重組絲氨酸蛋白酶抑制子、真菌表達載體及其殺蟲真菌劑的制作方法

專利名稱：重組絲氨酸蛋白酶抑制子、真菌表達載體及其殺蟲真菌劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的絲氨酸蛋白酶抑制子，具體地說涉及含有真菌的分泌型信號肽和昆蟲絲氨酸蛋白酶抑制子serpin序列的重組蛋白。
本發明涉及表達上述重組蛋白的真菌表達載體。
本發明還涉及表達上述重組蛋白的殺蟲真菌劑。
技術背景
真菌是控制自然界昆蟲種群數量的主要因素之一，以其為主要活性成份的生物農藥已在我國、歐美及非洲得到廣泛應用(馮明光，《植物保護21世紀展望暨第三屆全國青年植物保護科技工作者學術研討會論文集》，1998)。但生物農藥，包括細菌、病毒及真菌類殺蟲劑均存在擊倒害蟲時間過長和防效不穩定等缺點，因此如何提高這些生物類殺蟲劑的效率，并研究其作用機理已成為該領域的一個研究重點。
在真菌侵染宿主的過程中，昆蟲會利用自身的防御系統抵御真菌的侵入。昆蟲體壁可以為其提供物理屏障，自身的免疫系統則可識別入侵的病原體，免疫細胞附著在病原體表面，吞噬病原體，形成黑色素。此外免疫系統還會產生大量的抗菌蛋白，抑制真菌的生長。研究者們以果蠅為模式生物，深入研究了昆蟲的免疫反應。果蠅的免疫系統包括三個反應，體液免疫，由脂肪體產生一系列的抗菌肽，吞噬及黑化。果蠅受到免疫脅迫時產生的抗菌月太包括 Drosomycin、Metchnikowin、Defensin、Attacin、Cecropin、Drosocin 和 Diptericin,其中Drosomycin、Metchnikowin和Cecropin對真菌有抑制作用。研究表明， 果蜆在受到真菌脅迫時會激活spjitzle/Toll/cactus信號途徑(Toll途徑)(Schneider DS et al. , Genes Dev, 1991, 5:797-807),其中 spjitzle 是 Toll 的配體，由絲氨酸蛋白酶活化。spjitzle與Toll結合活化該途徑,導致I κ B-1ike蛋白和Cactus蛋白的降解和 NF-K B-like、Dorsal和Dif的核轉位，從而激活相關基因的表達(Nicolas E et al. , J Biol Chem, 1998，273:10463-10469)。該途徑中的 Toll、sp^itzle、Tube 或 Pelle 發生突變，均會導致抗真菌肽Drosomycin的表達降低，昆蟲對真菌感染高度敏感(Lemaitre B et al. ,Cell, 1996, 86:973 - 83)。利用煙曲霉/應抱子分別處理 Toll突變體果蠅和野生型果蠅，突變體果蠅在2 - 3天后全部死亡，而野生型果蠅在處理6 天后，僅有1/3死亡。分析顯示,在Toll突變體中，抗真菌蛋白Drosomycin的表達顯著降低(Lemaitre B et al. ,Cell, 1996，86:973 - 83)。上述研究表明，Toll信號途徑是昆蟲受到真菌侵染時的主要信號途`徑，阻抑該途徑會造成昆蟲對真菌病原體的抵抗力降低。因此，該途徑成為菌株遺傳改良的潛在靶標，但目前還沒有相應的報道
發明內容
針對現有技術存在的上述不足，本發明的一個目的在于提供一種重組絲氨酸蛋白酶抑制子，其含有來源于真菌的分泌型信號肽和來源于昆蟲的絲氨酸蛋白酶抑制子，具有抑制昆蟲免疫反應和提高殺蟲真菌毒力的特性，以解決昆蟲病原真菌侵染效率低的問題。
本發明的另一個目的在于提供含有上述核苷酸序列的表達載體。
本發明的再一個目的在于提供產生本發明蛋白的殺蟲真菌劑。
實現上述目的，本發明采用如下技術方案一種重組絲氨酸蛋白酶抑制子，其特征在于，采用分子生物學技術構建一個重組核苷酸序列，其含有編碼球孢白僵菌如幾丁質酶的信號肽序列與編碼果蠅的絲氨酸蛋白酶抑制子基因，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
