解木聚糖擬桿菌物種微生物的制作方法

解木聚糖擬桿菌物種微生物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及包含解木聚糖擬桿菌物種微生物的食品，尤其發酵食品和益生食品。這些微生物特別地特征為對于人類消費具有十分低的致病性和高度安全性。另外，提供了用于產生、尤其通過發酵產生所述食品的方法，以及合適的解木聚糖擬桿菌細菌菌株。
【專利說明】解木聚糖擬桿菌物種微生物
發明領域
[0001]本發明涉及包含微生物的食品。具體而言，提供包含解木聚糖擬桿菌(Bacteroides xylanisolvens)物種微生物的食品。另外，本發明提供這些微生物在發酵中的用途。
[0002]發明背景
[0003]含有細菌作為有機組成部分或生產助劑的食品是本領域長久已知的。具體而言，酸性發酵的發酵食品，例如酸奶，干酪，生香腸和蔬菜，是我們營養的有機組成部分。多種方法用于產生發酵食品，其中例如利用自發性發酵使用或專門添加微生物添加至食品原料。當前的發酵方法特別地基于添加起子培養物至相應的食品原料(例如乳，以產生酸奶或干酪)。與傳統的生產過程對比，起子培養物提供多種益處。例如，經濟損失因缺陷性生產更少和縮短生產過程而防止。另外，原料通常可以反應得更好。還由于可以利用各種起子培養物的混合物，所以就味道、安全性和均質性而言，結果經常更好。可以產生在生產過程中不定向干預情況下否則將是不可能的產品。
[0004]開發和改善已知發酵過程的一個基本目標是形成并選擇用于發酵過程的適宜微生物，因為它們決定性地影響發酵過程。所用微生物的代謝活性決定了例如成品的香味、酸化程度和/或顏色。另外，當積極地影響健康狀況或代謝時，微生物對營養領域具有巨大的潛力。積極影響顧客健康的發酵食品的一個已知例子涉及益生食品。益生菌是以足夠量消費時對顧客具有促進健康影響的活微生物制備物。益生性乳酸細菌使用得最長久，不過也使用酵母和其他物種。
[0005]如今使用的大部分益生菌株屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium),僅少數屬于其他屬如腸球菌屬(Enterococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)或鏈球菌屬(Streptococcus)。主要原因在于乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)常存在于發酵食品中并因此通常視為對人類安全。在人類中使用非傳統物種的建議總體上激起關于潛在不利作用的更大憂慮。因此，當前的益生菌株主要因而其主流接受性而選擇一 一個排除健康特性好得多的潛在菌株的選擇過程。
[0006]例如，占據人結腸小生物群20%到至多40%的擬桿菌屬微生物通常不用于發酵或用作益生菌株。這是令人驚訝的，因為已知某些擬桿菌屬物種(Bacteroides sp.)擁有有益于人類健康的許多功能。擬桿菌擁有參與糖發酵、含氮物質利用和膽酸和其他類固醇生物轉化的獨特代謝活性。另外，已經顯示擬桿菌含有具備免疫調節作用并強烈參與宿主免疫系統發育及維持其對抗病原體和疾病的能力的某些多糖抗原。
[0007]然而，一些擬桿菌菌株可能參與在特定條件下嚴重腸外感染的形成。因此，一些菌株被劃歸為條件致病菌并且可以遭致一些安全顧慮。例如，卵形擬桿菌(Bacteroides ovartus)微生物未被劃入最低安全性微生物類別中并且因此具有潛在致病風險。
[0008]鑒于此，本發明的一個目的是包含滿足高度安全標準的微生物并且因此可以安全用于人類消費的食品。具體而言，一個目的是涉及益生食品。
[0009]發明簡述
[0010]本發明人已經發現可以有利地使用解木聚糖擬桿菌物種微生物作為食品、尤其發酵食品和益生食品中的食品添加劑或食品成分。含有解木聚糖擬桿菌物種微生物的食品具有以有活力形式或以無活力形式使用的所述微生物提供的多種有利特性。具體而言，這些微生物具有十分低的致病性并且因此對于人類消費是高度安全的，并且產生有利的短鏈脂肪酸。
