專利名稱：一種云芝抗病品種室內篩選的方法
技術領域：
本發明一種云芝抗病品種室內篩選的方法，屬于生物工程和食藥用菌技術領域。
背景技術：
云芝屬擔子菌綱多孔菌科云芝屬真菌，云芝是極具藥用價值的真菌之一。研究發現云芝含多糖類、糖肽類、留體類、三萜類、有機酸類、生物堿類、葡糖醇類、蛋白質類等29種化合物，還含胞外黏性物質(ECMM)、胃蛋白酶抑制劑、真菌激發子、鐵黏合螯合劑、環肽、18種人體所需的氨基酸和維生素B1、B2、B6及銅、鐵、鉀、鋅等10多種人體所需的活性微量元素等其他類化合物。云芝具有清熱解毒、消炎抗癌、保肝等功效，常用于去濕、化痰、療肺疾，治療慢性支氣管炎、遷延性慢性肝炎等。云芝多糖和云芝三萜、氨基酸等活性成分，具有抗腫瘤、免疫調節、抗放射和抗化療、鎮靜、強心及抗心肌缺血、調節血脂、降血糖、平喘、保肝、抗缺氧和抗衰老等作用。云芝具有廣泛的藥理作用和極高的藥用價值，隨著國內外研究者對云芝更深入全面的藥理研究，云芝的藥用價值將得到更廣泛的挖掘和應用。產量高、生物性狀優異、生產性狀良好的云芝菌種是保障云芝生產和云芝產業良好發展的先決條件，從野外分離的云芝菌種大多產量不高，需要經過人工馴化和不斷的選育，以提高云芝的產量和生產性狀，因此，菌種的選育方 面的研究就顯得尤為重要。自然選育的效率較低，而采取人工選育的方法效果較好，云芝作為一種大型真菌，有其自身的特點，其新菌種的選育研究離不開食用菌育種方面的研究。而云芝抗病品種室內篩選的新方法為食用菌誘變育種、雜交育種和原生質體融合育種，提供抗病出發菌株，為云芝抗病高產新菌株的篩選提供了抗病出發菌株。同時云芝抗病菌株的篩選，為云芝的生產提供了有力的保障，提高了生產者的經濟效益。目前食用菌室內抗病篩選方法并不是很多，通常食用菌抗病品種室內篩選的方法，主要通過拮抗試驗來確定，看菌絲拮抗線處食用菌菌絲的生長強弱和對病原菌菌絲的覆蓋情況來判斷，這種方法沒有一定的評價標準，完全是通過人為的感官分析，通常會出現菌絲生長速度快抗病率就強的錯誤觀點，最后還是要通過復雜的出菇試驗，通過室外建立病原菌感染食用菌子實體模式來鑒定，一是工作量大，同時受環境因素的影響；目前有關通過食用菌液體發酵過程中接入病原細菌，最后看食用菌菌絲的得率與對照進行對比得出抗病率，有一定的科學性，而霉菌病害是真菌，真菌菌絲和食用菌菌絲混在一起就沒有辦法清除，此種方法就不適用；也有研究報道運用病原菌的發酵液直接涂布平板，或者經過一定的溫度滅活用多層紗布過濾后涂布平板試驗，看食用菌品種的抗病率。病原菌未完全清除，平板試驗無法判斷，或者是病菌毒素被高溫破壞，試驗數據不準確，有很多的缺陷，而且沒有建立完全科學的評價體系，實驗的偶然性很大。目前有關食用菌抗病品種室內篩選的方法還在不斷的研究試驗當中。
發明內容
本發明的目的是提供一種云芝抗病高產新菌株的室內篩選方法，獲得抗病出發菌株。本發明的技術方案:一種云芝抗病品種室內篩選的方法:
確定兩種主要病原菌(細菌、青霉菌)，以云芝進行抗病品種篩選；
通過引進市售的8種不同的云芝菌株進行抗病能力測定，這8種云芝菌株分別命名為:SYZ USYZ 2、SYZ 3、SYZ 4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8 ；
通過對病原菌的液體發酵培養，病原菌的發酵產物離心得到上清液，然后利用細菌濾膜進行過濾得到無菌濾液，得到的無菌濾液再進行云芝菌株的平板涂布培養實驗，利用打孔接種，通過PDA平板培養，利用云芝菌株菌圈生長的大小與未涂布病原菌發酵產物濾液的PDA平板培養試驗對照菌株菌圈生長的大小進行比較，得出平均抗性；
