA還原途徑的碳代謝通量，實現延胡索酸過量積累的方法。所述米根霉(R. delemar)過量表達外源丙酮酸羧化酶基因，所述丙酮酸羧化酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種獲得所述米根霉的方法，具體步驟如下I)根據米根霉(R. delema)胞內蛋白的表達與啟動子直接相關，而與拷貝數無關，以NCBI公布的Rhizopus oryzae AF282846、AF282847序列，分別化學全合成丙酮酸脫羧酶基因的啟動子與終止子片段；2)以NCBI公布的ΝΜ_001180927.1)序列，采用化學全合成方法合成丙酮酸羧化酶
基因編碼區；3)將步驟I)和2)得到的三段片段進行融合，形成完整的丙酮酸羧化酶基因表達框；
4)將步驟3)獲得的表達框克隆到PRS303H載體，轉化米根霉懸浮孢子后得到重組菌。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種應用所述米根霉發酵生產延胡索酸的方法，以米根霉為出發菌株，接種到產孢子培養基中，30° C培養5-7天，至分生孢子成熟；無菌水洗下孢子，稀釋到IO6個/mL;以4%的體積比轉接孢子懸浮液至種子培養基，30° C，200rpm培養30h ；以10%的體積比轉接前培養種子至發酵培養基，30° C，200rpm培養 72h。產孢子培養基PDA培養基。種子培養基成分為(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨6，碳酸鈣6。發酵培養基成分為(g/L):葡萄糖80，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 O. 3，MgSO4 · 7H20 O. 4，ZnSO4 · 7H20 O. 044，FeSO4 · 7H20 O. 01，CaCO3 80，滅菌后加甲醇 15mL。
細胞干重測定基于延胡索酸鈣的低溶解度，發酵液沸水浴至澄清后，添加去離子水至無晶體析出，取發酵液20mL，8000g離心IOmin收集菌絲體。然后用去離子水沖洗菌絲體3遍，105° C過夜烘干至菌絲體質量恒定，測定菌體質量。葡萄糖、延胡索酸濃度的測定高效液相色譜(HPLC)儀器Aglientl200高效液相色譜儀檢測器視差擇光檢測器(refractiveindex detector, RID)；檢測波長2IOnm;流動相0.005M H2SO4 ；流速0.5mL · mirf1 ；柱溫35°C ；液相柱Bio_RadAminex HPX-87H 離子交換柱。樣品制備向發酵液中添加過量的HCl中和發酵液中過量的碳酸鈣直至無氣泡產生。沸水浴增加延胡索酸的溶解度，至發酵液澄清。基于延胡索酸鈣的低溶解度，采用去離子水稀釋發酵液直至無延胡索酸晶體析出。收集發酵液樣品，備用液相測定。酶活分析4° C，IOOOOg離心IOmin收集菌體，Imol噸―1的KOH溶液清洗菌絲體至渾濁液PH7. O,去離子水清洗菌絲體3遍，4° C，IOOOOg離心IOmin收集菌體，冷凍干燥，保存在液氮中。以1:3的比例懸浮菌絲體于O. OlM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)中，超聲波破碎細胞lOmin，14000g離心15min沉淀細胞碎片，收集上清液立即測定酶活。酶活測定反應液包括 Tris-HCl 緩沖液(pH8. 5) lOOmM，丙酮酸鈉 5mM，MgCl2 · 6H20 5mM，碳酸氫鈉 15mM，ATP2mM,NADH O. 15mM，氯化鉀10mM。30° C，反應lmin，340nm波長條件下測定吸光度。I單位的酶活定義為單位時間內催化丙酮酸合成I μ mol草酰乙酸，即氧化I μ mol NADH所需要的酶量，酶活單位為u/mg protein。本發明以一株能以葡萄糖為唯一碳源，過量積累延胡索酸的R. delemarNRRL1526為出發菌株，利用代謝工程手段構建一株能過量表達ScPYCl基因的重組菌R. delemar-pRS303H-PC。通過強化丙酮酸羧化途徑，加大碳代謝流進入TCA還原途徑的代謝通量，促進延胡索酸的過量積累。培養72h后，延胡索酸產量達到55. 92g/L，是出發菌株的1. 19倍。調節微生物細胞內TCA還原途徑，促進碳代謝流流向TCA還原途徑中間代謝產物，實現代謝產物過量積累的策略，為工業生物技術特別是采用代謝工程手段改造米根霉提聞目的廣物廣量提供了新的技術思路。
具體實施例方式實施例1萌發孢子的制備無菌生理鹽水從平板上洗下孢子，經過6層鏡頭紙過濾之后再用無菌生理鹽水洗滌3次，將洗滌后的孢子接種于30mL YEPD液體培養基，37° C，200rpm培養4h使孢子萌發，期間每Ih取樣觀察孢子形態一次。4° C，8000rpm離心15min收集萌發的孢子，20mL預冷無菌生理鹽水洗滌I次，將孢子重懸于IOmLYED培養基中，30° C，150rpm培養60min。4° C，8000rpm離心IOmin收集孢子，IOmL預冷的EB緩沖液洗滌一次后，再用5mL預冷的EB緩沖液懸浮孢子，分裝，置冰上備用。