所述重組絲氨酸蛋白酶抑制子的構建方法，包括如下步驟I)果蜆serpin基因的克隆在果蠅的serpin基因中(NM_080112)，有一個內含子，利用PCR互搭的方法去除內含子；分別以P1/P2，P3/P4為引物；引物序列如下Pl: 5’ -GAATTCATGGCGAGCAAAGTCTCGATCCTTCTCCTGC-3’,下劃線序列為 EcoRI 位點； P2: 5’ -GGGGTACGAACTTGGCATAGGAAGCTGCCGAGGCC-3’ ；P3: 5’ -GGCCTCGGCAGCTTCCTATGCCAAGTTCGTACCCC-3’ ；P4: 5’ -CCCGGGTTAGACGCTCATGGGCGTGGGAT-3’,下劃線序列為 SmaI 位點；果蠅基因組DNA為模版，用Phusion DNA聚合酶(NEB)擴增serpin基因的N端和C端 (以內含子為分割點)；反應體系5 μ L 5XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP,上下游引物各 I μ L( 10 μ m), 0. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,總體積 25PCR 反應參數98°C (2 min) ;30 個循環98°C (20 s)，56°C (30sec), 72 (Imin)， 72°C (5 min)；分別回收N端(1222bp)和C端(139bp)片段，進行無引物組裝；反應體系5 μ L 5 XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP, N端片段(50ng), C 端片段(50ng)，O. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,總體積 25 μ L ；以上述組裝產物為模 版，以Pl和Ρ4為引物擴增全長的serpin cDNA序列，克隆進 pEASY-Blunt載體(全式金產品)；測序正確的載體命名為pEASY-serpin ；2)融合基因的構建設計引物P5-P7,構建Bbsp: serpin的融合基因；引物序列如下P5: 5，-TCTAGAGAGCTCATCGCTTGGCAACG-3，，下劃線序列為 XbaI 位點；P6: 5，-AAAAAAGCGGCCGCATGGCTCCTTTTCTTCAAACC-3，，下劃線序列為 NotI 位點；P7: 5’ -GGACTAGTGCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3’，下劃線序列為 SpeI 位點；以球孢白僵菌CZfeawreria Bassiana)基因組為模版，用P6和P7擴增球孢白僵菌幾丁質酶基因Bbchitl的信號肽，克隆進pGEM-T載體(Promega),測序驗證，獲得載體 pGEM-Bbsp ；以pEASY-serpin為模版，用P4與P5擴增serpin基因的成熟蛋白區域，克隆進 pGEM-T 載體，得 pGEM-serpin ；NotI 與 SpeI 雙酶切 pGEM-Bbsp，回收 Bbsp 片段(90bp) ；XbaI 與 SmaI 雙酶切 pGEM-serpin,得 serpin 成熟區域片段(1362bp)。
進一步，一種重組蛋白的真菌表達載體，將上述Bbsp (90bp)與serpin (1362bp)共同構建進pUC-Pgpda-TtrpC,得pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC載體，其具有融合蛋白 Bbsp: serpin的表達原件,上游含有一個真菌組成性啟動子Pgpda,下游含有一個終止子 TtrpC0
再進一步，本發明還提供一種重組蛋白的殺蟲真菌劑，將上述的載體 pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 用 XbaI 單酶切，，得融合蛋白 Bbsp: serpin 的表達原件 Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 片段(4. 4kb),構建進真菌表達載體 pK2_BAR:GFP,得 pK2_BAR:G FP-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC質粒并轉入根癌農桿菌LBA4404 ;利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法得到組成性表達Bbsp: serpin的殺蟲真菌轉化子。