通過對不同云芝的生長速度測定，根據不同云芝的生長速度、對細菌的平均抗性、對青霉菌的平均抗性，建立綜合評分體系，以確定不同云芝菌株的抗病能力，篩選出最佳抗病云芝菌株；篩選步驟為:
(O實驗方法的建立:細菌、青霉菌的發酵產物通過離心得到上清液，在45°C進行旋轉蒸發濃縮，以確保發酵產物的生理活性不被破壞，然后利用細菌濾膜進行過濾，得到的無菌濾液再進行云芝菌株的平板涂布培養實驗，要求PDA平板倒好后放置3天或者用無菌風吹干，以便濾液能被平板吸收及均勻的涂布平板；
(2)確定試驗的病原菌發酵產物無菌濾液的濃度:利用兩種云芝菌株對不同濃度的病原菌發酵產物無菌濾液進行抗病抑制試驗，通過試驗效果以確定最佳試驗的病原菌發酵產物無菌濾液的濃度；
(3)確定發酵產物無菌濾液的涂布量:在確定病原菌發酵產物無菌濾液的濃度的基礎上，再通過平板涂布濾液量的大小對兩種云芝菌株所產生的抑制試驗效果，確定發酵產物無菌濾液的涂布量；
(4)確定平均抗性:8種不同的云芝菌株在確定的細菌、青霉菌的發酵產物無菌濾液濃度、確定的平板涂布量的條件下，利用打孔接種，通過PDA平板培養，利用云芝菌圈生長的大小與對照(沒有涂布發酵產物無菌濾液的PDA平板試驗)菌株菌圈生長的大小進行比較，得出平均抗性:
抗性水平=(試驗菌圈直徑/對照菌圈直徑)X 100% ；
(5)抗病性聚類分析:對不同云芝菌株的抗性水平進行方差分析，再進行不同云芝菌株的抗病性聚類分析得出高抗菌株；
(6)生長速度聚類分析:通過PDA平板培養試驗對8種不同云芝菌株的生長速度進行測定。通過8種不同云芝菌株的生長速度的聚類分析得出生長速度快的云芝菌株。(7)綜合評分:根據不同云芝的生長速度、對細菌的平均抗性、對青霉菌的平均抗性，建立綜合評分體系，以確定不同云芝菌株的抗病能力，篩選出最佳抗病云芝菌株。(8)通過云芝菌株的栽培試驗以最終確定篩選出的云芝菌株的抗病能力。本發明的有益效果:本發明是一種綜合的評價體系，本體系的建立主要來自于我們常用的細菌、霉菌等病原菌抗藥性篩選，篩選最佳抗病藥物的方法而得來的，具有科學性、適用性、方法的簡便性。
云芝抗病品種室內篩選的方法與目前一些食用菌抗病品種室內篩選方法相比的優點在于:①通常食用菌抗病品種室內篩選的方法，主要通過拮抗試驗來確定，一般室內采用病原菌的菌絲和食用菌菌絲的拮抗反應，看菌絲拮抗線處食用菌菌絲的生長強弱和對病原菌菌絲的覆蓋情況來判斷，這種方法沒有一定的評價標準，完全是通過人為的感官分析，通常會出現菌絲生長速度快抗病率就強的錯誤觀點，最后還是要通過復雜的出菇試驗，通過室外建立病原菌感染食用菌子實體模式來鑒定，一是工作量大，同時受環境因素的影響，業內都知道這不是一種很可靠的方法，但也沒有最佳的室內篩選方法。而云芝抗病品種室內篩選的新方法，根據不同云芝的生長速度、對細菌的平均抗性、青霉菌的平均抗性，建立評分體系，以確定不同云芝菌株的抗病能力，篩選出最佳抗病云芝菌株。所建立評價體系是一個綜合的評價體系，具有科學性和實用性以及方法簡便。②現在出現一種室內篩選抗病品種新方法通過食用菌液體發酵過程中接入病原菌，最后看食用菌菌絲的得率與對照進行對比得出抗病率，有一定的科學性，但病原菌的發酵菌體不能完全清除，對于細菌可以用水沖洗掉，而霉菌病害也是真菌，菌絲和食用菌菌絲混在一起就沒有辦法清除，此種方法就不適用。而云芝抗病品種室內篩選的新方法利用發酵產物(發酵濾液)對食用菌菌絲的抑制情況來判斷，適用性很廣。③最近還有一種室內抗病性篩選方法，運用病原菌的發酵液直接涂布平板，或者經過一定的溫度滅活用多層紗布過濾后涂布，看食用菌品種的抗病率，這種方法和本發明的云芝抗病品種室內篩選的方法原理差不多，但有很多的缺陷，一是病原菌沒有完全清除，涂布一到二天后病原菌以長滿平板使實驗無法進行下去，或者發酵液經過滅活或滅菌病原菌發酵產物的活性成分受到破壞，而且沒有建立完全科學的評價體系，實驗的偶然性很大。