實施例2融合PCR法構建目的片段ScPYCl與表達質粒的構建采用化學全合成方法獲得長度為1219bp的pdcA啟動子片段，及長度為943bp的終止子片段，并在PdcProF和pdcTerR片段5’端分別加入PacI和SalI兩個酶切位點。以NCBI公布的匪001180927.1序列，采用化學全合成方法合成釀酒酵母丙酮酸羧化酶基因編碼區PYCl片段； 在pfu酶作用下，經過融合PCR，擴增得到pdcAPro，pdcATer，PYCl三段寡核苷酸鏈的融合片段PYCl。在限制性內切酶PacI和SalI及DNA連接酶作用下，融合片段PYCl連接到前期構建的質粒 pRS303H(Taxis C，Knop M. System of centromeric, episomal, andintegrative vectors based on drug resistance markers for Saccharomyces cerevisiae.Biotechniques, 2006. 40(1) :73-78. ) Pacl/Sall 位點得到長約為 11. 6kbp 的轉化載體pRS303H-PYClo實施例3過量表達ScPYCl基因的R. delemar重組菌的篩選將重組質粒pRS303H-PC純化后，電轉R. delemar NRRL1526萌發孢子。將能在PDA+HygB培養基上生長的菌株，轉接PDA培養基產孢子培養，孢子懸浮液涂布PDA+HygB培養基培養皿，如此連續傳代3次，得到遺傳穩定的重組子。化學測序結果與預期一致，表明PRS303H-PC已成功整合到R. delemar基因組中。所得重組菌命名為R. delemar-pRS303H-PCo該菌在以葡萄糖為唯一碳源的培養基上生長時，丙酮酸羧化酶活性為4. 59U/mg protein,是出發菌株的5. 4倍。實施例4發酵生產延胡索酸的方法以米根霉R. delemar-pRS303H_PC為出發菌株，接種到產孢子培養基中，30° C培養5-7天，至分生孢子成熟；無菌水洗下孢子，稀釋到IO6個/mL ;以4%的體積比轉接孢子懸浮液至種子培養基，30° C，200rpm培養30h ；以10%的體積比轉接前培養種子至發酵培養基，30° C，200rpm 培養 72h。重組菌與對照菌相比(I)對照菌中延胡索酸產量為46. 87g/L，重組菌中延胡索酸產量可達55. 92g/L，是對照菌的1. 19倍；(2)發酵結束后對照菌菌體量為7. 58g/L，重組菌菌體量為7. 41g/L，兩者相差無幾。
y表
<110>江南大學
<120> --種高產延胡索酸米根霉工程菌及其應J4J<160> I
^I7u> PatentIn version 3.3
<210> I<211> 3537<212> DNA
<213> 釀酒酵母(Saechammyces cerevisiae)
<400> I
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權利要求
1.一種高產延胡索酸米根霉(Rhizopus delemar),其特征在于過量表達外源丙酮酸羧化酶基因，所述丙酮酸羧化酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據權利要求1所述米根霉的構建方法，其特征在于包括如下步驟1)根據米根霉(R.delemar)胞內蛋白的表達與啟動子直接相關，而與拷貝數無關，以NCBI公布的Rhizopus oryzae AF282846、AF282847，采用化學全合成方法分別獲得丙酮酸脫羧酶基因的啟動子與終止子片段；2)以NCBI公布的匪001180927.1序列，采用化學全合成方法合成丙酮酸羧化酶基因編碼區；3)將步驟I)和2)得到的三段片段進行融合，形成完整的丙酮酸羧化酶基因表達框；4)將步驟3)獲得的表達框克隆到PRS303H載體，轉化米根霉懸浮孢子后得到重組菌。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征是所述轉化在1000疒10000V的電場強度下進行。
4.權利要求1所述米根霉應用于延胡索酸的生產，其特征在于采用所述米根霉為出發菌株，接種到產孢子培養基中，30° C培養5-7天，至分生孢子成熟；無菌水洗下孢子，稀釋到IO6個/mL ;以4%的體積比轉接孢子懸浮液至種子培養基，30° C，200rpm培養30h ；以10%的體積比轉接前培養種子至發酵培養基，30° C，200rpm培養72h。
5.根據權利要求書4所述的應用，其特征是種子培養基成分為(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨6,碳酸I丐6。
6.根據權利要求4或5所述的應用，其特征是發酵培養基成分為(g/L):葡萄糖80，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 O. 3，MgSO4 · 7H20 O. 4，ZnSO4 · 7H20 O. 044，FeSO4 · 7H20 O. 01，CaCO3 80，滅菌后加甲醇15mL。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征是所述米根霉在葡萄糖為唯一碳源，培養72h，延胡索酸產量達到55. 92g/L。
全文摘要
本發明公開了一種高產延胡索酸米根霉及其應用，屬于遺傳工程領域。本發明采用代謝工程手段，將來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中編碼丙酮酸羧化酶的基因ScPYC1過量表達于發酵法生產延胡索酸的菌株Rhizopus delemar NRRL1526中，獲得了一株丙酮酸羧化酶活性提高的重組菌R.delemar-pRS303H-PC，其丙酮酸羧化酶活性提高了5.4倍(達到4.59U/mg protein)；以葡萄糖為唯一碳源，發酵72h后，延胡索酸產量達到55.92g/L，是出發菌株的1.19倍，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/15GK103013843SQ20121055272
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者陳堅, 周景文, 周正雄, 堵國成 申請人:江南大學