[0011]解木聚糖擬桿菌是由Chassard等人首次描述的擬桿菌屬新物種(“Bacteroides xylanisolvens sp.Nov., a xylan-degrading bacterium isolatedfrom human faeces” ； International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(2008) ; 58，1008-1013)。其是降解木聚糖的革蘭氏陰性桿狀細菌，該細菌可以從人糞便分離并因此是人共生性微生物。解木聚糖擬桿菌作為DSM18836保藏在德意志微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH) (DSMZ), Inhoffenstraβ e7B, 38124Braunschweig(DE)并且是從此處可公開獲得的。然而，其在食品中的用途不是本領域已知或提出過的。
[0012]可以顯示解木聚糖擬桿菌物種微生物不具有致病性并且因此可以在沒有造成不良副作用的高風險情況下消費，尤其由人消費時。另外，因致病性低，所以不存在法定規定對制造、分銷和銷售解木聚糖擬桿菌物種微生物通的嚴重限制，這因此可以在很少努力情況下就得以滿足。具體而言，根據歐盟指令2000/54/EC和德國“生物材料規定” (“Biostoffverordnung” ),將解木聚糖擬桿菌微生物劃歸為第I風險組的生物因子。第I風險組是4個風險組的最低者并且涉及不可能造成人類疾病的生物因子。將許多其他微生物(還包括其他擬桿菌屬物種微生物)劃分在更高的風險組(例如卵形擬桿菌是第2風險組的生物因子)。
[0013]因此，在第一方面，本發明提供包含解木聚糖擬桿菌物種微生物的食品。
[0014]在第二方面，本發明提供一種用于產生發酵食品的方法，其中食品原料與用于發酵的起子培養物組合，特征在于添加解木聚糖擬桿菌物種微生物。另外，提供了通過所述方法可獲得的包含解木聚糖擬桿菌物種微生物的發酵食品。
[0015]在第三方面，本發明提供一種作為DSM23964保藏的菌株CTC1、由其衍生的微生物或CTCl同源物的微生物。
[0016]如實施例中展示，本發明的微生物尤其對于質粒DNA物質、最重要的毒力因子和大部分相關胞外酶和致病因子呈陰性，并且不附著于人結腸的上皮細胞。另外，本發明的微生物在小鼠內的毒理學研究中不顯示副作用并且在服用每日劑量高達8.5*10nCTCl持續3周的人類中不顯示任何性質的副作用。因此，本發明的微生物滿足極高安全性標準并可以由人消費，而沒有不想要的副作用的風險。另外，本發明的微生物優選地對各種抗生素敏感，因此，如果需要，可以容易地和有效地消除。
[0017]另外，可以展示本發明的微生物顯示穩定和均質的細胞表面，尤其顯示可以用作產品品質標記的穩定和均質的表面碳水化合物結構表達。表面特征和尤其其碳水化合物結構可以用作含有本發明微生物的微生物培養物的均勻性的標記物，和/或可以用作培養物中本發明微生物的量的標記物。[0018]另外，本發明人已經發現本發明的微生物能夠產生短鏈脂肪酸(SCFA)。作為微生物碳水化合物發酵的終產物產生的短鏈脂肪酸(SCFA)可以具有促進健康的特性。作為例子，丙酸鹽據報道具有潛在的降低膽固醇作用和抗脂質生成作用。其還可以刺激飽滿感并且與乙酸鹽和丁酸鹽一起提供抗致癌作用。
[0019]在第四方面，本發明提供一種用于產生根據本發明第一方面的食品的方法，包括步驟:將解木聚糖擬桿菌物種微生物添加至包含至少一種食品原料的組合物或添加至加工的食品物料。另外，提供了解木聚糖擬桿菌物種微生物產生食品、尤其作為用于發酵的起子培養物的用途。
[0020]本發明的其他目的、特征、優勢和方面將因以下描述和所附權利要求書而對本領域技術人員變得清楚。然而，應當理解以下描述、所附權利要求書和表示本申請的優選實施方案的具體實施例僅以說明方式給出。處于所公開發明的精神和范圍內的多種改變和修改將因閱讀以下內容而對本領域技術人員變得容易顯見。
