專利名稱：一種耐貯獼猴桃新品種的選育方法
技術領域：
本發明涉及一種植物新品種的選育方法，具體指耐貯獼猴桃品種的選育新方法。
背景技術：
獼猴桃是典型的呼吸躍變型果實，研究發現乙烯對于獼猴桃等呼吸躍變型果實的成熟具有舉足輕重的作用，通過控制獼猴桃果實內乙烯的生成可有效延長獼猴桃貯存的時間。在乙烯生物合成的過程中，有三個酶起著相當重要的作用，分別為腺苷蛋氨酸合成酶(SAM synthetase, SAMS)、ACC合成酶(ACC synthase, ACS)、ACC氧化酶(ACC oxidase,ACO)，其中ACO在乙烯生物合成過程中特別關鍵，通過調控ACO基因及其表達，就可以很好的控制果實內源乙烯的合成，從而達到延長果實貯藏時間的目的。 大多數采用轉基因方法獲得的耐貯獼猴桃新品種均帶有篩選標記，隨著轉基因植物研究的深入和轉基因作物的大規模產業化，轉基因植物的安全性越來越受到人們的重視，帶有篩選標記的轉基因植物品種由于潛在的各種安全性問題，特別是由于抗生素篩選標記引發的轉基因食品安全性問題，目前無法通過國家農業部的審查。因此，開發獲得無篩選標記的耐貯獼猴桃轉基因植株，對于耐貯獼猴桃新品種的選育和轉基因植物安全都具有重要意義。
發明內容
為解決耐貯獼猴桃新品種選育現有技術存在的問題，本發明人通過大量試驗，終于發明出一種耐貯獼猴桃的選育新方法，運用該方法，能確保得到的獼猴桃新品種不僅耐貯藏，而且不帶篩選標記，安全性高。本發明包括以下幾個步驟
(I)ACO基因的獲得。從獼猴桃葉片中提取RNA，再將RNA反轉錄成cDNA，最后通過設計引物獲得ACO基因。(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉化入農桿菌中，通過葉盤轉化法導入愈傷組織中，再通過篩選培養基獲得抗性愈傷組織，經過分化培養基培養獲得含有篩選標記再生苗。雙右邊界雙元載體是指載體有一條左邊界和兩條右邊界，其中標記基因在左邊界和第一條右邊界鏈接，目的基因是在第一條右邊界和第二條右邊界之間。(3)上游引物為Term F: 5' -GGT, GCT, TTC, CCA, GTC, CAA, ATC, GTT-3'，下游引物STermR: 5' -CCA, GGT, TTA, GTC, GTC, TCG, TGT, CTG, GT-3'，進行PCR擴增，80 — 105°C預變性3 — IOmin后運行下循環，94°C 35 s，59°C 35 s，72°C 40 s，共35個循環，最后72°C10 min，25°C 30 s，取PCR產物5 — 30 μ L進行O. 6% —1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得陽性植株(含有目的基因的植株，575bp)。(4)通過遺傳分離獲得無篩選標記的含有目的基因的植株，將同時含有hpt基因和aco基因的共轉化植株轉移至溫室栽培，隨機挑選其中10 — 50個TO代植株進行自交產生Tl代后對Tl代植株的基因組DNA進行PCR檢測，從而獲得無篩選標記的含有目的基因的植株，含有目的基因的植株即為新的耐貯獼猴桃品種。本發明的特點是將選擇標記基因和目的功能基因分別構建到一個雙元表達載體的兩段不同T_DNA上，經農桿菌介導的遺傳轉化將目的基因和選擇標記基因整合到同一染色體的不同部位，通過后代的篩選，獲得無選擇標記的轉基因植株。該方法獲得的耐貯獼猴桃品種安全性高，易于通過國家農業部審查。
具體實施例方式以下通過實例對耐貯獼猴桃選育的具體方法進行詳細說明。實施例1 (I)ACO基因的獲得，從獼猴桃葉片中提取RNA，再將RNA反轉錄成cDNA，最后通過設計引物獲得ACO基因。(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉化入農桿菌中，通過葉盤轉化法導入愈傷組織中，再通過篩選培養基獲得抗性愈傷組織，經過分化培養基培養獲得含有篩選標記再生苗。(3)上游引物為 Term F: 5' -GGT, GCT, TTC, CCA, GTC, CAA, ATC, GTT-3'，下游引物為 Term R: 5' -CCA, GGT, TTA, GTC, GTC, TCG, TGT, CTG, GT-3'，進行 PCR 擴增，95°C預變性 5min后運行下循環，94°C 35 s，59°C 35 s，72°C 40 s，共 35 個循環，最后 72°C 10 min,25°C 30 s，取PCR產物10 μ L進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得陽性植株。(4)通過遺傳分離獲得無篩選標記的含有目的基因的植株，將同時含有hpt基因和aco基因的共轉化植株轉移至溫室栽培，隨機挑選其中17個TO代植株進行自交產生Tl代后對Tl代植株的基因組DNA進行PCR檢測，從而獲得無篩選標記的含有目的基因的植株，含有目的基因的植株即為新的耐貯獼猴桃品種。實施例2
