專利名稱：用于鼻咽癌易感基因snp位點檢測的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒。
背景技術：
鼻咽癌是鼻咽上皮來源的惡性腫瘤，多發于鼻咽頂部和咽隱窩，是一種多因素影響的復雜性疾病，其發生及發展與遺傳因素、環境因素及EBV病毒感染密切相關。中國是世界鼻咽癌高發區，據世界衛生組織統計，2008年，中國新發病例占全球39. 2%(33101人)，因鼻咽癌死亡病例占全球40. 5% (20899人)；并且，鼻咽癌好發于壯年，嚴重影響人民健康和經濟發展。近幾年，巴德年院士提出的現代“3P”醫學理念正不斷得到推廣。“3P”醫學模式，即預測(Prediction)、預防(Prevention)和個體化診療(Personalization),強調利用個體基因組等信息，進行疾病的預測和防治，對于疾病的態度由“重治”轉變為“重防”。同樣，鼻咽癌的防治關鍵將是進行患病高危人群的篩查，提高早診率。臨床研究發現，鼻咽癌早期治療效果遠高于晚期。臨床分期是影響治療效果的重要因素，早期無局部淋巴結轉移鼻咽癌的5年生存率(75. 7%)遠高于淋巴結轉移鼻咽癌(58. 2%)和晚期遠處轉移鼻咽癌(34. 9%)。然而，目前仍然缺乏有效的用于高危人群篩查、早期診斷方法策略，加上鼻咽癌的早期癥狀無特異性和原發部位較隱蔽，不易被發現，80%鼻咽癌患者就診時已處于中晚期，治療效果不理想，導致臨床上鼻咽癌的5年生存率一直徘徊于60%左右。進行鼻咽癌高發區人群篩選，能夠篩選患病高危人群，提高鼻咽癌早診率，是提高治療效果的關鍵。因而，開發鼻咽癌發病風險預測、用于鼻咽癌高危人群篩查 的新型手段具有重要的意義。目前臨床上提高鼻咽癌早期診斷率主要是通過提高個人健康意識，結合鼻咽腔檢查，并利用EB病毒抗體檢測技術以評估EB病毒感染情況(詳見專利CN92114135 “一種檢測EB病毒抗體的顯色試劑及其制造方法”;CN200710027841 “檢測多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒及其制備方法” ；CN201010255146 “EB病毒IgA抗體檢測試劑盒(膠體金法)及制備方法”;CN200710029366.1 “檢測EB病毒gp78抗體的CBA試劑盒及其制備方法”等)。但是，這種策略難以應用于大規模人群的高危人群篩查，難以應用于鼻咽癌的早期預防、預警，也未能夠有效地提高早診率。因此，根據個體攜帶鼻咽癌易感基因情況，進行鼻咽癌發病風險預測，對于確定鼻咽癌高危人群，提高鼻咽癌早診率，顯得非常重要。在其它相關的惡性腫瘤研究當中，研究者能夠利用個體攜帶易感基因的情況，對其發病風險進行預測。例如，分別攜帶BRCAl和BRCA2基因突變的女性，罹患乳腺癌的相對風險分別是正常群體的5 - 45倍和9 一 21倍；并且，Antoniou等人通過7個風險相關位點聯合分析發現，在BRCA2突變攜帶者中，5%高危組到80歲時發生乳腺癌的可能性為80 96%，而低危組僅為42 50%，指出這些患病風險差異可以用于指導臨床方案。然而，目前缺乏有效的鼻咽癌發病風險預測產品。雖然已有個別申請專利根據鼻咽癌相關基因PLUNC的C-2128T位點、C-1888T位點或由此兩位點組成的單倍型來判定個體對鼻咽癌是否易感的方法(詳見專利CN200510008650. 1“一種檢測與鼻咽癌相關的易感基因PLUNC基因型的方法及PLUNC易感基因”)，然而，該方法僅針對極少數的指標檢測，準確率較低；并且，該方法可靠性有待于大規模人群樣本進行驗證。另外，有大量研究證實惡性腫瘤家族史及一些環境暴露因素(如食用腌制食品的歷史、既往吸煙飲酒史、攝取新鮮水果蔬菜及其他食品量、食用中草藥的歷史等)與鼻咽癌的發生有關系，綜合考慮遺傳因素和環境因素對鼻咽癌發病風險進行預測是必要的。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，該試劑盒可用于同時檢測多個鼻咽癌易感基因的SNP位點，可以為個體罹患鼻咽癌風險程度、鼻咽癌高發區人群普查，篩查鼻 咽癌發病高危人群以及進行相應預防措施提供參考。本發明所述的一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，所述試劑盒包括檢測鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點rs2860580的PCR擴增引物和單堿基延伸引物；檢測鼻咽癌易感基因TNFRSF19區域的SNP位點rsl572072和rs9510787的PCR擴增引物和單堿基延伸引物；檢測鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點rs28421666、rs2860580和rs2894207的PCR擴增引物和單堿基延伸引物；檢測鼻咽癌易感基因MDSl-EVII的SNP位點rs6774494的PCR擴增引物和單堿基延伸引物。根據本發明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒的進一步特征，所述檢測鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點rs2860580的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID N0:3。根據本發明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒的進一步特征，所述檢測鼻咽癌易感基因TNFRSF19區域的SNP位點rsl572072的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID N0:6。根據本發明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒的進一步特征，所述檢測鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點rs28421666的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO:9。