[0021]發明詳述
[0022]本發明人已經發現解木聚糖擬桿菌物種微生物適用于在食品中，尤其適用于人類消費。因此，在第一方面，本發明涉及包含解木聚糖擬桿菌物種微生物的食品。
[0023]根據本發明，解木聚糖擬桿菌物種微生物尤其涉及屬于擬桿菌屬并優選具有以下一個或多個特征的微生物:
[0024]a)在DNA-DNA雜交測定法中，其與作為DSM18836或DSM23964保藏的解木聚糖擬桿菌顯示至少30%、優選地至少50%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%、更優選地至少98%或至少99%的DNA-DNA親緣關系；
[0025]b)其與作為DSM18836或DSM23964保藏的解木聚糖擬桿菌顯示至少95%、優選地至少97%、至少98%或至少99%、更優選地至少99.5%的16S rRNA基因序列相似性水平；
[0026]c)其具有以下一個或多個特征:
[0027]i)作為保藏為DSM18836的解木聚糖擬桿菌，其不能夠降解淀粉；
[0028]ii)其具有利用和/或代謝甘露醇、尤其D-甘露醇、松三糖和/或山梨醇、尤其D-山梨醇和/或從丙三醇產生酸的能力；
[0029]iii)其表現谷氨酰谷氨酸芳基酰胺酶活性；
[0030]iv)其不能產生吲哚；
[0031]V)其不顯示過氧化氫酶活性；
[0032]d)其具有以下一個或多個特征:
[0033]i)其是厭氧微生物；
[0034]ii)其不形成孢子；
[0035]iii)其是非-能動的；并且
[0036]iv)其是革蘭氏陰性的。
[0037]優選地，滿足以上定義的標準a)至d)的至少兩個或至少三個并且更優選地全部標準。
[0038]術語“DNA-DNA親緣關系”尤其指兩種微生物的基因組或整個DNA的相似性百分數，如根據 De Ley 等人，(1970) Eur.J.Biochem.12，133-142 或 Hu β 等人，(1983) Syst.Appl.Microbiol.4，184-192的DNA-DNA雜交/復性測定法所測量。具體而言，DNA-DNA雜交測定法優選地由DSMZ (德意志微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH),布倫瑞克，德國)鑒定服務機構進行。在一個實施方案中，DNA-DNA雜交測定法如下文實施例1.3中所述進行。
[0039]術語“16S rRNA基因序列相似性”尤其指在第一微生物16S核糖體RNA(rRNA)基因的核酸序列的一個區域和第二微生物16S rRNA基因的核酸序列的相應區域之間相同核苷酸的百分數。優選地，該區域包含至少100個連續核苷酸，更優選地至少200個連續核苷酸，至少300個連續核苷酸或至少400個連續核苷酸，最優選地約480個連續核苷酸。在一個實施方案中，16S rRNA基因的核酸序列的區域分別旁側分布有SEQ ID NO:1和2的序列或它們的互補序列。
[0040]在優選的實施方案中，解木聚糖擬桿菌物種微生物穩定和/或均質地表達至少一種表面碳水化合物結構。穩定表達表面碳水化合物結構的微生物尤其指一組微生物，其中至少50%、優選地至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或約100%的微生物表達該表面碳水化合物結構。穩定表達表面碳水化合物結構的微生物尤其指一組微生物，其中至少50%、優選地至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或約100%的微生物以這樣的表達水平表達表面碳水化合物結構，所述表達水平與平均表達水平相距不多于50%、優選地不多于40%、不多于30%、不多于25%、不多于20%、不多于15%或不多于10%。表達表面碳水化合物結構的微生物尤其涉及以通過如本領域已知合適方法可檢測的量包含該表面碳水化合物結構的微生物。
