用于固定二氧化碳的構建體、菌株及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及用于在異養微生物(例如異養發酵菌株，例如大腸桿菌)中實現二氧化碳固定和/或減少二氧化碳排放的構建體，包含所述構建體的載體，包含所述構建體或用所述載體轉化的異養微生物(例如異養發酵菌株，例如大腸桿菌)，以及在異養微生物(例如異養發酵菌株，例如大腸桿菌)中固定二氧化碳和/或減少二氧化碳排放的方法。
【專利說明】用于固定二氧化碳的構建體、菌株及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物質能源領域、生物化學領域和基因工程領域。具體而言，本發明涉及用于在異養微生物(例如異養發酵菌株，例如大腸桿菌)中實現二氧化碳固定和/或減少二氧化碳排放的構建體，包含所述構建體的載體，包含所述構建體或用所述載體轉化的異養微生物(例如異養發酵菌株，例如大腸桿菌)，以及在異養微生物(例如異養發酵菌株，例如大腸桿菌)中固定二氧化碳和/或減少二氧化碳排放的方法。
【背景技術】
[0002]能源需求的持續快速增長與能源價格的不斷攀升，石化能源供給的不足以及大量使用石化能源所導致的環境污染與氣候變化等問題使得發展可再生替代能源迫在眉睫。針對減少對石油資源的依賴、降低二氧化碳排放等問題，以生物質資源利用為基礎的、生產生物燃料和生化產品的技術是一個有吸引力和有效的手段。然而，生物燃料和生化產品的生產過程中的二氧化碳排放，使得生物制品的環境友好及“零碳排放”變得有爭議。在生物質發酵過程中，由于微生物的代謝性質，二氧化碳排放在本質上是不可避免的。大多數具有活性和功能的生物大分子例如碳水化合物，脂肪和蛋白質在被降解和氧化的過程中，均伴有二氧化碳的產生/釋放。例如，在以葡萄糖為底物、厭氧發酵生物質以生產生物制品及衍生糖類時，每產生一分子乙醇都伴有一分子二氧化碳的排放:C6H1206 — 2C2H50H+2C02。因此，無論從科學研究的角度，還是從優化工業生產及環境保護的角度來看，解決微生物發酵過程中的二氧化碳排放問題都非常必要。
[0003]在植物和自養微生物中，二氧化碳可以被固定并轉化為有機生物質。目前已鑒定了六種不同的二氧化碳固定途徑，包括例如卡爾文循環、核酮糖-單磷酸途徑(Ribolose-Monophosphate Pathway)和絲氨酸途徑(Serine Pathway)等(參見，例如圖1B)。這些代謝途徑存在于不同的生物體系中，并且由光、硫化物、氫等各種能量在厭氧或好氧的環境下提供還原力。
[0004]在本申請中，發明人創造性地將原核生物的CO2固定途徑引入了異養微生物，從本質上減少了微生物發酵過程中的二氧化碳排放/釋放(參見，例如圖1C)，從而為解決微生物發酵過程中的二氧化碳排放問題提供了新的思路和手段。
【發明內容】
[0005]相關術語
[0006] 在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學、分析化學等實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
[0007]如本發明中所使用的，術語“異養”是相對于“自養”而言的，其具有本領域技術人員所通常理解的含義。通常，“自養微生物”是指，不依賴于任何有機營養物即可正常生活的微生物，“異養微生物”是指，必須依賴于至少一種有機營養物才可正常生活的微生物。自養微生物的一個典型代表是藍細菌(Cyanobacterium),例如魚腥藻、聚球藻或集胞藻(例如集胞藻PCC6803 (Synechocystis sp.PCC6803))。藍細菌也稱為藍藻，其是能夠利用太陽能來固定二氧化碳的光合自養型原核微生物。異養微生物的一個典型代表是大腸桿菌(E.coli)，例如大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。大腸桿菌因容易培養、遺傳學清晰、生長周期短等優點，已成為最廣泛使用且最具有代表性的原核異養微生物。
[0008]如本發明中所使用的，磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase, prk)是指，能夠催化將5-磷酸核酮糖轉化為1，5- 二磷酸核酮糖的下述反應的酶(EC2.7.1.19):
[0009]
【權利要求】
1.一種構建體,其包含第一基因和第二基因,其中所述第一基因選自: 1)磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)； 2)其核苷酸序列與I)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，優選地至少85%同一性，更優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且編碼具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白質的基因；和 3)其核苷酸序列在嚴緊雜交條件，優選高嚴緊雜交條件下能夠與I)中的基因的核苷酸序列雜交，并且編碼具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白質的基因； 并且其中，所述第二基因選自: 4)I, 5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)； 5)其核苷酸序列與4)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，優選地至少85%同一性，更優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一'I"生，至少98%同一'丨生,或至少99%同一'丨生,并且編碼具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白質的基因；和 6)其核苷酸序列在嚴緊雜交條件，優選高嚴緊雜交條件下能夠與4)中的基因的核苷酸序列雜交，并且編碼具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白質的基因。
