專利名稱：表達61家族糖苷水解酶基因的畢赤酵母工程菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程，具體地說是一種表達具體地說是以嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus aurantiacus var.1evisporus 61家族糖苷水解酶基因61f的畢赤酵母工程菌株 Pichia pastoris GS-TA-61。
背景技術：
糖苷水解酶(英語:Glycoside hydrolases,又稱糖苷酶)是一種專門水解配糖鍵(glycosidic bond)，并產生兩個較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。這類蛋白質在人類的產業上也有所應用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多個家族。嗜熱子囊菌光抱變種Thermoascus aurantiacus var.1evisporus 是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養基中50°C條件下可以產生熱穩定的纖維素酶和61家族糖苷水解酶。嗜熱子囊菌光孢變種產生的61家族糖苷水解酶61F具有微弱的纖維素酶活性，但對該菌株產生的內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，可使其活性提高3.89倍。在不同金屬離子如Mn2+的作用下，61F和61F+N24的活性可分別提高20倍和1.2倍。
發明內容
本發明從嗜熱子囊菌光抱變種Thermoascus aurantiacus var.1evisporus獲得內切β -1，4-葡聚糖酶基因的全長cDNA序列，命名為6If，6If基因cDNA全長1325bp，包括起始密碼子和多聚A尾，具有一個747bp的開放閱讀框，編碼249個氨基酸。具有信號肽序列(l-21aa MSFSKIIATAGVLASASLVAG)及一個潛在的 N 糖基化位點(NNS)。將61f編碼的氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現屬于糖苷水解酶第61家族，其中3個基序GNYV-RHE，GAQNYPQC和Y-1PGP具保守性。與絲狀真菌亞西島籃狀菌Talaromyces stipitatus、馬爾尼菲青霉菌penicilliummarneffei的內切葡聚糖酶的同源性較高，分別達到74%和75%。構建重組表達質粒載體pPIC9K/61f,利用電轉儀進行電擊轉化pichiapastorisGSl 15，在MD和麗培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-TA-61。該工程菌株接種于含BMGY培養基中，在28°C 200 rpm/min搖床培養6d后，61家族糖苷水解酶的表達量為3.22mg/ml，分子量為29KDa，酶活力為0.0667~1111，61 在651:下是穩定的，處理601^11后仍有95%以上的酶活性；70°C處理60min后仍保持67%的活性；75°C的半衰期為40min ;80°C處理IOmin后保持40%的活性；90°C處理50min活性幾乎完全喪失。61家族糖苷水解酶61F對嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus aurantiacus var.Levisporus內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力提高3.89倍。不同金屬離子對 61F和61F+N24混合酶活性具有促進或抑制作用，其中在Mn2+條件下，61F和61+N24的纖維素酶活性可分別提高20倍和1.2倍。
:圖1 61家族糖苷水解酶6IF的SDS-PAGE分析泳道1:低分子量蛋白標準泳道2:純化的61家族糖苷水解酶6IF圖2 61家族糖苷水解酶6IF對內切纖維素酶N24活性的促進作用圖3不同金屬離子對61F纖維素酶活性的影響圖4不同金屬離子對混合酶的作用
具體實施例方式
實施例1:嗜熱子囊菌光抱變種 Thermoascus aurantiacus var.1evisporus 的分離鑒定(I)標本采集:從堆肥中采集。(2)分離培養:將采集標本取0.5克放置在PDA平板上50°C培養3天后，進行分離純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻。(3)鑒定:參考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文獻。實施例2:糖苷水解酶基因6Ig的克隆(I)嗜熱子囊菌光抱變種 Thermoascus aurantiacus var.1evisporus 總 RNA 的提取:參照Trizol試劑盒說明。(2)cDNA 第一條鏈的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0試劑盒說明書進行:取廣2 μ g總RNA，加RNase Free ddH20至9.5 μ L，將RNA樣品在75°C變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分:10mmol/L dNTP Mixture 2 μ L，10XRTBuffer(Mg2+)2 μ L，25mmol/L MgCl24 μ L，Oligod (T) -Adaptor Primer I μ L, RNaseInhibiter 0.5 μ L, AMV Reverse Transcriptase IuL(Final Volume 20 μ L),將反應液混合后，室溫下放IOmin,然后42°C溫育60min,再煮沸5min以滅活反轉錄酶。