[0041]解木聚糖擬桿菌微生物優選地能夠產生短鏈脂肪酸(SCFA)。作為微生物糖發酵的終產物產生的短鏈脂肪酸(SCFA)可以具有促進健康的特性。作為例子，丙酸據報道具有潛在的降低膽固醇作用和抗脂質生成作用。其還可以刺激飽滿感并且與乙酸和丁酸一起提供抗致癌作用。在優選的實施方案中，本發明的微生物能夠產生選自丙酸、乙酸、琥珀酸、甲酸和乳酸的一種或多種SCFA。優選地，其能夠產生丙酸和/或乙酸。在優選的實施方案中，這些SCFA還存在于含有該微生物的本發明食品中。在其中本發明食品包含處于活性形式的解木聚糖擬桿菌物種微生物的某些實施方案中，所述微生物仍能夠在消費食品后在顧客的身體內部產生所述SCFA。
[0042]在優選的實施方案中，解木聚糖擬桿菌微生物在攝入后能夠存活于胃中條件，尤其經過胃，并且優選地還存活于至少人類腸道的至少一部分中的條件，尤其經過所述部分。具體而言，存活于人類胃中的條件指在包含解木聚糖擬桿菌微生物的組合物中、尤其在本發明的食品中至少50%、優選地至少60%、至少70%、至少80%或至少85%該微生物在胃液中存活至少180分鐘。另外，存活于人類腸道中的條件指在包含解木聚糖擬桿菌微生物的組合物中、尤其在本發明的食品中至少50%、優選地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%該微生物在腸液中存活至少240分鐘。
[0043]在優選的實施方案中，解木聚糖擬桿菌微生物具有以下一個或多個安全特征:
[0044](i)其對抗生素甲硝唑、美羅培南和/或克林霉素敏感；
[0045](ii)其不含質粒 RP4(DSM3876)和 / 或質粒 pSClOl (DSM6202)；
[0046](iii)其不含β -內酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ；
[0047](iv)其不含毒力因子脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)多糖A和/或脆弱擬桿菌腸毒素Bft和/或由基因ompW編碼的“Ton B連接的外膜蛋白”；
[0048](V)其不顯示任何胞外DNA酶活性、胞外軟骨素酶活性、胞外透明質酸酶活性和/或胞外神經氨酸酶活性；和
[0049](vi)其不附著于人結腸的上皮細胞。
[0050]在一個優選實施方案中，所述解木聚糖擬桿菌微生物是
[0051]a) CTCl,其由 Glycotope GmbH, Robert-Riissle--Str.10，13125 柏林(DE)根據布達佩斯條約要求，在2010年9月I日以登錄號DSM23964保藏于德意志微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)，Inhoffenstra^ e7B, 38124 布倫瑞克(DE) (DSM23964)，
[0052] b)衍生自CTCl的微生物，或
[0053]c) CTCl 同源物。
[0054]CTCl (DSM23964)屬于解木聚糖擬桿菌物種。優選地，CTCl是嚴格厭氧、不形成孢子、非-能動和革蘭氏陰性的桿狀細菌，寬0.4-0.5μπι，長通常1_2μπι，其在Wilkins-Chalgren瓊脂上長成菌落，所述菌落在18小時后具有2_3mm直徑，圓形、乳狀、升高和凸出的表面。
[0055]衍生自CTCl的微生物和/或CTCl同源物優選地具有以下一個或多個特征:
[0056]a)其屬于如上文定義的解木聚糖擬桿菌物種；
[0057]b)在DNA-DNA雜交測定法中，其與作為DSM23964保藏的CTCl的解木聚糖擬桿菌顯示至少30%、優選地至少50%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%、更優選地至少98%或至少99%的DNA-DNA親緣關系；