2.權利要求1的構建體，其還包含與第一基因和/或第二基因可操作地連接的表達調控序列，例如啟動子，終止子，和/或增強子。
3.權利要求2的構建體，其中所述啟動子是組成型啟動子或誘導型啟動子，優選地所述啟動子選自:T7啟動子，CMV啟動子，pBAD啟動子，Trc啟動子，Tac啟動子，lacUV5啟動子，更優選地所述啟動子是T7啟動子。
4.權利要求1-3任一項的構建體，其中所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是來源于藍細菌(例如魚腥藻、聚球藻或集胞藻)或綠藻(例如原綠球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因編碼SEQ ID N0:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ I D NO:1所示的序列。
5.權利要求1-4任一項的構建體，其中所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是來源于藍細菌(例如魚腥藻、聚球藻或集胞藻)或綠藻(例如原綠球藻)或植物(例如擬南芥)的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因；例如所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因編碼SEQ ID NO: 8_10所示的三個亞基；例如所述1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因具有如SEQ ID NO:2所示的序列。
6.權利要求1-5中任一項的構建體,其中所述構建體還可以包含用于篩選轉化體的標記基因；優選地，所述標記基因是卡那霉素抗性基因，紅霉素抗性基因或壯觀霉素抗性基因。
7.—種載體,其包含權利要求1-6中任一項的構建體。
8.包含權利要求1-6中任一項的構建體和/或權利要求7的載體的宿主。
9.權利要求8的宿主，其是異養微生物，例如異養細菌、真菌和酵母，例如，釀酒酵母、畢氏酵母、黑曲霉、大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、丙酮丁醇芽孢梭菌 、丁酸梭狀芽孢桿菌、巴氏芽孢梭菌，優選大腸桿菌。
10.權利要求8的宿主，其是保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心且保藏號為CGMCC N0.5435的大腸桿菌。
11.一種組合，其包含含有第一基因的第一構建體和含有第二基因的第二構建體，其中所述第一基因選自: 1)磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)； 2)其核苷酸序列與I)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，優選地至少85%同一性，更優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且編碼具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白質的基因；和 3)其核苷酸序列在嚴緊雜交條件，優選高嚴緊雜交條件下能夠與I)中的基因的核苷酸序列雜交，并且編碼具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白質的基因； 并且其中，所述第二基因選自: 4)I, 5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)； 5)其核苷酸序列與4)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，優選地至少85%同一性，更優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一'I"生，至少98%同一'丨生,或至少99%同一'丨生,并且編碼具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白質的基因；和 6)其核苷酸序列在嚴緊雜交條件，優選高嚴緊雜交條件下能夠與4)中的基因的核苷酸序列雜交，并且編碼具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白質的基因。
12.權利要求11的組合，其中第一構建體與第二構建體分別作為分離的組分存在，或作為二者的混合物存在。
13.權利要求11或12的組合，其中第一構建體還包含與第一基因可操作地連接的表達調控序列，和/或第二構建體還包含與第二基因可操作地連接的表達調控序列，所述表達調控序列例如選自啟動子，終止子，和/或增強子。
