專利名稱：一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法
技術領域：
本發明屬于醫學檢驗測定技術領域，特別是涉及一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法。
背景技術：
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合，含有巰基的的三肽，具有抗氧化 作用和整合解毒作用。半胱氨酸上的巰基為谷胱甘肽活性基團(故谷胱甘肽常簡寫為G-SH)，易與某些藥物(如撲熱息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、芥子氣，鉛、萊、砷等重金屬)等結合，而具有整合解毒作用。故谷胱甘肽(尤其是肝細胞內的谷胱甘肽)能參與生物轉化作用，從而把機體內有害的毒物轉化為無害的物質，排泄出體外。谷胱甘肽還能幫助保持正常的免疫系統的功能。
權利要求
1.一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，方法步驟包括I)谷胱甘肽氧化還原酶基因的PCR克隆，2)谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌構建，3)谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌誘導表達，4)谷胱甘肽氧化還原酶酶液獲得，5)檢測樣品制備，6)反應催化體系構建，7)檢測，8)計算谷胱甘肽濃度， 所述谷胱甘肽氧化還原酶基因為序列表中的SEQ IDl ； 所述谷胱甘肽氧化還原酶基因的PCR克隆為設計PCR引物I和引物2，利用PCR技術對序列 SEQ IDl 進行克隆，引物 I :5’ GCGGGATCCATGACTAAACACTATG3’，引物 2 :5’ GCGAAGCTTTTAACGCATTGTCACGA3’ ； 所述反應催化體系構建為反應體系包括谷胱甘肽氧化還原酶酶液I、含磷酸的緩沖溶液2、樣品3 ； 所述檢測為采用紫外可見分光光度計檢測反應催化體系在340nm處的吸收值A的變化。
2.根據權利要求I所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化還原酶基因的PCR克隆為設計谷胱甘肽氧化還原酶基因GOR的引物，利用PCR技術克隆并回收得到谷胱甘肽氧化還原酶基因，設計的引物I為5’ GCGGGATCCATGACTAAACACTATG3’，引物I酶切位點為BamH I，設計的引物2為5’ GCGAAGCTITTAACGCAITGTCACGA3’，引物2酶切位點為Hind III，以大腸桿菌DH5 a基因組為模版，PCR擴增工藝條件為94° C預變性5min，94° C30s，56° Clmin，72° Clmin，擴增25 30個循環，最終延伸反應為72° ClOmin。
3.根據權利要求I或2所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌構建為獲得的谷胱甘肽氧化還原酶基因GOR和表達載體pET28 a進行連接構建，得到重組表達質粒pET28 a -G0R,選取大腸桿菌為表達宿主，將重組表達質粒PET28 a -GOR導入宿主中，得到谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌。
4.根據權利要求3所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌誘導表達為將構建得到的谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌進行培養2 3h，利用異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG對培養了 2 3h的谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌菌液進行誘導，繼續培養l(Tl4h，誘導表達完成。
5.根據權利要求3所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化還原酶酶液獲得為離心收集完成誘導表達的谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌菌體，利用濃度為20mM，pH為7. 4的磷酸緩沖液對菌體進行清洗2 3次，并將菌體重懸于濃度為20mM，pH為7. 4的磷酸緩沖液中獲得菌體重懸液，菌體和磷酸緩沖液的體積比為1:30飛0，利用超聲破碎對菌體重懸液進行破碎，超聲破碎條件為工作時間3s，間歇時間2s,功率80W，次數200，超聲破碎后離心收集上清，獲得谷胱甘肽氧化還原酶酶液。
6.根據權利要求3所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述反應催化體系構建為按順序先后將谷胱甘肽氧化還原酶酶液I、含磷酸的緩沖溶液2、樣品3加入到反應皿中，谷胱甘肽氧化還原酶酶液I、緩沖溶液2、樣品3的體積比為300ul 2600ul : IOOul，緩沖溶液2的成分為20mM的K2HPO4溶液，得到反應催化體系。
7.根據權利要求4飛任一項所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述檢測樣品制備為采用組織破碎儀將需要檢測的樣品細胞進行組織破碎，細胞樣品、直徑為0. 2um的磁性、磷酸緩沖液按體積比1:3飛25^50的比例混合得到，混合液破碎條件為，破碎時間為5 8min，破碎功率為200W，破碎完后離心收集上清得到檢測樣品。
8.根據權利要求7所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述檢測為將構建好的反應催化體系放入紫外可見分光光度計檢測槽中，設置檢測檢測時間為2 3min，波長為340nm，利用移液槍將NADP+/NAD+4溶液加入反應催化體系中，并用移液槍吹打反應體系2 3次，啟動紫外可見分光光度計檢測功能，得到反應催化體系在340nm處的吸收值A變化曲線。
9.根據權利要求7所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述計算谷胱甘肽濃度為根據檢測得到的反應催化體系在340nm處的吸收值A變化曲線，計算吸收值A在0. 25、. 75min內的變化速率，變化速率結合參照谷胱甘肽標準樣品制作的標準曲線，計算出樣品中的谷胱甘肽濃度。
10.根據權利要求8、任一項所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，該檢測方法應用于檢測釀酒酵母細胞、粘紅酵母細胞、畢赤酵母細胞、人體肝臟細胞、人體紅細胞中的谷胱甘肽濃度。
全文摘要
本發明涉及一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，該方法的實現步驟包括谷胱甘肽氧化還原酶GOR的基因克隆獲得；利用基因工程手段構建谷胱甘肽氧化還原酶GOR的表達重組菌BL21/pET28α-GOR；誘導重組菌表達出GOR酶，重組菌細胞破碎，獲得谷胱甘肽氧化還原酶酶液；檢測樣品制備；催化反應體系構建；可見分光光度計檢測反應體系在波長為340nm處的變化曲線；谷胱甘肽濃度計算。本發明可應用于真菌類細胞、真核類細胞中谷胱甘肽含量的檢測，檢測方法具有樣品處理簡單，操作簡便，檢測時間短，靈敏度高，檢測結構重復性高等優點。
文檔編號C12N1/21GK102978276SQ201210568880
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者陳燕婷 申請人:陳燕婷