[0058]c)其與作為DSM23964保藏的CTCl顯示至少95%、優選地至少97%、至少98%、或至少99%、更優選地至少99.5%、和最優選地約100%的16S rRNA基因序列相似性水平；
[0059]d)其能夠產生短鏈脂肪酸；
[0060]e)其具有上文公開的一個或多個安全特征:
[0061]f)其存活于人類胃和/或腸中的條件。
[0062]優選地，滿足以上定義的標準a)至f)的至少兩個，更優選地至少三個，至少四個或至少五個和最優選地全部標準。
[0063]如本文所用的術語“微生物”可以僅指一個單細胞生物以及指眾多的單一單細胞生物。例如，術語“解木聚糖擬桿菌物種微生物”可以指解木聚糖擬桿菌物種的一個單一解木聚糖擬桿菌細菌細胞以及解木聚糖擬桿菌物種的多個細菌細胞。術語“解木聚糖擬桿菌物種微生物”和“解木聚糖擬桿菌微生物”在本文中以同義地方式使用。通常而言，術語“微生物”指眾多細胞。具體而言，該術語指至少IO3個細胞，優選地至少IO4個細胞，至少IO5或至少IO6個細胞。
[0064]根據本發明，術語“食品”指任何可食用產品，尤其可以用于營養人類和/或動物，優選地用于人類營養的任何產品。食品可以是從分離的養分、膳食補充劑和特定膳食至基因修飾的食品、草藥產品和加工食品如發酵食品、谷物食品、湯和飲料。術語
“食品”尤其指可以由人類或動物經口取得的任何養分、養分組合物或制劑，如但不限于養分、營養添加物、食品添加劑、膳食補充劑、臨床食品、腸胃外食品，腸內食品、特殊膳食用途食品、指定健康用途的食品或功能性食品，它們可以經口以不同形式，如但不限于膠囊、片、乳液、粉末、液體應用以及以任何食品或飲料形式或作為其部分應用。在特定的情況下，食品可以按腸胃外方式給予(腸胃外食品)。食品可以按原樣或與至少一種其他成分混合給予。食品本身或其與至少一種其他成分的混合物可以按原樣給予或混入食品或飲料中。術語“食品”還意指任何食品，尤其發酵食品、飲料、膠囊、片、乳液、粉末或液體。在某些實施方案中，食品提供一般健康益處。具體而言，食品可以是益生的。
[0065]本發明的食品優選地以產生用于顧客的每日劑量約IO6至約IO13個微生物的量或濃度包含解木聚糖擬桿菌物種微生物。優選地，每日劑量不超過2.8*1012個微生物，優選地2.3*1012個微生物，和/或是至少IO8個微生物，優選地至少IO9個微生物。具體而言，每日劑量處于約IOltl至約IO12個微生物范圍內。食品優選地處于單一單位劑量的形式，所述單位劑量各自包含如上文所述的解木聚糖擬桿菌物種微生物的每日劑量。
[0066]本發明的食品可以含有處于有活力、非增殖、無活力或裂解形式的解木聚糖擬桿菌物種微生物。優選地，所述微生物以非致病形式、非增殖、無活力或裂解形式使用。
[0067]在第二方面，本發明涉及一種用于產生發酵食品的方法，其中食品原料與用于發酵的起子培養物組合，特征在于添加解木聚糖擬桿菌物種微生物。
[0068]本發明的“發酵食品”尤其指借助微生物的作用產生或保存的食品。具體而言，包括涉及使用細菌的發酵過程。通過本發明方法可產生的產品的非限制示例性名單包括發酵奶制品，如酸乳清、凝乳/酸乳、明膠、奶油干酪、軟干酪、切片干酪、硬干酪、加工干酪、奶豆腐、來自凝乳的干酪、烹煮干酪、牛奶酒(kefir)、衣梅爾
(ymer)、avran、糖蜜、酸奶、果味酸奶、甜乳清、乳清黃油、新鮮干酪、莫茲瑞拉、菲達干酪、乳清粉、酸奶油、法式酸奶油(crSme fraiche)、馬斯卡朋(mascarpone)、斯美塔那酸奶油(smetana)、酸奶油、酸奶油黃油、黃油、酥油(butter oil)、半脂黃油、微酸黃油、生香腸，如薩啦咪或咸肉、可可、咖啡、酸面包和酸菜，如德國酸菜(sauerkraut)。根據待生產的發酵食品選擇食品原料。