14.權利要求13的組合，其中所述啟動子是組成型啟動子或誘導型啟動子，優選地所述啟動子選自:T7啟動子，CMV啟動子，pBAD啟動子，Trc啟動子，Tac啟動子，lacUV5啟動子，更優選地所述啟動子是T7啟動子。
15.權利要求11-14任一項的組合，其中所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是來源于藍細菌(例如魚腥藻、聚球藻或集胞藻)或綠藻(例如原綠球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因編碼SEQ ID N0:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ I D NO:1所示的序列。
16.權利要求11-15任一項的組合,其中所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是來源于藍細菌(例如魚腥藻、聚球藻或集胞藻)或綠藻(例如原綠球藻)或植物(例如擬 南芥)的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因；例如所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因編碼SEQ ID NO: 8_10所示的三個亞基；例如所述1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因具有如SEQ ID NO: 2所示的序列。
17.權利要求11-16中任一項的組合，其中所述第一構建體和/或第二構建體還包含用于篩選轉化體的標記基因；優選地，所述標記基因是卡那霉素抗性基因，紅霉素抗性基因或壯觀霉素抗性基因。
18.—種組合，其包含第一載體和第二載體，其中所述第一載體包含權利要求11-17中任一項所定義的第一構建體，并且第二載體包含權利要求11-17中任一項所定義的第二構建體。
19.一種宿主,其包含權利要求11-17中任一項所定義的第一構建體和/或權利要求18所定義的第一載體，并且包含權利要求11-17中任一項所定義的第二構建體和/或權利要求18所定義的第二載體。
20.權利要求19的宿主，其是異養微生物，例如異養細菌、真菌和酵母，例如，釀酒酵母、畢氏酵母、黑曲霉、大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、巴氏芽孢梭菌，優選大腸桿菌。
21.—種試劑盒，其包含， O權利要求1-6任一項的構建體，或權利要求7的載體；或者 2)權利要求11-18任一項的組合。
22.權利要求21的試劑盒，其還包含用于將構建體或載體引入宿主(例如異養微生物，例如異養細菌、真菌和酵母，例如，釀酒酵母、畢氏酵母、黑曲霉、大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、巴氏芽孢梭菌，優選大腸桿菌)的試劑，例如轉染試劑。
23.在異養微 生物中固定二氧化碳或者減少異養微生物的二氧化碳排放的方法，其包括， 將權利要求1-6任一項的構建體，或權利要求7的載體導入所述異養微生物中；或者，將權利要求11-17中任一項所定義的第一構建體和/或權利要求18所定義的第一載體，以及權利要求11-17中任一項所定義的第二構建體和/或權利要求18所定義的第二載體導入所述異養微生物中， 從而使所述異養微生物能夠表達第一基因和第二基因。
24.權利要求23的方法，其中所述第一基因和第二基因被整合入所述異養微生物的基因組內。
25.權利要求23的方法,其中所述第一基因和第二基因作為游離體存在于異養微生物中。
26.權利要求23-25中任一項的方法,其中所述異養微生物選自異養細菌、真菌和酵母，例如，釀酒酵母、畢氏酵母、黑曲霉、大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、巴氏芽孢梭菌，優選大腸桿菌。
27.權利要求1-6任一項的構建體或權利要求7的載體或權利要求11-18任一項的組合或者權利要求21或22的試劑盒用于在異養微生物中固定二氧化碳或者減少異養微生物的二氧化碳排放的用途。
28.權利要求27的用途，其中所述異養微生物選自異養細菌、真菌和酵母，例如，釀酒酵母、畢氏酵母、黑曲霉、大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、巴氏芽孢梭菌，優選大腸桿菌。
29.在異養微生物中固定二氧化碳或者減少異養微生物的二氧化碳排放的方法，其包括將第一基因和第二基因導入所述異養微生物中；其中所述第一基因選自: 1)磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)； 2)其核苷酸序列與I)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，優選地至少85%同一性，更優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且編碼具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白質的基因；和 3)其核苷酸序列在嚴緊雜交條件，優選高嚴緊雜交條件下能夠與I)中的基因的核苷酸序列雜交，并且編碼具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白質的基因； 并且其中，所述第二基因選自: 4)I, 5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)； 