加入180 μ L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 μ L，混勻，稍微離心，保存于-20°C，備用。(3)中間片段的分離:根據嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus aurantiacusvar.levisporus純化纖維素酶N端測序結果和61家族纖維素酶同源保守序列設計兼并引物。上游引物為:5 ’ -GTCCARAAYATYGTYATYGATGG-3 ’，下游引物為:5 ’ -GTTGANGCAYTCDGGRTAGTT-3，(4)3/和5'序列的分離:按照TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0使用說明進行。蛋白酶基因 3’-RACE所用引物為 61-3.2、61-3.3、01igo dT-Adaptor primer 和M13 PrimerM4，其序列為:61-3.2:5’ -CGCCTGGTCTACTACGGCAACTGAT-3，61-3.3:5，-AGACAATCTGATAGCAGCCAACAACA-3’M13Primer M4:5’ -GTTTTCCCAGTCACGAC-3，Oligo dT-Adaptor primer:包含 dT 區域及 M13 Primer M4 序列。蛋白酶基因5’端序列克隆，使用Tail-PCR的方法，以基因組DNA為模版，所用引物為3個向外的特異巢式引物Ρ5-1、Ρ5-2、Ρ5-3，以及上游公共兼并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5，其序列為:61-5.1:5，-ATCCAGTACCGTCCACAAATCCAAGA-3’61-5.2:5，-CAGTTGCCGTAGTAGACCAGGCGATGA-3’61-5.3:5’ -GCTGTTGCCGCTTATGTGCGTCTTG-3’AD1:5， -NTCGASTWTSGWGTT-3，AD2:5，-NGTCGASWGANAWGAA-3，AD3:5’ -WGTGNAGWANCANAGA-3’AD4:5’ -TGWGNAGSANCASAGA-3’AD5:5，-AGffGNAGffANCAffAGG-3 (5)基因克隆:取0.5μ I PCR產物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照TAKARA公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌DH5 α菌株，在表面涂有X-gal和IPTG的含氨卞青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。(6 )質粒DNA的提取:堿法提取質粒DNA。(7)序列測定:DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行。序列引物為M13啟動子引物。嗜熱子囊菌光孢變種61f基因cDNA全長1325bp，包括起始密碼子和多聚A尾，具有一個747bp的開放閱讀框，編碼249個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現屬于糖苷水解酶第61家族，其中3個基序GNYV-RHE，GAQNYPQC和Y-1PGP具保守性。該序列如下:(A) SEQ ID NO I 的信息(a)序列特征:*長度:1325堿基對；*類型:核酸；*鏈型:雙鏈；*拓撲結構:線性(b)分子類型:cDNA(C)假設:否(d)反義:否Ce)最初來源:嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)(f)序列描述:I CTCGGACACC GTTTCTTGAA GTTGCTTTAT ATTATTAGCT TTGGTCCATC GCGATCGAAT61 TGGCACATCC TATTTGAAAG ATGTCCTTTT CCAAGATAAT TGCTACTGCC GGCGTTCTTG121 CCTCTGCTTC TCTAGTGGCT GGCCATGGCT TCGTTCAGAA CATCGTGATT GATGGTAAAA181 AGTATGTCAT TGCAAGACGC AACCAGTATC CATACATGTC CAATCCTCCA GAGGTCATCG241 CCTGGTCTAC TACGGCMCT GATCTTGGAT TTGTGGACGG TACTGGATAC CAAACCCCAG301 ATATCATCTG CCATAGGGGC GCCAAGCCTG GAGCCCTGAC TGCTCCAGTC TCTCCAGGAG361 GMCTGTTGA GCTTCAATGG ACTCCATGGC CTGATTCTCA CCATGGCCCA GTTATCAACT421 ACCTTGCTCC GTGCAATGGT GATTGTTCCA CTGTGGATAA GACCCAATTA GAATTCTTCA481 AMTTGCCGA GAGCGGTCTC ATCAATGATG ACAATCCTCC TGGGATCTGG GCTTCAGACA541 ATCTGATAGC AGCCAACAAC AGCTGGACTG TCACCATTCC AACCACAATT GCACCTGGM 601 ACTATGTTCT GAGGCATGAG ATTATTGCTC TTCACTCAGC TCAGMCCAG GATGGTGCCC