根據本發明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒的進一步特征，所述檢測鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點rs2860580的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQID NO: 10和SEQ ID NO: 11，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO: 12。根據本發明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒的進一步特征，所述檢測鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點rs2894207的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQID NO: 13和SEQ ID NO: 14，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO: 15。根據本發明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒的進一步特征，所述檢測鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位點rs6774494的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO: 18。根據本發明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒的進一步特征，所述檢測鼻咽癌易感基因TNFRSF19的SNP位點rs9510787的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO:21。本發明所述的試劑盒以是以本發明人的基于大規模樣本量的鼻咽癌人群和正常人對照人群及全基因組水平鼻咽癌易感基因篩查結果的前期研究為基礎，結合其它已知的鼻咽癌相關易感基因，選擇7個單核苷酸多態性位點(SNP)進行制備的。采取受檢者外周血、唾液或漱口水來源的基因組DNA，在本發明所述的試劑盒上進行基因分型檢測，再利用多重PCR擴增及桑格(Sanger)測序方法，檢測這7個單核苷酸位點，綜合分析環境因素(腌制食品食用史、既往吸煙史、新鮮水果蔬菜食用量)、腫瘤家族史及鼻咽癌易感基因位點單核苷酸多態性(SNP)信息，利用遺傳風險計分模型，推測受檢者罹患鼻咽癌的風險程度，克服了現有的僅僅通過檢測EB病毒感染情況、或者依靠極少數的易感基因指標的等結果來進行鼻咽癌發病風險判斷的不足。本發明所述的試劑盒能夠在受檢者任何一個年齡階段進行檢測，結合受檢者環境暴露因素，提示受檢者不同時期罹患鼻咽癌的風險程度，能夠進行大規模人群普查、篩選鼻咽癌發病高危人群，實現鼻咽癌發病風險預測、預警，提高早診率。
具體實施例方式1、本發明所述的試劑盒所檢測的受檢者基因組SNP位點(7個)通過本發明人大規模樣本量的鼻咽癌全基因組關聯分析，得到與鼻咽癌發病顯著相關的SNP，另外結合HapMap，dbSNP等數據庫挑選出SNP位點，并進行位點實驗成功率評分，確定要進行研究的7個SNP位點。其中，rsl412829位于基因⑶KN2A-⑶KN2B區域，rsl572072 和 rs9510787 位于基因 TNFRSF19 區域，rs2860580、rs2894207 和 r s28421666位于基因HLA區域，rs6774494位于基因MDSl-EVII區域。表1、與鼻咽癌發病顯著相關的7個SNP位點
位點名稱序列rs!412829TTAG 丁AGTACTACACATATCATGCTTTGGCfAAACTCTACCCATGA GATTCATATTCAAGCIA/G |TGAGGA ATGGCAAAAG AAAATAC AG AAATAGTGATAGTAACCATAGCAATGGTAATAAGArs!572072GGTGAGGTmGGGAAAGCTTCCAGATCAGTCTTTTTTTTTCGGTT GTTAAGCATCCTTCT[T/G]TCCTACTTCTCTCCATATATATACAAAT ACATAATAAATATTCCTATAGAGTTTTTAATGrs28421666ACTACAAAGACTAATATTACAATTCTGTAAATGTATCTATACTGTG
ATATTTATATTTAT[A/G]AAAACAGGAAGGATCTTAATGACACTCA GAAGACTAGAATTAGATGATAGAAGAACGACTrs2860580TGATGGTTTTATAAGGGGCTTTTCCCTGCTTCATTGTGCATTTCTC TCTCCTGTCACCAC|A/G|TGAAGAAGCfACGGGTTTGCTTCCACTT CTGCCATGACTGTAAGTTTCCTGGGGCAGCCTCrs2894207TACTTCACACCACAi ATAAAAATTACCTCAGTGTATCAAAGACCT AAATGTGAGACTTAAj TC |ATTAGAGAACTCTTAG AAGAAAACAT AAGCATAAATCTTCATGACTTTGGATTAGGTAAArs6774494CAAACAGATCTATCTTACTTACATTTACCAAATCAATTTAATTTTT ACAGGCCATGGCTTI AG IGTGACATATTGACTGTTrTCCTTAATGG C ATCTACCGTATTTAATGCAAGG ATGTC ATCTrs9510787AGCTGGGCTGACCTGCAACTCTTAGGAATTGTATGTGGCTTCATA GTCTTAGAAGACAGC|A/G]AGCAGTTGTTTGCACCAATAAGTAAT AAATCACATTATTAAAAG 丁丁 TATTATTTTCCAAA
