專利名稱：表面修飾氨基苯硼酸的納米碳材料及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于無機材料和生物分析技術領域，具體涉及表面修飾氨基苯硼酸的納米碳材料及其制備方法和應用。
背景技術：
蛋白質組學的核心在于大規模地對蛋白質進行綜合分析，通過對某種物種、個體、器官、組織或細胞的全部蛋白質性質(其中包括表達水平、結構、分布、功能、豐度變化、翻譯后修飾、細胞內定位、蛋白質與蛋白質的相互作用、蛋白質與疾病的相關性)的研究，對蛋白功能做出精細和準確的闡述。其中翻譯后修飾蛋白質的變化往往具有重要生理功能因而進行翻譯后修飾蛋白質的分析鑒定是生物分析領域熱點問題。糖蛋白是一類由糖類和蛋白質以共價鍵連接而成的結合的功能蛋白。糖鏈不僅改變蛋白質的構象，而且導致蛋白功能發生改變。糖基化對于蛋白質的折疊、運輸、定位起著重要作用，并參與受體激活、信號轉導等諸多重要的生物進程。同時臨床的生物標志物及治療的靶標都是糖蛋白。研究表明，大多數糖蛋白是低豐度的蛋白質，因而很難被質譜選中進行分析。此外，非糖蛋白/非糖肽的離子化效率遠遠高于糖蛋白/糖肽，它們的大量存在，導致復雜體系中糖蛋白/糖肽的信號被嚴重抑制，大大降低了被鑒定的可能性。因此作為分析和鑒定糖蛋白的前提和基礎，如何快速分離和富集糖蛋白越來越成為制約其檢測和鑒定的關鍵步驟。目前已有的糖基化肽段富集方法主要有以下幾種凝集素親和色譜法、體積排阻色譜法、親水色譜法、肼腙反應法和硼酸富集法。近來發展的硼酸富集法基于堿性條件下，硼酸可以和糖鏈的順式鄰二醇結合形成穩定的共價鍵，而在酸性條件下又可以可逆地將完整的糖蛋白/糖肽洗脫，因此具有廣泛的適用性。近年來，納米碳材料以其發展快速和應用潛力而被越來越多的應用于生物領域。因此發展一種簡單、有效地分離富集糖蛋白/糖肽的方法成為蛋白質組學研究的重要分支。納米碳材料以其粒徑小、良好的生物兼容性、高比表面積、表面易于功能化修飾的特點為其應用于蛋白質組學分析中痕量肽段的分離富集方法提供了可能。
發明內容
本發明目的在于提供一種易于合成、 特異性好，能對糖蛋白/糖肽進行分離富集的表面修飾硼酸的納米碳材料。本發明還提供上述表面修飾硼酸納米碳材料的制備方法。本發明進一步還提供上述納米碳材料的應用。本發明是在原有納米碳材料經酸化處理的基礎上，通過碳化二亞胺反應，首先將其表面進行多聚賴氨酸(PU以及聚乙二醇二甘醇酸(PEG)的修飾，再與氨基苯硼酸(APBA)反應，進行納米碳材料表面功能化修飾，得到表面修飾硼酸基團的納米碳材料。本發明通過下述方法和步驟制備所述的表面修飾硼酸基團的納米碳材料(1)對納米碳材料進行預處理l_5g納米碳材料經超聲分散于10_50mLH2SO4/HNO3 (H2SO4 =HNO3= 9:1-8:2 (v/v))溶液中，室溫攪拌12-24小時，用清水洗至中性；置于0. 1-0. 5M NaOH水溶液中，于90_95°C攪拌2-4小時，用清水清洗；至于0. 1-0. 5M HCl溶液中，于90-95°C攪拌2-4小時，清水洗凈，干燥后得酸化/活化納米碳材料；以上處理過程使其表面產生羧基官能團；
(2)將0.5-lg酸化/活化納米碳材料分散于溶解5-10mL 60-80mg/mL N-羥基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液；超聲波分散2-5分鐘，隨后將5-10mL 60-80mg/mLN-乙基二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽快速加入，繼續超聲分散10-30min，反應結束，離心收集納米碳材料，棄去上清，并用2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液沖洗多次；
(3)將活化的納米碳材料繼續分散于8-10mL2%-10%多聚賴氨酸(Mw，500_17，000)的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中，并充分混旋振蕩，反應3-12h ;待反應結束離心收集，并清洗多聚賴氨酸修飾后的納米碳材料；
(4)將0.2-1. Og聚乙二醇二甘醇酸溶解于5-10mL 60-80mg/mL N-輕基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液 ；超聲波分散2-5分鐘，隨后將5-10mL 60-80mg/mL N-乙基二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽快速加入，繼續超聲10-30min，隨后將活化后的聚乙二醇二甘醇酸以及l_2mL 10-20mg/mL氨基苯硼酸迅速加入多聚賴氨酸修飾納米碳材料中，超聲分散，4-10°C反應過夜12-16小時；反應結束，離心收集表面修飾硼酸基團的納米碳材料使用超純水充分清洗后，將其干燥，備用。步驟(I)中，所述的納米碳材料可以為納米金剛石、碳納米管、石墨烯、富勒烯材料，優選為納米金剛石。步驟(2) - (4)中，所述的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液可以為磷酸鹽緩沖液。步驟(2)和(4)中，N-羥基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液，其濃度可為100-200mM, pH可為6—6. 5，例如為6.1等；