(1)ACO基因的獲得，從獼猴桃葉片中提取RNA，再將RNA反轉錄成cDNA，最后通過設計引物獲得ACO基因；
(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉化入農桿菌中，通過葉盤轉化法導入愈傷組織中，再通過篩選培養基獲得抗性愈傷組織，經過分化培養基培養獲得含有篩選標記再生苗；
(3)上游引物為Term F: 5' -GGT, GCT, TTC, CCA, GTC, CAA, ATC, GTT-3'，下游引物為Term R: 5' -CCA, GGT, TTA, GTC, GTC, TCG, TGT, CTG, GT-3 ;，進行 PCR 擴增，102 °C 預變性8min 后運行下循環，94°C 35 s，59°C 35 s，72°C 40 s，共 35 個循環，最后 72°C 10 min,25°C 30 s，取PCR產物25 μ L進行1. 3%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得陽性植株；
(4)通過遺傳分離獲得無篩選標記的含有目的基因的植株，將同時含有hpt基因和aco基因的共轉化植株轉移至溫室栽培，隨機挑選其中40個TO代植株進行自交產生Tl代后對Tl代植株的基因組DNA進行PCR檢測，從而獲得無篩選標記的含有目的基因的植株，含有目的基因的植株即為新的耐貯獼猴桃品種。
權利要求
1.一種耐貯獼猴桃新品種的選育方法，其特征在于包含以下幾個步驟(1)ACO基因的獲得，從獼猴桃葉片中提取RNA，再將RNA反轉錄成cDNA，最后通過設計引物獲得ACO基因；(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉化入農桿菌中，通過葉盤轉化法導入愈傷組織中，再通過篩選培養基獲得抗性愈傷組織，經過分化培養基培養獲得含有篩選標記再生苗；(3)上游引物為Term F: 5' -GGT, GCT, TTC, CCA, GTC, CAA, ATC, GTT-3'，下游引物為 Term R: 5' -CCA, GGT, TTA, GTC, GTC, TCG, TGT, CTG, GT-3'，進行PCR擴增，80 — 105°C預變性 3 — IOmin 后運行下循環，94°C 35 s，59°C 35 s，72°C 40 s，共 35 個循環，最后 72°C ·10 min，25°C 30 s，取PCR產物5 — 30 μ L進行O. 6% 一1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得陽性植株；(4)通過遺傳分離獲得無篩選標記的含有目的基因的植株，將同時含有hpt基因和aco 基因的共轉化植株轉移至溫室栽培，隨機挑選其中10 - 50個TO代植株進行自交產生Tl代后對Tl代植株的基因組DNA進行PCR檢測，從而獲得無篩選標記的含有目的基因的植株。
全文摘要
本發明公開了一種耐貯獼猴桃的選育方法，該方法包括(1)ACO基因的獲得；(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉化入農桿菌中，通過葉盤轉化法導入愈傷組織中，再通過篩選培養基獲得抗性愈傷組織，經過分化培養基培養獲得含有篩選標記的再生苗；(3)使用PCR法檢測再生苗，獲得陽性植株；(4)通過遺傳分離獲得無篩選標記的含有目的基因的植株。本發明的特點是將選擇標記基因和目的功能基因分別構建到兩個雙元表達載體或同一質粒的兩段不同T_DNA上，經農桿菌介導的遺傳轉化將目的基因和選擇標記基因整合到不同染色體或同一染色體的不同部位，通過后代的篩選，獲得無選擇標記的轉基因植株。
文檔編號C12N15/82GK102994545SQ201210558359
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月21日 優先權日2012年12月21日
發明者田宏現, 苑平, 劉藝 申請人:吉首大學