2.設計待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物并合成。表2、待測SNP位點的PCR擴增引物(PCRP )及單堿基延伸引物(UEP )
權利要求
1.一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點rs2860580的PCR擴增引物和單堿基延伸引物；檢測鼻咽癌易感基因TNFRSF19區域的SNP位點rsl572072和rs9510787的PCR擴增引物和單堿基延伸引物；檢測鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點rs28421666、rs2860580和 rs2894207的PCR擴增引物和單堿基延伸引物；檢測鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位點rs6774494的PCR擴增引物和單堿基延伸引物。
2.根據權利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，其特征在于 所述檢測鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點rs2860580的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :3。
3.根據權利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，其特征在于 所述檢測鼻咽癌易感基因TNFRSF19區域的SNP位點rsl572072的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :6。
4.根據權利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，其特征在于 所述檢測鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點rs28421666的兩個PCR擴增引物，其序列分別為 SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :9。
5.根據權利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，其特征在于 所述檢測鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點rs2860580的兩個PCR擴增引物，其序列分別為 SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :12。
6.根據權利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，其特征在于 所述檢測鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點rs2894207的兩個PCR擴增引物，其序列分別為 SEQ ID N0:13和SEQ ID NO : 14，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :15。
7.根據權利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，其特征在于 所述檢測鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位點rs6774494的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQ ID N0:16和SEQ ID NO : 17，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQID NO 180
8.根據權利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒，其特征在于 所述檢測鼻咽癌易感基因TNFRSF19的SNP位點rs9510787的兩個PCR擴增引物，其序列分別為SEQ ID NO 19和SEQ ID NO :20，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ IDNO :21。
全文摘要
本發明涉及一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點檢測的試劑盒。本發明所述的試劑盒包括檢測鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點rs2860580的PCR擴增引物和單堿基延伸引物；檢測鼻咽癌易感基因TNFRSF19區域的SNP位點rs1572072和rs9510787的PCR擴增引物和單堿基延伸引物；檢測鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點rs28421666、rs2860580和rs2894207的PCR擴增引物和單堿基延伸引物；檢測鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位點rs6774494的PCR擴增引物和單堿基延伸引物。本發明所述的試劑盒可用于同時檢測多個鼻咽癌易感基因的SNP位點，可以為個體罹患鼻咽癌風險程度、鼻咽癌高發區人群普查，篩查鼻咽癌發病高危人群以及進行相應預防措施提供參考。
文檔編號C12Q1/68GK103045743SQ20121058427
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者曾益新, 賈衛華, 崔倩, 貝錦新, 阮紅蓮 申請人:中山大學腫瘤防治中心