661 AGAACTATCC CCAGTGCATC MTCTGCAGG TCACTGGAGG TGGTTCTGAT AACCCTGCTG721 GMCTCTTGG MCGGCACTC TACCACGATA CCGATCCTGG AACTCTGATC AACATCTATC781 AGAAACTTTC CAGCTATATC ATCCCTGGTC CTCCTCTGTA TACTGGTTAG AGGMCGTCC841 GGCGGTCAGA ATTGGTGCTG GTATTGTGAG AAGGGTCAGC GGTAGAGGTC TCGTTCGGAG901 GGTTGCMAA ACATGACGCT AGGTGGTTTT GTGCGATTCT TCCCATCTCG CCTCTTCCAC961 TTCTGCCMA TCCGGTTCTG CGATTGCTAT TTCGCCGTGA CCGGCTGTTA CTTTCGAACC1021 TGTCTCTACC AGGAACMCA CCATTTCGTT CTCCATTCTG TGGTCCCCCA GGGCCTCTAC1081 TAGTCTACCG GGAATTTCTC MCAGCGTCC GTGAATTCCA CGAGGCTAAA TGAMGCAAC1141 CCTGTGGCTC CTCAGGTTTG MCGAGGGAG GGGACATATC TTTTTGGAAA CACATGTGTG1201 ACCTCCMCT TCTACGTTCT TTTCTACCTT GATTGTTTGT ATCAAGTACT TTGACTTGAC1261 TGTCTTAGTG TGGATACMA TCGTTACATC AATCCATGTA TTCTCATTGC GACAMAAAA1321 AAAAA(B) SEQ ID NO 2 的信息(a)序列特征:*長度:249氨基酸；*類型:氨基酸；*鏈型:單鏈；*拓撲結構:線性(b)分子類型:蛋白質`(C)序列描述:I MSFSKIIATA GVLASASLVA GHGFVQNIVI DGKKYVIARR NQYPYMSNPP EVIAffSTTAT61 DLGFVDGTGY QTPDIICHRG AKPGALTAPV SPGGTVELQff TPffPDSHHGP VINYLAPCNG121 DCSTVDKTQL EFFKIAESGLINDDNPPGIff ASDNLIAANN SffTVTIPTTIAPGNYVLRHE181 IIALHSAQNQ DGAQNYPQCI NLQVTGGGSD NPAGTLGTAL YHDTDPGTLI NIYQKLSSYI241 IPGPPLYTG實施方式3:表達載體的構建(I)根據分離出的61f基因的核苷酸序列設計表達引物，在引物的5’端分別引入SnaB I和Not I酶切位點:h游引物:5’ -GGCTACGTACATGGCTTCGTTCAGAACAT’ (SnaB I)下游引物:5’-GGGCGGCCGCCTAACCAGTATACAGAGGA-3’ (Not I )(2)嗜熱子囊菌總RNA的提取:利用Trizol試劑提取。(3)反轉錄合成cDNA第一條鏈:取2yg總RNA，加入5X反應緩沖液4 μ L，IOmMdNTP 2 μ L，核糖核酸酶抑制劑(40 — 200ιι/μυ0.5μ 3_ο1 8ο(1Τ(1μ8/μυ μ ，β轉錄酶(lOu/μ L) 2μ L，42°C反應60min，然后85°C IOmin終止反應，稀釋至200 μ L。(4) PCR 反應(25yL):cDNA 2 μ L, 10 X Buffer 2.5 μ L, 10mmol/LdNTP2 μ L, 25mmol/LMgCl22 μ L,上、下游引物各 2 μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L (5U/μ L), ddH20 12 μ L。反應條件為 94°C 3min 預變性；94°C lmin，60°C lmin，72°C 1.5min,共32個循環，72°C延伸10min，4°C保存。(5)基因克隆:取2yL PCR產物與pMD18 — T載體進行連接，獲得重組質粒pMD18T/61f操作步驟按TAKARA公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，在涂有X - gal和IPTG的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
(6 )質粒DNA提取:堿法提取質粒DNA。(7)用SnaB I和Not I對重組質粒pMD18_T/61f產物進行雙酶切，同時用SnaB I和Not I雙酶切酵母表達質粒pPIC9K，DNA膠回收試劑盒回收純化61f基因及載體pPIC9K片斷。然后進行體外連接，獲得重組質粒pPIC9K/61f，重組質粒轉化大腸桿菌JM109，在含Amp的LB轉化平板上挑選單菌落，提取質粒DNA，進行PCR和酶切鑒定，測序確認重組質粒的讀碼框正確。實施例4.表達糖苷水解酶基因61f的酵母工程菌株的構建及篩選(I)重組表達質粒的線性化:將重組表達質粒pPIC9K/61f用限制性內切酶Sac I線性化。(2)轉化:電擊轉化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受態細胞,轉化方法參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。(3)篩選:用滅菌牙簽挑取轉化子對應點種在麗和MD平板上，30°C培養2 — 4d,挑取在MD/MM平板上均生長良好的轉化子為陽性轉化子。挑取陽性轉化子分別點種于250 μ g/mL,300 μ g/mL,400 μ g/mL,500 μ g/mL,600 μ g/mLG418 的 YPD 平板上篩選多拷貝轉化子。實施方式5:畢赤酵母Pichia pastoris GS115的誘導表達和活性檢測(I)將陽性轉化子接種于含25mL BMGY培養基中，30 °C 250rpm/min搖床培養24h(OD600達2 — 6)，離心收集菌體，將細胞重懸于適當體積的BMMY培養基中，至0D_值為1.0，300C 250rpm/min繼續培養，每24h補充甲醇至終濃度為0.5%，每24h取樣，室溫10，OOOg離心5min，取上清進行SDS-PA GE分析。