5)其核苷酸序列與4)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，優選地至少85%同一性，更優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一'I"生，至少98%同一'丨生,或至少99%同一'丨生,并且編碼具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白質的基因；和 6)其核苷酸序列在嚴緊雜交條件，優選高嚴緊雜交條件下能夠與4)中的基因的核苷酸序列雜交，并且編碼具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白質的基因， 從而使所述異養微生物能夠表達第一基因和第二基因。
30.權利要求29的方法，其中所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是來源于藍細菌(例如魚腥藻、聚球藻或集胞藻)或綠藻(例如原綠球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因編碼SEQ ID N0:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ ID NO:1所示的序列。
31.權利要求29或30的方法，其中所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是來源于藍細菌(例如魚腥藻、聚球藻或集胞藻)或綠藻(例如原綠球藻)或植物(例如擬南芥)的1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因；例如所述1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因編碼SEQ ID NO:8-10所示的三個亞基；例如所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因具有如SEQ ID NO:2所示的序列。
32.權利要求29的方法，其中通過一種或多種載體將第二基因導入所述異養微生物。
33.權利要求32的方法，其中通過同時編碼1，5_二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亞基rbcL和rbcS或者亞基rbcL，rbcS和rbcX的I種載體將第二基因導入所述異養微生物，或者通過分別編碼1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)的亞基rbcL和rbcS的2種載體將第二基因導入所述異養微生物，或者通過分別編碼1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的rbcL, rbcS和rbcX亞基的3種載體將第二基因導入所述異養微生物。
34.權利要求29-33任一項的方法，其中所述第一基因和第二基因被整合入所述異養微生物的基因組內。
35.權利要求29-33任一項的方法，其中所述第一基因和第二基因作為游離體存在于異養微生物中。
36.權利要求29-35中任一項的方法,其中所述異養微生物選自異養細菌、真菌和酵母，例如，釀酒酵母、畢氏酵母、黑曲霉、大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、巴氏芽孢梭菌，優選大腸桿菌。
37.一種試劑盒，其包含第一組分和第二組分，其中 第一組分包含編碼磷酸核酮糖激酶(Prk)的載體，并且 第二組分包含編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)的一種或多種載體， 其中，第一組分和第二組分分別作為分離的組分存在，或作為二者的混合物存在。
38.權利要求37的試劑盒，其中第二組分包含I種載體，其編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亞基rbcL和rbcS或者亞基rbcL, rbcS和rbcX。
39.權利要求37的試劑盒，其中第二組分包含2種載體，其分別編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亞基rbcL和rbcS。
40.權利要求37的試劑盒，其中第二組分包含3種載體，其分別編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亞基rbcL, rbcS和rbcX。
41.權利要求37-40任一項的試劑盒，其還包含用于將載體引入宿主(例如異養微生物，例如異養細菌、真菌和酵母，例如，釀酒酵母、畢氏酵母、黑曲霉、大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、巴氏芽孢梭菌，優選大腸桿菌)的試劑，例如轉染試劑。
42.權利要求37-41任一項的試劑盒用于在異養微生物中固定二氧化碳或者減少異養微生物的二氧化碳排放 的用途。
【文檔編號】C12N1/15GK103882014SQ201210559843
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優先權日:2012年12月21日
【發明者】呂雪峰, 楊柳, 高政緒, 談曉明 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所