專利名稱：一種核酸疫苗、核酸疫苗免疫佐劑及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸疫苗免疫佐劑，即真核表達質粒PCDNA-1L-2和pcDNA-1L-4 對PRRSV核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫作用具有顯著增強作用，可以作為該核酸疫苗的免疫佐劑。
背景技術：
目前對于PRRS的防控，免疫預防仍是主要措施。雖然不同毒株的弱毒疫苗和滅活疫苗相繼上市，但滅活疫苗免疫效果的不穩定性，弱毒疫苗在存在著毒力返強及散毒的風險，因此開發安全有效的新型疫苗成了研究的重點。目前研究表明，核酸疫苗免疫后可使外源基因在動物體內表達，刺激機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫，尤其是能誘導產生細胞毒T細胞，對病毒、胞內寄生的細菌和寄生蟲引起的傳染病具有預防和治療作用，且對不同血清型的毒株具有交叉保護性，因此核酸疫苗被譽為第三次疫苗革命。根據大量的關于PRRSV基因的研究，結果顯示，PRRSV的0RF5基因是研制基因工程疫苗的首選材料，用含編碼0RF5的質粒對豬進行免疫，可使豬產生抗0RF5的特異性中和抗體，且免于強毒攻擊造成的全身性病毒血癥和肺部病變。雖然核酸疫苗在試驗研究中顯示出了較好效果，但是其免疫效果還不太理想，而使用免疫佐劑是提高核酸疫苗免疫效果的一種重要手段，目前常用的免疫佐劑主要有細胞因子佐劑、協同刺激分子佐劑和CpG DNA序列佐劑，其中細胞因子是研究比較廣泛的核酸疫苗佐劑，現已證實IL-1、IL-2、IL-4、和IL-18的白細胞介素具有良好的佐劑作用。發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種核酸疫苗免疫佐劑，即真核表達質粒 pcDNA-1L-2和pcDNA-1L-4，這種核酸疫苗免疫佐劑對PRRSV核酸疫苗pcDNA_0RF5的免疫作用具有顯著增強作用，可以作為該核酸疫苗的免疫佐劑。
本發明的技術方案豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐劑，包含真核表達質粒 pcDNA-1L-2 和 pcDNA-1L-4。
所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐劑的制備方法(1)根據GenBank登錄的豬IL-2基因mRNA序列和IL-4基因mRNA序列分別設計I對克隆IL-2和IL-4全基因引物，并在引物的5'端分別設計BamH I和EcoR I限制性內切酶位點，擴增長度分別為542bp和427bp ；(2)采集健康長白豬前腔靜脈血外周血，進行淋巴細胞的分離與培養，提取總RNA，進行 RT-PCR擴增IL-2和IL-4基因并對目的基因進行回收純化，目的基因與PMD19-T載體進行連接得到重組質粒，重組質粒轉化、菌落PCR，重組質粒的抽提、酶切鑒定、DNA序列測定和分析，得到陽性質粒PMD19-T-1L-2和pMD19_T-1L_4 ；(3)獲取真核表達載體pcDNA3.1 (+)，然后對pMD19-T-1L-2、pMD19-T-1L_4和真核表達載體pcDNA3.1 (+)進行雙酶切、連接、轉化、酶切鑒定和測序，最后構建經測序正確的真核表達質粒 pcDNA-1L-2 和 pcDNA-1L-4。
所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的制備方法，(1)根據GenBank上發表的PRRSVGuizhou-1 0RF5基因序列，設計一對擴增0RF5基因的特異性引物，并分別在引物的5'端設計BamH I和EcoR I限制性內切酶位點；擴增長度 603bp ；(2)將豬繁殖與呼吸綜合征病毒貴州分離株病毒懸液接種于Marc-145細胞單層細胞， 待出現細胞病變時收獲細胞，然后提取總RNA，進行RT-PCR擴增ORF基因，并對目的基因進行回收純化，構建克隆載體PMD19-T-0RF5、酶切鑒定和測序；(3)獲取真核表達載體pcDNA3.1 (+)，然后對pMD19-T-0RF5和真核表達載體 pcDNA3.1 (+)進行雙酶切、連接、轉化、酶切鑒定和測序，最后構建經測序正確的真核表達質粒 pcDNA-0RF5。
所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐劑的制備方法中的引物序列如下IL_2上游引物(F) :5, - CGGGATCCC TCACAGTAACCTCAACTCCT -3 '、IL-2 下游引物(R) :5 ' -CGGAATTCGCCTGATACATTTAACATG AGAG-3 ' ;IL_4 上游引物(F):5 ' - CGGGATCCTTCATGGGTCTCACCTC _3 '、IL-4 下游引物(R) :5 '-CGGAATTCTCAGCTTCAACAC TTTGA -3/ 。