而本發明建立的云芝抗病 品種室內篩選的方法通過細菌濾膜清除病原菌，病原菌發酵濾液在低溫濃縮然后進行平板涂布實驗，完全克服了上述缺點，具有科學性。通過對病原菌的液體發酵培養，病原菌(細菌、青霉菌)的發酵產物通過離心得到上清液，然后利用細菌濾膜進行過濾，得到的無菌濾液再進行云芝菌株的平板涂布培養實驗，利用打孔接種，通過PDA平板培養，利用云芝菌株菌圈生長的大小與對照(沒有涂布發酵產物濾液的PDA平板培養試驗)菌株菌圈生長的大小進行比較，得出平均抗性，抗性水平=(試驗菌圈直徑/對照菌圈直徑)x 100%，通過對不同云芝的生長速度測定，最后根據不同云芝的生長速度、對細菌的平均抗性、對青霉菌的平均抗性，建立綜合評分體系，以確定不同菌株的抗病能力，篩選出最佳抗病云芝菌株。本發明是一種綜合的評價體系，本體系的建立主要來自于我們常用的細菌、霉菌等病原菌抗藥性篩選，篩選最佳抗病藥物的方法而得來的，具有科學性、適用性、方法的簡便性。本發明建立的云芝抗病品種室內篩選的方法通過細菌濾膜清除病原菌，病原菌發酵濾液在低溫濃縮后進行平板涂布實驗，完全克服了上述缺點，具有科學性；目前尚未見到有關云芝抗病品種室內篩選的方法的任何報道。
圖18種不同云芝品種對細菌的抗性聚類分析圖。圖28種不同云芝品種對青霉菌抗性聚類分析圖。圖38種不同云芝品種生長速度聚類分析圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步說明:下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。云芝抗病品種室內篩選的方法，其步驟是:
1、云芝代表病原菌進行篩選，確定兩種主要病原菌(細菌、青霉菌)。從江蘇安惠生物科技有限公司及東北、安徽等云芝生產基地進行病原菌的采集，然后進行病原菌的實驗室分離培養分析試驗，再進行云芝生產基地的病原菌回接確認試驗，最后確定兩種主要病原菌為細菌(革蘭氏陽性菌)、霉菌(青霉菌)。2、通過引進8種不同的云芝菌株進行抗病能力測定。(I)從國內各省云芝主產區引進市售的不同品種的云芝菌種8株。接種于PDA斜面培養基上，28°C避光培養7天進行活化。8種云芝菌株分別為:SYZ USYZ 2,SYZ 3、SYZ
4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8。(2)病原菌的培養。細菌用LB液體培養基，170轉/分旋轉式搖床30°C避光培養4天；青霉菌用H)液體培養基，140轉/分旋轉式搖床28°C避光培養5天，發酵液10000轉/分離心10分鐘去除菌體，離心后的菌液備用。(3)細菌、青霉菌的發酵產物，通過離心得到上清液，利用45°C進行旋轉蒸發濃縮，然后利用細菌濾膜進行過濾得到濾液，利用兩種云芝菌株對不同濃度濾液進行抗病抑制試驗，通過試驗效果以確定最佳試驗的發酵產物濾液的濃度。①細菌濾膜進行過濾得到濾液分3種處理方式:發酵濾液不濃縮、濃縮至50%、及濃縮至25%。分別以0.1 mL涂布PDA平板，每種處理涂布3塊PDA平板。②從8種云芝菌株挑選2株菌株SYZ 3、SYZ 8，利用打孔接種，通過PDA平板26°C恒溫培養，利用菌圈生長的大小與對照(沒有涂布發酵產物濾液的PDA平板試驗)菌株菌圈生長的大小進行比較，得出平均抗性:抗性水平=(試驗菌圈直徑/對照菌圈直徑)X 100%，試驗結果:濃縮至25%的細菌有抑制云芝菌絲生長效果，而青霉菌發酵產物濾液抑制云芝菌絲生長效果不明顯，特別是SYZ 8幾乎沒變化。細菌、青霉菌發酵產物濾液不同濃度抑制情況表
權利要求