相比現有技術，本發明具有如下有益效果本發明中，絲氨酸蛋白酶抑制子serpin參與了 spjitzle/Toll/cactus級聯反應的調節。serpin可以抑制降解spjitzle絲氨酸蛋白酶的活性,使spjitzle保持完整,從而阻抑該信號途徑。研究表明，在野生型果蠅中，當有病原體侵染時，spatzle被蛋白酶裂解成活性形式，但在絲氨酸蛋白酶抑制子基因serpin (Spn43AC)的突變體中，spjitzle—直處于活化狀態，抗真菌肽Drosomycin組成性表達(Levashina EA et al. , Science, 1999, 285:1917 - 1919)。因此，serpin能負調控昆蟲的免疫反應，在真菌侵染宿主的過程中產生 serpin則可提聞真菌對抗宿主免疫系統的能力，從而提聞真菌的殺蟲效果。
本發明通過在殺蟲真菌中表達融合蛋白Bbsp: serpin,使真菌在侵染宿主的過程中分泌產生serpin，抑制宿主的Toll信號通路，從而抑制昆蟲的免疫反應，增強真菌的增殖速度，縮短真菌擊倒害蟲的時間。目前還沒有針對宿主免疫反應進行菌株改良的報道，因此本發明取得的成功既可為害蟲的防治提供高毒力菌株，也可以為菌株改良提供一個新的思路。
本發明所獲得的重組絲氨酸蛋白酶抑制子，可以抑制昆蟲的免疫反應，增強真菌在血腔中的增殖速度，從而提聞殺蟲真菌毒力的特性，提聞真菌的殺蟲效果。
本發明提供的轉重組絲氨酸蛋白酶抑制子基因的球孢白僵菌轉化菌株；毒力分析結果證明，轉化子的毒力較對照有明顯的提高；轉化子在昆蟲血腔中增殖速度較野生型菌株有顯者的提聞。


圖1是Serpin N端的70個氨基酸序列；其中箭頭所示為推測的信號肽酶切割位
圖2是本發明融合基因Bbsp: serpin的質粒圖譜。
圖3是本發明Bbsp: serpin的真菌表達載體圖譜。
圖4是本發明的Bbsp: serpin的球孢白僵菌轉化子PCR驗證。
圖5是野 生型菌株和轉基因菌株在昆蟲血腔中的增殖情況。
具體實施方式
下面結合具體實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。
—種重組絲氨酸蛋白酶抑制子，含有一融合蛋白，所述融合蛋白由來源于真菌幾丁質酶的分泌型信號肽與來源于昆蟲的絲氨酸蛋白酶抑制子融合而成。所述融合蛋白由來源于球孢白僵菌iBeauveria bass ana)的幾丁質酶信號肽(以下簡稱Bbsp)與來源于果蜆 {Drosophila )的絲氨酸蛋白酶抑制子(以下簡稱serpin)融合而成。
進一步，編碼本發明重組絲氨酸蛋白酶抑制子的核苷酸序列含有編碼來源于真菌的幾丁質酶基因的信號肽與編碼來源于昆蟲絲氨酸蛋白酶抑制子的基因。采用分子生物學技術構建了一個重組核苷酸序列，其含有編碼球孢白僵菌iBeauveria bassiema)質酶的信號肽序列與編碼果蠅的絲氨酸蛋白酶抑制子基因，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
另外，本發明還提供一種殺蟲真菌轉化菌株，用本發明構建的質粒載體轉化殺蟲真菌而獲得可表達本發明重組蛋白的殺蟲真菌轉化菌株，其中殺蟲真菌可以是球孢白僵菌iBesuveria bassiana)、金龜子綠僵菌(ifetarhizium anisopIiae)、黃綠綠僵菌 (Me tarhi zi um fl avoviride)、布氏白僵菌(.Beauveri a brongni artii )> 玫煙色擬青霉 {Paecilomyces fumosoroseus )、湯普森被毛抱(.Hirsu tella thompsoni )或粉擬青霉 (Paecilomyces farinosus)等。還構建了球孢白僵菌轉化菌株。
以下具體實施中，所用的實驗材料如無特別說明均為市售購買產品。
—、絲氨酸蛋白酶抑制子serpin的克隆及真菌表達載體構建。
