專利名稱：輪狀病毒的環介導等溫擴增檢測引物組和檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種輪狀病毒的環介導等溫擴增檢測引物組和檢測方法。
背景技術：
輪狀病毒(rotavirus)是世界范圍內病毒性胃腸炎的重要病因。目前對輪狀病毒感染引起的胃腸炎治療尚無特效藥物。無論在發達國家或是發展中國家，由輪狀病毒引起的腹瀉均有較高的發病率，是嬰幼兒發病和致死的最主要病因。輪狀病毒在離體條件下存活力很強，對各種理化因子有較強抵抗力，耐乙醚和弱酸，用氯仿、反復凍融、超聲波處理都不能使其失活，且這類病毒的序列變異較大，有多種血清型存在。近年來，輪狀病毒引起的胃腸炎流行在世界范圍內有不斷上升的趨勢，且流行范 圍廣，傳染性強，二次攻擊率高，常造成急性嚴重的嘔吐和腹瀉。雖然不同病毒感染的癥狀輕重不一，但一般患者都具有低燒、嘔吐、腹瀉、頭痛等嚴重的脫水樣胃腸炎的癥狀。人群對這幾種病毒普遍易感，兒童和老人最為嚴重，為胃腸炎病毒的危險人群。雖然輪狀病毒胃腸炎的流行有一定的季節性，但全年均可發生，可呈暴發流行，也可呈散發流行，因此致使對其不能進行及時有效的防護。目前輪狀病毒病原的檢測方法有電鏡技術、病毒分離培養技術、免疫學技術及分子生物學技術，但上述的前三種技術往往存在靈敏度較低、操作繁瑣耗時、需要大型昂貴的儀器設備等缺點，在應用時往往有其局限性，尤其不能適用于大規模的病原篩查和檢測等實際應用。分子生物學技術，其中尤其以RT-PCR檢測技術由于其快速、靈敏、適合處理大通量的樣品等特點，在病毒檢測中顯示出其優越性并越來越多的得以應用，但該方法從檢測到結果的判讀仍然需要多種專用儀器，操作較為繁瑣，所需時間仍然在5小時以上，常有非特異性出現等缺陷。與上述幾種實驗室診斷方法相比，近年來新建立的環介導等溫擴增(LAMP)技術由于其對儀器設備要求不高，臨床上容易做到，檢測時間也較短，不超過3小時，為快速、準確檢測輪狀病毒探索一種新方法。
發明內容
本發明的第一目的是提供一種應用環介導等溫擴增檢測輪狀病毒(rotavirus)的檢測引物組，利用該檢測引物組可以特異性的檢測輪狀病毒(rotavirus)。本發明的應用環介導等溫擴增檢測輪狀病毒(rotavirus)的檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成上游外引物F3 :5，-ACCACTCCTTAATGCACAA-3，；(如 SEQ ID NO.1 所示)；下游外引物B3 :5’ -GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)；上游內引物FIP : 5 ’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTGG-3，；(如SEQ ID NO. 3 所示)下游內引物BIP :5’ -ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCATGAA-3，(如 SEQ ID NO. 4 所示)。本發明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的輪狀病毒的檢測方法，其特征在于，對樣品進行病毒RNA提取，再反轉錄成cDNA，然后通過環介導等溫擴增的方法用上述檢測引物組對cDNA進行選擇性擴增，確認是否存在有擴增產物。所述的樣品可以為醫院的腹瀉樣品，以及水、食品等。所述的通過環介導等溫擴增的方法用上述檢測引物組對cDNA進行選擇性擴增具體為環介導等溫擴增體系為體系總體積25 μ L，包括2. 5 μ L IOXThermopol反應緩沖液、O. 4μ L10mmol/LdNTPs、0. 5μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外弓丨物 Β3、1 μ L40 μ mol/L 上游內引物 FIPU μ L 40 μ mol/L 下游內引物 BIP,O. 6 μ L100mmol/LMgSO4> 12. 5 μ L2mol/L 舌甘菜喊、4 μ L 滅菌雙蒸水 ddH 20,1 μ L8U/ μ L Bst DNA 聚合酶和 IuLcDNA，反應條件為在溫度為65°C孵育60min。所述的確認是否存在有擴增產物可以利用電泳檢測、熒光顯色檢測或濁度檢測環介導等溫擴增反應產物是否具有擴增產物，優選用熒光顯色檢測，具體是在終止反應的反應管中加入I μ L 10% SYBR Green I顯色劑，IOmin后觀察結果，如果顏色為黃色，則樣品輪狀病毒陰性，無輪狀病毒，如果顏色為綠色，則樣品輪狀病毒陽性，含有輪狀病毒。所述的lOXThermopol反應緩沖液是現有技術中的物質，可以從試劑公司購買至丨J，其含有200mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化鉀(KCl)、100mmol/L 硫酸銨(NH4) 2S04、20mmol/L 硫酸鎂(MgSO4)和 1% 曲拉通 X-100(TtitonX-100)，余量為水。