所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的制備方法中的引物序列如下0RF5 上游引物(F) 5/ - CGGGATCCATGTTGGGGAAGTGCT-3'、0RF5 下游引物 (R):5' - CGGAATTCCTAGAGACGACCCCATT-3'。
本發明的有益效果IL_4是由抗原或有絲分裂原誘導Th2細胞、嗜酸性粒細胞、 嗜堿性粒細胞和肥大細胞產生，是Th2細胞受刺激后產生的主要細胞因子。IL-4具有重要的免疫功能，如能增強B細胞對T細胞的抗原提呈作用，增加B細胞與T細胞的相互作用， 調節B細胞的生長分化及其對抗原刺激的應答，包括增殖和分泌抗體，參與抗體類別轉換， 誘導抗體從IgM向IgE、IgI或IgGl轉換，以及IgG向IgE轉換。IL- 4可以促進50%的休止T細胞進行分裂，使ThO細胞向Th2細胞分化，是Th2細胞分泌的自我調節生長因子，它還能增強巨噬細胞的抗原遞呈能力及對腫瘤細胞的細胞毒作用。
豬IL-2分子佐劑促進細胞免疫應答的效果比豬IL-4分子佐劑好，這可能是由于 Thl型白細胞介素(IL-2)主要參與細胞介導免疫應答，Th2型白細胞介素(IL-4)通常參與 B細胞活化并調節抗體的產生，主要調節機體體液免疫應答，IL-4能抑制T細胞表達IL-2 受體。試驗結果顯示用純化蛋白加免疫佐劑可以提高仔豬的抗體陽性率，質粒免疫和純化蛋白免疫與豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)免疫的的仔豬抗體的陽性率相同，證明了 GP5蛋白具有良好的免疫效果，核酸疫苗和亞單位疫苗具有很大的研究潛力。也說明細胞因子IL-2和IL-4構建的真核表達質粒pcDNA-1L-2和pcDNA-1L-4合用作為豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗的免疫佐劑具有明顯明顯增強其免疫效果。具體實施例
為了驗證本發明的效果進行了如下實驗I材料與方法1.1病毒、細胞、細菌和實驗動物
PRRSV病毒貴州分離株(PRRSV Guizhou-1株)由貴州大學動物生物技術中心實驗室分離鑒定保存；Marc-145細胞，由中國獸藥監察所寧宜寶研究員贈送，本實驗室傳代保存；ToplO感受態細胞、BL21(DE3)感受態細胞，購自TaKaRa公司；6 8周齡Balb/c小白鼠，購自貴陽醫學院；長白豬(經ELISA檢測PRRS抗體陰性)，購自貴州大學種豬場。1. 2主要試劑
克隆載體 PMD19-T vector、T4 DNA Ligase、限制性內切酶 BamH I 和 EcoR1、RNaseInhibitor,dNTPs,DL2000 DNA Marker,DL15000 DNA Marker,5 X RT Buffer,Taq DNA 聚合酶等，購自寶生物(大連)工程有限公司；TRIzol LS Reagent、SuperscriptTM III ReverseTranscriptase,購自 Invitrogen 公司；Gel Extraction Kit (50 X)試劑盒和 E. Z. N. A. TMPlasmid Mini Kit質粒提取試劑盒,購自OMEGA公司；pcDNA3.1 (+)真核表達載體,本實驗室保存；豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)，購自中牧生物藥業有限公司；豬高免血清由貴州省疫病研究室制備；LSI豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒；購自北京祥龍環宇生物技術有限公司；Rat Ant1-Mouse CD3-SPRD，Rat Ant1-Mouse CD4/L3T4-FITC，Rat Ant1-Mouse CD8a/Ly-2-PE, Mouse Ant1-Porcine CD3-SPRD, Mouse Ant1-PorcineCD8a-PE，Mouse Ant1-Porcine CD4a_FITC，購于SBA ;引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。1. 3引物設計