(2)酶活性檢測:酶活性測定采用DNS法，反應體系及反應條件為100 μ L的酶液，加入200 μ L的0.5%微晶纖維素，100 μ L的醋酸緩沖液(0.4mol/L、pH 5.0) 65°C反應30min，加入400yL DNS試劑，煮沸lOmin，在540nm波長下測定光吸收值。對照組用失活的酶液做對照。以失活酶液的活性定義為100%，測定糖苷水解酶61F的相對酶活性。重復三次，取平均值。蛋白含量測定采用Bradford法。(3)重組糖苷水解酶61f的最適反應溫度、pH及熱穩定性:誘導表達的重組糖苷水解酶經過DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析,獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組糖苷水解酶測定其性質。在不同溫度和PH條件下分別測定重組糖苷水解酶的對纖維素的酶活力，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下糖苷水解酶的相對酶活性；將重組糖苷水解酶在不同的溫度下保溫60min，檢測剩余酶活力。重復三次，取平均值。實施方式6:61家族糖苷水解酶對內切纖維素酶N24活性的促進作用及不同金屬離子對其活性的影響(I)糖苷水解酶對內切纖維素酶N24活性的促進作用采用DNS法，分別測定61F、N24及混合酶在N24最適反應條件下的內切纖維素酶活性，混合酶為61F和N24等體積混合，反應體系為:61F 50 μ L，N24 50 μ L，200 μ L的0.5%CMC-Na, 100 μ L 的醋酸緩沖液(0.4mol/L、pH 5.0)50°C反應 30min，加入 400 μ L DNS 試劑，煮沸lOmin，在540nm波長下測定光吸收值。以不加糖苷水解酶61F的反應體系中的酶活性定義為100%，分別計算糖苷水解酶61F、內切纖維素酶N24以及混合酶的相對酶活性。重復三次，取平均值。
(2)不同金屬離子對糖苷水解酶61F纖維素酶活性的影響在反應體系中加入不同的金屬離子，使其終濃度為50mmol/L，在糖苷水解酶61F最適反應條件下測定其內切纖維素酶活性，不加金屬離子反應體系中的酶活性定義為100%，計算不同金屬離子條件下糖苷水解酶61F的相對酶活性。重復三次，取平均值。(3)不同金屬離子對混合酶活性的影響在反應體系中加入不同的金屬離子，使其終濃度為50mmol/L，在內切纖維素酶N24最適反應條件下測定混合酶的內切纖維素酶活性，不加金屬離子反應體系中的酶活性定義為100%，計算不同金屬離子條件下混合酶的相對酶活性。重復三次，取平均值。實施方式7:表達61f基因的畢赤酵母工程菌株GS-TA-61的保藏表達61f基因的畢赤酵母工程菌株GS-TA-61的保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期:2012年11月22日；酵母工程菌株編號為=CGMCC N0.6861 ;畢赤酵母工程菌株的分類命名為:巴氏畢赤 酵 母pichiapastoris。
權利要求
1.一種表達嗜熱子囊菌光抱變種 Thermoascus aurantiacus var.1evisporus 61 家族糖苷水解酶61f基因的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR及RACE方法從嗜熱子囊菌光抱變種Thermoascus aurantiacus var.1evisporus獲得熱穩定61家族糖苷水解酶基因61f，將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，獲得表達重組質粒pPIC9K/61f，轉化畢赤酵母GS115，從中篩選出表達熱穩定糖苷水解酶基因61f的畢赤酵母工程菌株GS-TA-61，該糖苷水解酶61F對內切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用。`
全文摘要
本發明是一種表達嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus aurantiacus var.levisporus熱穩定熱穩定61家族糖苷水解酶基因61f的畢赤酵母工程菌Pichiapastoris GS-TA-61。通過RT-PCR及RACE方法從嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus aurantiacus var.levisporus獲得糖苷水解酶基因61f，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達載體pPIC9K中，然后將得到的糖苷水解酶基因61f表達載體pPIC9K/61f導入到畢赤酵母GS115中，再從中篩選出一種表達糖苷水解酶基因61f的酵母工程菌GS-TA-61。該工程菌表達的糖苷水解酶61F對內切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始內切酶N24的降解纖維素的活性提高3.89倍。不同金屬離子對61F和61F+N24混合酶活性具有促進或抑制作用。61F具有良好的熱穩定性和提高纖維素酶活力的能力，可廣泛用于纖維廢料及其它工業領域，具有重大經濟價值和社會價值。
文檔編號C12N15/56GK103232949SQ20121055638
公開日2013年8月7日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者李多川, 李安娜, 韓華, 郭潔 申請人:山東農業大學