本發明建立了輪狀病毒的LAMP檢測方法，本檢測方法根據輪狀病毒的基因保守序列設計了兩個特異性內引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為輪狀病毒所共有。本發明采用LAMP技術，特異性強，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的水浴箱即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速，可用于輪狀病毒的檢測，特別適合于基層現場應用。環介導等溫擴增(Loop-mediatedIsothermal Amplif ication, LAMP)技術具有特異性強、靈敏度高、快速且成本低等優點，其特點是對靶基因的6個部位設計4種引物，利用鏈置換反應在恒溫下使靶基因高效擴增。由于其反應是多種引物共同啟動，使得反應結果比PCR更特異，另外，由于實行的等溫擴增，反應在恒溫水浴箱內便可完成，不僅節約儀器成本，而且操作方法更簡單，適用于現場快速檢測。本發明解決了現有技術中檢測輪狀病毒的方法所需周期長、靈敏度較低、成本高等缺陷，可廣泛應用于醫院、食品行業、出入境檢驗檢疫及質量監督等部門及領域。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例1 :利用輪狀病毒LAMP檢測試劑盒檢測輪狀病毒待測樣本制備以臨床腹 與樣本為例本實施例收集了 2份醫院收集的臨床腹瀉樣本，分別按照以下方法進行檢測。( I)樣本處理取醫院收集的臨床腹瀉樣本，用ρΗ7. 4的PBS稀釋成10%的懸液，4°C、IOOOOg離心取上清，用于提取病毒RNA。(2)病毒RNA提取(a)取200 μ L步驟(I)的上清，加800 μ L Trizol試劑，用移液器反復混勻幾次后靜置5min ；(b)加入200 μ L氯仿，用力振搖15S，再靜置2 3min ;(c) 4°C, 12000g,離心 15min,棄去上層液體；(d)加入500 μ L異丙醇，充分混勻，室溫放置IOmin ；(e) 4°C, 12000g,離心 IOmin,再次棄去上清；
(f)加入75 %的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；(g) 4°C, 7500g,離心 5min,小心棄去乙醇；(h)充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于適量的無RNA酶的水中，由此得到RNA樣品。(3)病毒RNA反轉錄取2 μ L RNA 樣品，I μ L dNTP, O. 5 μ L RNasin, I μ L MLV,各 I μ L 的外引物 F3(5 ’ -ACCACTCCTTAATGCACAA-3，)和外引物 B3 (5，-GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3，)，2. 5 μ LIOXRT buffer，1. 5 μ LMgCl2，加入RNase free水至終體積為25 μ L，反轉錄反應條件為42°C，30min，然后 95°C，2min，由此得到 cDNA。(4)環介導等溫擴增環介導等溫擴增體系為體系總體積25 μ L，包括2. 5μ L IOXThermopol反應緩沖液、O. 4μ L10mmol/L dNTPs.O. 5μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3 (如 SEQ ID NO.1 所示)、
0.5μ L 10 μ mol/L下游外引物Β3 (如SEQ ID NO. 2所示)、lyL 40 μ mol/L上游內引物FIP (如 SEQ ID NO. 3 所示)、lyL 40 μ mol/L 下游內引物 BIP (如 SEQ ID NO. 4 所示)、0. 6 μ L100mmol/L MgSO4> 12. 5 μ L2mol/L 舌甘菜喊、4 μ L 滅菌雙蒸水 ddH20,1 μ L Bst DNA 聚合酶(8U/μ L)和IyL步驟(3)的cDNA，反應條件為在溫度為65°C孵育60min。檢測引物組為上游外引物F3 :5’ -ACCACTCCTTAATGCACAA-3’ ；下游外引物B3 :5，-GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3 ’ ；上游內引物 FIP : 5 ’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTGG-3 ’ ；下游內引物BIP :5’ -ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCATGAA-3，。(5)擴增產物的顯色檢測在上述反應管中加入I μ L 10% SYBR Green I顯色劑，室溫放置lOmin，用肉眼觀察顏色變化，如顏色變為綠色，則說明樣品中含有輪狀病毒；如果顏色為黃色，說明待檢樣品不含有輪狀病毒。