[0069]在用于產生發酵食品的本發明方法中，解木聚糖擬桿菌物種微生物可以單獨或與適于發酵的另一個微生物組合地用作起子培養物。另外，可以將解木聚糖擬桿菌物種微生物在發酵期間添加至食品原料或在發酵后添加至發酵食品。如果不使用解木聚糖擬桿菌物種微生物作為起子培養物，則優選地添加非增殖、無活力或裂解形式的解木聚糖擬桿菌物種微生物。如果解木聚糖擬桿菌物種微生物以活性形式添加，則可以使它們不能夠在最終的發酵食品中繁殖。這可以例如通過照射微生物或加熱來實現。優選地，將微生物殺死。
[0070]用于產生發酵食品的本發明方法優選地包括至少一種以下方法步驟:
[0071]-將食品原料用任選地含有解木聚糖擬桿菌物種微生物的起子培養物接種；
[0072]-添加至少一種糖，優選地葡萄糖；并且
[0073]-溫育含有用于發酵的起子培養物的食品原料，優選地在無氧條件下。
[0074]在用于產生發酵食品的本發明方法中，優選地添加如上文所述的解木聚糖擬桿菌物種微生物。另外，相對于本申請的食品，產生的發酵食品優選地具有上文描述的一個或多個特征。參照解木聚糖擬桿菌物種微生物和包含其的食品的以上公開內容、特征和實施方案。將解木聚糖擬桿菌物種微生物優選地以至少IO6個細胞/毫升原料的量、優選地以約IO9至約101°個細胞/毫升原料的量、更優選地以約1*109至約7*109個細胞
/毫升原料的量添加。
[0075]另外，本發明提供通過產生發酵食品的本發明方法可獲得的發酵食品。
[0076]在第三方面，本發明提供一種作為DSM23964保藏的菌株CTC1、由其衍生的微生物或CTCl同源物的微生物。相對于解木聚糖擬桿菌物種微生物，菌株CTCl的微生物優選地具有上文描述的一個或多個特征。
[0077]具體而言，本發明的微生物是解木聚糖擬桿菌物種微生物。在優選的實施方案中，其與作為DSM18836或DSM23964保藏的CTCl在DNA-DNA雜交測定法中顯示至少70%、優選地至少90%、至少95%、更優選地至少98%、最優選地至少99%的DNA-DNA親緣關系。另外，其優選地與作為DSM18836或DSM23964保藏的CTCl顯示至少98%、優選地至少99%或至少99.5%、更優選地100%的16S rRNA基因序列相似性水平。
[0078]在優選的實施方案中，本發明的微生物具有以下一個或多個特征:
[0079]i)作為保藏為DSM18836的解木聚糖擬桿菌，其不能夠降解淀粉；
[0080]ii)其具有利用和/或代謝甘露醇、尤其D-甘露醇、松三糖和/或山梨醇、尤其D-山梨醇和/或從丙三醇產生酸的能力；
[0081]iii)其表現谷氨酰谷氨酸芳基酰胺酶活性；
[0082]iv)其不能產生吲哚；
[0083]V)其不顯示過氧化氫酶活性。
[0084]另外，本發明的微生物優選地是不形成孢子和非-能動的革蘭氏陰性厭氧微生物。其優選地能夠產生短鏈脂肪酸，尤其如上文所述，和/或能夠在攝入后存活于胃中和任選地人類腸道中的條件，尤其如上文所述。
[0085]在優選的實施方案中，本發明的微生物具有以下一個或多個安全特征:
[0086](i)其對抗生素甲硝唑、美羅培南和/或克林霉素敏感；
[0087](ii)其不含質粒 RP4(DSM3876)和 / 或質粒 pSClOl (DSM6202)；
[0088](iii)其不含β -內酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ；
[0089](iv)其不含毒力因子脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)多糖A和/或脆弱擬桿菌腸毒素Bft和/或由基因ompW編碼的“Ton B連接的外膜蛋白”；
[0090](V)其不顯示任何胞外DNA酶活性、胞外軟骨素酶活性、胞外透明質酸酶活性和/或胞外神經氨酸酶活性；和
[0091](vi)其不附著于人結腸的上皮細胞。