根據GenBank登錄的豬IL-2基因mRNA序列(登錄號X58428)、IL-4基因mRNA序列(登錄號NM-214123.1)和PRRSV Guizhou-1 0RF5基因序列(登錄號EU259060)，應用DNAStar軟件，設計了 3對引物，用于擴增IL-2、IL-4和PRRSV 0RF5目的基因，并在上下游引物的5'端分別設計BamH I和EcoR I限制性內切酶位點，引物的序列(見表I)。
表I引杓字刃
Tsm
權利要求
1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗PCDNA-0RF5的免疫佐劑，其特征在于包含核表達質粒pcDNA-1L-2和pcDNA-1L-4。
2.如權利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐劑的制備方法，其特征在于 (1)根據GenBank登錄的豬IL-2基因mRNA序列和IL-4基因mRNA序列分別設計I對克隆IL-2和IL-4全基因引物，并在引物的5'端分別設計BamH I和EcoR I限制性內切酶位點，擴增長度分別為542bp和427bp ； (2)采集健康長白豬前腔靜脈血外周血，進行淋巴細胞的分離與培養，提取總RNA，進行RT-PCR擴增IL-2和IL-4基因并對目的基因進行回收純化，目的基因與PMD19-T載體進行連接得到重組質粒，重組質粒轉化、菌落PCR，重組質粒的抽提、酶切鑒定、DNA序列測定和分析，得到陽性質粒PMD19-T-1L-2和pMD19_T-1L_4 ； (3)獲取真核表達載體pcDNA3.1 (+)，然后對pMD19-T-1L-2、pMD19-T-1L-4和真核表達載體pcDNA3.1 (+)進行雙酶切、連接、轉化、酶切鑒定和測序，最后構建經測序正確的真核表達質粒 pcDNA-1L-2 和 pcDNA-1L-4。
3.如權利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的制備方法，其特征在于 (1)根據GenBank上發表的PRRSVGuizhou-1 0RF5基因序列，設計一對擴增0RF5基因的特異性引物，并分別在引物的5'端設計BamH I和EcoR I限制性內切酶位點；擴增長度603bp ； (2)將豬繁殖與呼吸綜合征病毒貴州分離株病毒懸液接種于Marc-145細胞單層細胞，待出現細胞病變時收獲細胞，然后提取總RNA，進行RT-PCR擴增ORF基因，并對目的基因進行回收純化，構建克隆載體PMD19-T-0RF5、酶切鑒定和測序； (3)獲取真核表達載體pcDNA3.1 (+)，然后對pMD19-T-0RF5和真核表達載體pcDNA3.1 (+)進行雙酶切、連接、轉化、酶切鑒定和測序，最后構建經測序正確的真核表達質粒 pcDNA-0RF5。
4.根據權利要求2所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐劑的制備方法，其特征在于引物序列如下IL_2上游引物(F) :5' - CGGGATCCCTCACAGTAACCTCAACTCCT -3 '、IL-2 下游引物(R) :5 ' -CGGAATTCGCCTGATACATTTAACATGAGAG-3' !比-斗上游引物^)^' - CGGGATCCTTCATGGGTCTCACCTC -3'、IL-4 下游引物(R):5' - CGGAATTCTCAGCTTCAACAC TTTGA -3/ 。
5.根據權利要求3所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因核酸疫苗pCDNA-0RF5的制備方法，其特征在于引物序列如下0RF5上游弓丨物(F):5 ' - CGGGATCCATGTTGGGGAAGTGCT-3 '、0RF5 下游引物(R): 5 '-CGGAATTCCTAGAGACGACCCCATT-3'。
全文摘要
本發明公開一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫佐劑，包含真核表達質粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4。細胞因子IL-2和IL-4構建的真核表達質粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4合用作為豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗的免疫佐劑具有明顯明顯增強其免疫效果。
文檔編號C12N15/66GK103028114SQ20121058398
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者湯德元, 曾智勇, 李春燕, 馬萍, 王彬, 劉霞, 陶玉順 申請人:貴州大學