實施例11.果蜆serpin基因的克隆在果蠅的serpin基因中(NM_080112 )，有一個內含子，利用PCR互搭的方法去除內含子。分別以P1/P2，P3/P4為引物。載體構建過程中的引物序列如下Pl: 5’ -GAATTCATGGCGAGCAAAGTCTCGATCCTTCTCCTGC-3> (下劃線序列為 EcoRI 位點)； P2: 5’ -GGGGTACGAACTTGGCATAGGAAGCTGCCGAGGCC-3’ ；P3: 5’ -GGCCTCGGCAGCTTCCTATGCCAAGTTCGTACCCC-3’ ；P4: 5，-CCCGGGTTAGACGCTCATGGGCGTGGGAT-3，(下劃線序列為 SmaI 位點)，P5: 5’ -TCTAGAGAGCTCATCGCTTGGCAACG-3，(下劃線序列為 XbaI 位點)；P6: 5’ -AAAAAAGCGGCCGCATGGCTCCTTTTCTTCAAACC-3’ (下劃線序列為 NotI 位點)；P7: 5’ -GGACTAGTGCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3，(下劃線序列為 SpeI 位點)；P8 :5’ -TCCAATTGCTTCCGATCTGG-3’。
果蠅基因組DNA為模版，用Phusion DNA聚合酶(NEB)擴增serpin基因的N端和 C 端(以內含子為分割點)。反應體系5 μ L 5XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L2.5 mM dNTP,上下游引物各 IyL (10 μ m), O. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,總體積 25 μ L0 PCR 反應參數98°C (2 min) ;30 個循環98°C (20 s)，56°C (30sec), 72 (Imin) ; 72°C (5 min) 分別回收N端(1222bp)和C端(139bp)片段，進行無引物組裝。 反應體系5 μ L 5 XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP, N 端片段 (50ng),C 端片段(50ng), 0. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,總體積 25 μ L。以上述組裝產物為模版，以 Pl和P4為引物擴增全長的serpin cDNA序列，克隆進pEASY-Blunt載體(全式金公司產品)。測序正確的載體命名為pEASY-serpin。
2.融合基因的構建設計引物P5-P7,構建Bbsp: serpin的融合基因。以球抱白僵菌iBeauveria Bassiana) 基因組為模版，用P6和P7擴增球孢白僵菌幾丁質酶BbchitKGenebank登錄號AY145440) 的信號肽，克隆進PGEM-T載體，測序驗證，獲得載體pGEM-Bbsp ；以pEASY-serpin為模版， 用P4與P5擴增serpin基因的成熟蛋白區域(去除了 N端23個自身信號肽，信號肽的分析見圖1)，克隆進 pGEM-T 載體,得 pGEM-serpin; NotI 與 SpeI 雙酶切 pGEM-Bbsp,回收 Bbsp 片段(90bp);XbaI 與 SmaI 雙酶切 pGEM-serpin,得 serpin 成熟區域片段(1362bp)。將 Bbsp 與 serpin 共同構建進pUC-Pgpda-TtrpC,得pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC載體，如圖 2 所不。XbaI 單酶切 pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 載體，回收 Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 片段(4. 4kb),構建進 pK2_BAR:GFP 載體，得 pK2_BAR:GFP-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 質粒并轉入根癌農桿菌LBA4404，其質粒圖譜見圖3。