步驟(3)中，所述多聚賴氨酸為分子量在5-15萬。步驟(4)中，所述聚乙二醇二甘醇酸為分子量在200-2萬。本發明方法制備得到的表面修飾硼酸基團的納米碳材料，具有下式的結構
權利要求
1.一種表面修飾硼酸基團的納米碳材料的制備方法，其特征在于具體步驟為(1)對納米碳材料進行預處理l-5g納米碳材料經超聲分散于10-50mL&504/!^03溶液中，室溫攪拌12-24小時，用清水洗至中性，H2S04/HN03溶液中H2SO4 =HNO3= 9:1-8:2 (v/ V);置于O. 1-0. 5M NaOH水溶液中，于90_95°C攪拌2-4小時，用清水清洗；置于O. 1-0. 5M HCl溶液中，于90-95°C攪拌2-4小時，清水洗凈，干燥后得酸化/活化納米碳材料；以上處理過程使其表面產生羧基官能團；(2)將O.5-lg酸化/活化納米碳材料分散于溶解5-10mL 60-80mg/mL N-羥基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液；超聲波分散2-5分鐘，隨后將5-10mL 60-80mg/mL N-乙基二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽快速加入，繼續超聲分散10-30min，反應結束，離心收集納米碳材料，棄去上清，并用2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液沖洗多次；(3)將活化的納米碳材料繼續分散于8-10mL2%-10%多聚賴氨酸的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中，并充分混旋振蕩，反應3-12h ;待反應結束離心收集，并清洗多聚賴氨酸修飾后的納米碳材料；(4)將O.2-1. Og聚乙二醇二甘醇酸溶解于5-10mL 60-80mg/mL N-輕基丁二酰亞胺的 2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液；超聲波分散2-5分鐘，隨后將5-10mL 60-80mg/mL N-乙基二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽快速加入，繼續超聲10-30min，隨后將活化后的聚乙二醇二甘醇酸以及l_2mL 10-20mg/mL氨基苯硼酸迅速加入多聚賴氨酸修飾納米碳材料中，超聲分散，4-10°C反應過夜12-16小時；反應結束，離心收集表面修飾硼酸基團的納米碳材料使用超純水充分清洗后，將其干燥。
2.根據權利要求1所述的表面修飾硼酸基團的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(I)中，所述的納米碳材料為納米金剛石、碳納米管、石墨烯或富勒烯材料。
3.根據權利要求1所述的表面修飾硼酸基團的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(2) - (4)中，所述的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
4.根據權利要求1所述的表面修飾硼酸基團的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(2)和(4)中，N-羥基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液，其濃度為100-200mM， pH 為 6—6. 5。
5.根據權利要求1所述的表面修飾硼酸基團的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(3)中，所述多聚賴氨酸為分子量在5-15萬。
6.根據權利要求1所述的表面修飾硼酸基團的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(4)中，所述聚乙二醇二甘醇酸為分子量在200-2萬。
7.由權利要求1-6之一所述方法制備得到的表面修飾硼酸基團的納米碳材料，具有下式的結構
8.權利要求1所述的表面修飾硼酸納米碳材料在制備特異性分離富集糖蛋白和糖月太中的用途。
全文摘要
本發明屬于無機材料和生物分析技術領域，具體為一種表面修飾氨基苯硼酸的納米碳材料及其制備方法和應用。本發明是在原有納米碳材料經酸化處理的基礎上，通過碳化二亞胺反應，首先將其表面進行多聚賴氨酸以及聚乙二醇二甘醇酸修飾后，再與氨基苯硼酸反應進行納米碳材料表面功能化修飾。本發明的合成方法簡單有效，制備的氨基苯硼酸功能化納米碳材料作為納米吸附劑，比表面積大，選擇特異性強，在水溶液中具有較好的分散性和穩定性，可快速實現糖肽/糖蛋白的特異性分離富集。該材料在糖蛋白質組學等領域中具有良好的實用價值和應用前景。
文檔編號C12N9/08GK103043647SQ20121057354
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者魏黎明, 徐國賓, 張偉, 陸豪杰, 楊芃原 申請人:復旦大學