1.一種云芝抗病品種室內篩選的方法，其特征在于: 以細菌、青霉菌為病原菌，對云芝進行抗病品種篩選； 通過引進市售的8種不同的云芝菌株進行抗病能力測定，這8種云芝菌株分別命名為:SYZ USYZ 2、SYZ 3、SYZ 4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8 ； 通過對病原菌的液體發酵培養，病原菌的發酵產物離心得到上清液，然后利用細菌濾膜進行過濾得到無菌濾液，得到的無菌濾液再進行云芝菌株的平板涂布培養實驗，利用打孔接種，通過PDA平板培養，利用云芝菌株菌圈生長的大小與未涂布病原菌發酵產物濾液的PDA平板培養試驗對照菌株菌圈生長的大小進行比較，得出平均抗性； 通過對不同云芝的生長速度測定，根據不同云芝的生長速度、對細菌的平均抗性、對青霉菌的平均抗性，建立綜合評分體系，以確定不同云芝菌株的抗病能力，篩選出最佳抗病云芝菌株；篩選步驟為: (1)實驗方法的建立:細菌、青霉菌的發酵產物通過離心得到上清液，在45°C進行旋轉蒸發濃縮，以確保發酵產物的生理活性不被破壞，然后利用細菌濾膜進行過濾，得到的無菌濾液再進行云芝菌株的平板涂布培養實驗，要求PDA平板倒好后放置3天或者用無菌風吹干，以便濾液能被平板吸收及均勻的涂布平板； (2)確定試驗的病原菌發酵產物無菌濾液的濃度:利用兩種云芝菌株對不同濃度的病原菌發酵產物無菌濾液進行抗病抑制試驗，通過試驗效果以確定最佳試驗的病原菌發酵產物無菌濾液的濃度； (3)確定發酵產物無菌濾液的涂布量:在確定病原菌發酵產物無菌濾液的濃度的基礎上，再通過平板涂布濾液量的大小對兩種云芝菌株所產生的抑制試驗效果，確定發酵產物無菌濾液的涂布量； (4)確定平均抗性:8種不同 的云芝菌株在確定的細菌、青霉菌的發酵產物無菌濾液濃度、確定的平板涂布量的條件下，利用打孔接種，通過PDA平板培養，利用云芝菌株菌圈生長的大小與未涂布發酵產物無菌濾液的PDA平板培養試驗對照菌株菌圈生長的大小進行比較，得出平均抗性: 抗性水平=(試驗菌圈直徑/對照菌圈直徑)X 100% ； (5)抗病性聚類分析:對不同云芝菌株的抗性水平進行方差分析，再進行不同云芝菌株的抗病性聚類分析得出高抗菌株； (6)生長速度聚類分析:通過PDA平板培養試驗對8種不同云芝菌株的生長速度進行測定:通過8種不同云芝菌株的生長速度的聚類分析得出生長速度快的云芝菌株； (7)綜合評分:根據不同云芝的生長速度、對細菌的平均抗性、對青霉菌的平均抗性，建立綜合評分體系，以確定不同云芝菌株的抗病能力，篩選出最佳抗病云芝菌株； (8)通過云芝菌株的栽培試驗以最終確定篩選出的云芝菌株的抗病能力。
全文摘要
一種云芝抗病品種室內篩選的方法，屬于生物工程和食藥用菌技術領域。本發明首先對云芝確定兩種主要病原菌細菌、青霉菌，引進不同的云芝菌株，對細菌、青霉菌抗病能力進行篩選，建立云芝抗病能力篩選的模式；由于食用菌的細菌及霉菌性病害主要通過病原菌分泌的毒素來抑制食用菌菌絲生長，造成食用菌產生各種病害；還有就是食用菌菌絲的生長與病原菌菌絲的生長強弱之間的競爭來確定食用菌抑制病原菌的能力。因此，通過PDA平板培養實驗，利用細菌、青霉菌的發酵產物對不同云芝生長的抑制能力與對照菌株進行對比，得出不同云芝菌株的平均抗性，以及不同的云芝菌株生長速度，建立評分體系，經過綜合評判，室內篩選出抗病能力強的菌株，最后經云芝實驗進一步確定。
文檔編號C12Q1/18GK103114125SQ20121058190
公開日2013年5月22日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者鄭惠華, 汪潔, 劉廣建, 全衛豐, 蔣益, 季宏更, 薛璟 申請人:江蘇省蘇微微生物研究有限公司, 江蘇安惠生物科技有限公司