3.真菌遺傳轉化及鑒定利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法將上述表達原件轉化進球孢白僵菌野生型 Bb0062菌株(球抱白僵菌{Poauvoria bassi ana ) Bb0062分離自感染的菜青蟲(/Yeri1S ra/κθ，保存于西南農業大學生物技術中心，也可以從公知途徑獲得，例如CCTCC AF93297 或從其它途徑分離得到)。以引物P8和P4驗證球孢白僵菌轉化子，反應體系12.5 UL2X Taq mixture, 上下游引物各I μ L (10 μ m)，50ng基因組DNA，加水補至25yI^PCR 反應參數94°C (5 min) ; 32 個循環94°C (30 s)，56°C (30sec), 72 (2min) ; 72°C (5 min),預期片段大小1.9kb。1. 2%瓊脂糖電泳檢測，結果如圖4所示。
M, MBI 公司的 X/Eco911 15 ；C,以 pK2-BAR:GFP-Pgpda_Bbsp: serpin-Ttrp C質粒為模版的陽性對照；WT，以球孢白僵菌野生型菌株DNA為模版；58 67，不同的 Bbsp: serpin轉化子。結果顯示,58,63,67轉化子與陽性對照有相同大小的條帶,表明均有目的基因的轉入。
二、轉化子的毒力測定實施例2O. 05%的無菌Tween-80收集野生型球孢白僵菌和Bbsp: serpin轉化子的孢子，潤旋，四層擦鏡紙過濾，離心，調節孢子終濃度I X IO8 5 X IO6個/mL。將配制好的孢子懸液采用體表接種的方法接種大蠟螟，以O. 05% Tween-80為空白對照。結果表明與野生型菌株相比，在接種后96h，serpin轉化子的半致死濃度降低了 3. 5倍，即在該條件下，轉化子只需不到野生型菌株1/3的濃度即可達到與野生型相同的殺蟲效果；在5X IO6個/mL的孢子濃度下濃度下，半致死時間縮短了 14%。該結果表明，通過在殺蟲真菌中超量表達serpin可以顯著提高菌株的殺蟲效果。
三、真菌在昆蟲血腔中的增殖觀察實施例3
以O. 85%的NaCl準備野生型菌株和轉基因菌株的孢懸液(I X IO7個/ml)，以大蠟螟為試蟲，每只蟲注射4μ L的孢懸液，置于26°C飼養。每隔12h取血淋巴觀察蟲菌體的數量。 結果如圖5所示，與野生型菌株相比，轉基因菌株(serpin菌株)在昆蟲血淋巴中的增殖速度得到顯著提高。昆蟲為家蠶，A，接種O. 85% NaCl ;B，接種I X IO7個/ml球孢白僵菌野生型菌株；C,接種IXlO7個/ml Bbsp: serpin轉球孢白僵菌菌株。圖示為接種后36h的觀察結果。
以上對本發明的詳細描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明做出各種改變和變形，只要不脫離本發明的精 神，這些改變和變形均應屬于所附權利要求的范圍。
權利要求
1.一種重組絲氨酸蛋白酶抑制子，其特征在于，采用分子生物學技術構建一個重組核苷酸序列，其含有編碼球孢白僵菌Uiemvoria bassiana )幾丁質酶的信號肽序列與編碼果蠅的絲氨酸蛋白酶抑制子基因，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述重組絲氨酸蛋白酶抑制子的構建方法，其特征在于，包括如下步驟 1)果蜆serpin基因的克隆 在果蠅的serpin基因中(NM_080112)，有一個內含子，利用PCR互搭的方法去除內含子；分別以P1/P2，P3/P4為引物；引物序列如下 Pl: 5’ -GAATTCATGGCGAGCAAAGTCTCGATCCTTCTCCTGC-3，,下劃線序列為 EcoRI 位點； P2: 5’ -GGGGTACGAACTTGGCATAGGAAGCTGCCGAGGCC-3’ ；P3: 5’ -GGCCTCGGCAGCTTCCTATGCCAAGTTCGTACCCC-3’ ； P4: 5，-CCCGGGTTAGACGCTCATGGGCGTGGGAT-3，(下劃線序列為 SmaI 位點)， 果蠅基因組DNA為模版，用Phusion DNA聚合酶(NEB)擴增serpin基因的N端和C端；反應體系5 μ L 5XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP,上下游引物各 Ιμ (ΙΟμπι), O. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,總體積 25 μ L ； PCR 反應參數98°C (2 min) ;30 個循環98°C (20 s)，56°C (30sec), 72 (Imin)，72°C (5 min)；分別回收N端(1222bp)和C端(139bp)片段，進行無引物組裝；反應體系5 μ L 5 XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP, N端片段(50ng), C 端片段(50ng)，O. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,總體積 25 μ L ； 以上述組裝產物為模版，以Pl和Ρ4為引物擴增全長的serpin cDNA序列，克隆進pEASY-Blunt載體(全式金產品)；測序正確的載體命名為pEASY-serpin ； 2)融合基因的構建 設計引物P5-P7,構建Bbsp: serpin的融合基因； 引物序列如下 P5: 5，-TCTAGAGAGCTCATCGCTTGGCAACG-3，，下劃線序列為 XbaI 位點； P6: 5’ -AAAAAAGCGGCCGCATGGCTCCTTTTCTTCAAACC-3’,下劃線序列為 NotI 位點； P7: 5’ -GGACTAGTGCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3’，下劃線序列為 SpeI 位點； 以球孢白僵菌CZfeawreria Bassiana)基因組為模版，用P6和P7擴增球孢白僵菌幾丁質酶基因Bbchitl的信號肽，克隆進pGEM-T載體(Promega),測序驗證，獲得載體pGEM-Bbsp ；以pEASY-serpin為模版，用P4與P5擴增serpin基因的成熟蛋白區域，克隆進pGEM-T 載體，得 pGEM-serpin ； NotI 與 SpeI 雙酶切 pGEM-Bbsp，回收 Bbsp 片段(90bp) ；XbaI 與 SmaI 雙酶切pGEM-serpin,得 serpin 成熟區域片段(1362bp)。
3.—種重組蛋白的真菌表達載體，其特征在于，將權利要求2所述Bbsp (90bp)與serpin (1362bp)共同構建進 pUC-Pgpda-TtrpC,得 pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 載體，其具有融合蛋白Bbsp:serpin的表達原件,上游含有一個真菌組成性啟動子Pgpda,下游含有一個終止子TtrpC。
4.一種重組蛋白的殺蟲真菌劑，其特征在于，將權利要求3所述的載體pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 用 XbaI 單酶切，得融合蛋白 Bbsp: serpin 的表達原件Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 片段(4. 4kb)，構建進真菌表達載體 pK2_BAR:GFP，得 pK2_BAR:GFP-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC質粒并轉入根癌農桿菌LBA4404 ;利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法得到組成性表達Bbsp: serpin的殺蟲真菌轉化子。
全文摘要
重組絲氨酸蛋白酶抑制子、真菌表達載體及其殺蟲真菌劑。本發明涉及一種重組絲氨酸蛋白酶抑制子，采用分子生物學技術構建一個重組核苷酸序列，其含有編碼球孢白僵菌(Beauveriabassiana)幾丁質酶的信號肽序列與編碼果蠅的絲氨酸蛋白酶抑制子基因，其具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本發明所獲得的重組絲氨酸蛋白酶抑制子具有可以抑制昆蟲的免疫反應，增強真菌在血腔中的增殖速度，從而提高殺蟲真菌毒力的特性。
文檔編號C12N15/62GK103030692SQ20121058211
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者范艷華, 裴炎, 楊琳芝, 張永軍, 金丹, 羅志兵, 李先碧 申請人:西南大學