其結果為陰性對照(模板為水)黃色，不含有輪狀病毒，2號樣品為本實施例的臨床腹瀉樣本，其顏色都為黃色，不含有輪狀病毒，3號樣品是本實施例的另外一份臨床腹瀉樣本，其顏色都為綠色，含有輪狀病毒。這與通過常規RT-PCR檢測方法檢測得到的結果相同。實施例2 :特異性試驗將I個已知輪狀病毒陰性和2個已知輪狀病毒陽性的樣品，按照實施例1的RT-LAMP法再次檢測，結果表明，已知陰性的樣品，在LAMP檢測結果中仍然呈現陰性，已知陽性的樣品，在LAMP檢測結果中仍然呈現陽性，表明LAMP檢測結果和PCR檢測結果相吻合，驗證了本發明所建立方法和試劑盒的特異性。實施例3 :靈敏度試驗將輪狀病毒RNA梯度稀釋，按照實施例1中步驟3-5的方法進行反轉錄、環介導等溫擴增和擴增產物的顯色檢測，驗證本發明的靈敏度，檢測結果為陰性對照(模板為水)為黃色，不含有輪狀病毒，陽性對照(RT-PCR陽性并測序確證為陽性的輪狀病毒)為綠色，含有 輪狀病毒，而100pg、10pg、lpg、0.1pg模板量的輪狀病毒RNA樣品其顏色都為綠色,都為陽性，確定其檢測靈敏度為O.1pgo
權利要求
1.一種應用環介導等溫擴增檢測輪狀病毒(rotavirus)的檢測引物組，其特征在于， 由下列引物組成上游外引物 F3 :5’ -ACCACTCCTTAATGCACAA-3’ ；下游外引物 B3 :5’ -GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3’ ；上游內引物 FIP :5’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTGG-3’ ；下游內引物 BIP :5’ -ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCATGAA-3’。
2.一種非疾病的診斷和治療目的的輪狀病毒的檢測方法，其特征在于，對樣品進行病毒RNA提取，再反轉錄成cDNA，然后通過環介導等溫擴增的方法用權利要求1所述的檢測引物組對cDNA進行選擇性擴增，確認是否存在有擴增產物。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的樣品為醫院的腹瀉樣品、水或食品。
4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的通過環介導等溫擴增的方法用權利要求1所述的檢測引物組對cDNA進行選擇性擴增具體為環介導等溫擴增體系為體系總體積 25 μ L，包括 2. 5μ L IOXThermopol 反應緩沖液、O. 4μ L IOmmo I/LdNTP S、 O. 5 μ LlO μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物 B3、I μ L 40 μ mol/L 上游內引物 FIP、lyL 4(^11101/1下游內引物81 、0.6 4 1^100_01/1 MgS04U2. 5μ L 2mol/L 甜菜堿、4 μ L滅菌雙蒸水ddH20,1 μ L 8U/ μ L Bst DNA聚合酶和I μ L cDNA,反應條件為在溫度為65°C孵育60min。
5.根據權利要求2或3或4所述的檢測方法，其特征在于，所述的確認是否存在有擴增產物是用熒光顯色檢測，具體是在終止反應的反應管中加入IyL 10% SYBR Green I顯色劑，IOmin后觀察結果，如果顏色為黃色，則樣品輪狀病毒陰性，無輪狀病毒，如果顏色為綠色，則樣品輪狀病毒陽性，含有輪狀病毒。
全文摘要
本發明公開了一種輪狀病毒的環介導等溫擴增檢測引物組和檢測方法。檢測引物組包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游內引物FIP、下游內引物BI P，分別如SEQ ID NO.1、2、3和4所示。本發明建立了輪狀病毒的LAMP檢測方法，本檢測方法根據輪狀病毒的基因保守序列設計了兩個特異性內引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為輪狀病毒所共有。本發明采用LAMP技術，特異性強，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的水浴箱即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速，可用于輪狀病毒的檢測，特別適合于基層現場應用。
文檔編號C12Q1/70GK103014178SQ20121055367
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月18日 優先權日2012年12月18日
發明者寇曉霞, 吳清平, 薛亮, 張菊梅 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環凱微生物科技有限公司