[0092]本發明的微生物尤其是優選地在其天然環境中不存在的分離的微生物。具體而言，微生物不存在于人體中，優選地其不存在于人體或動物體中。根據一個實施方案，本發明的微生物已經從包含不屬于解木聚糖擬桿菌物種的微生物的組合物分離。根據一個實施方案，本發明的微生物存在于包含至少70%、至少80%、至少90%、優選地至少95%、97%、99%、最優選約100%本發明微生物的培養物中或從其中獲得。
[0093]另外，本發明提供一種包含本發明微生物的組合物。就本發明微生物的特征而言，參考上文的發明公開。優選地，組合物中80%或更多、更優選地85%或更多、90%或更多、95%或更多、98%或更多或99%或更多和最優選地約100%的微生物是本發明的微生物。根據一個實施方案，組合物中的微生物以有活力、非增殖、無活力或裂解形式存在。根據一個實施方案，所述組合物是細胞培養物。
[0094]優選地，該組合物包含至少IO3個本發明的微生物、更優選地至少IO4個、至少IO5個或至少IO6個本發明的微生物。
[0095]在第四方面，本發明提供一種用于產生食品、尤其根據本發明第一方面的食品的方法，包括步驟:將解木聚糖擬桿菌物種微生物添加至包含至少一種食品原料的組合物或添加至加工的食品物料。另外，提供了解木聚糖擬桿菌物種微生物產生食品、尤其作為用于發酵的起子培養物的用途。就解木聚糖擬桿菌物種微生物的特征而言，參考以上公開內容。
[0096]如本文所用，表述“包含”，除了其字面含義外還包括并且特別地指表述“基本上由……組成”和“由……組成”。因而，表述“包含”指其中“包含”具體所列出元素的主題物不包含其他要素的實施方案，以及其中“包含”具體所列出元素的主題物可以和/或實際上的確涵蓋其他要素的實施方案。同樣，表述“具有”應理解為表述
“包含”，還包括并且特別地指表述“基本上由……組成”和“由……組成”。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0097]圖1顯示本發明微生物CTCl和不同參考微生物的限制性分析。這些結果支持CTCl是解木聚糖擬桿菌物種。
[0098]圖2顯示質粒和β內酰胺酶基因cfiA、cfxA和cepA的確定。(A)質粒:加載20 μ g每種分離的質粒DNA。泳道:I, Ikb DNA梯；2,大腸桿菌DSM3876 ; 3,大腸桿菌DSM6202 ； 4，解木聚糖擬桿菌 DSM23964。 (B) cfiA 基因:泳道:1，IOObp DNA 梯；2，脆弱擬桿菌TAL3636 ; 3，解木聚糖擬桿菌DSM23964 ; 4，陰性對照。(C)cfxA基因:泳道:I和6，IkbDNA梯；2， 卵形擬桿菌麗7; 3，卵形擬桿菌麗23; 4，解木聚糖擬桿菌DSM23964 ； 5，陰性對照。(D)C印A基因:泳道:I和6，IOObp DNA梯；2，脆弱擬桿菌DSM1396 ； 3，卵形擬桿菌麗23; 4，解木聚糖擬桿菌DSM23964 ;泳道5，陰性對照。
[0099]圖3顯不毒力編碼基因bft、wcfR、wcfS和omp W的確定。(A)bft基因:泳道:1，IOObp DNA梯；2，解木聚糖擬桿菌DSM23964 ; 3，脆弱擬桿菌ATCC43858 ; 4，陰性對照。(B) wcfR基因:泳道:1，Ikb DNA梯；2，脆弱擬桿菌DSM1396 ; 3，脆弱擬桿菌ATCC43858; 4，脆弱擬桿菌DSM2151 ; 5，解木聚糖擬桿菌DSM23964 ; 6，脆弱擬桿菌TAL3636; 7，陰性對照。(C)wcfS基因:泳道:泳道:1，Ikb DNA梯；2，脆弱擬桿菌DSM1396; 3，脆弱擬桿菌ATCC43858 ; 4，脆弱擬桿菌DSM2151 ; 5，解木聚糖擬桿菌DSM23964 ； 6，脆弱擬桿菌TAL3636 ; 7，陰性對照。(D)ompW基因:泳道:1，IOObp DNA梯；2,解木聚糖擬桿菌 DSM23964 ; 3,幾擬桿菌(Bacteroides caccae) DSM19024 ； 4,陰性對照。
[0100]圖4顯示菌株DSM23964與Caco-2細胞結合的分子分析。(A) GAPDH和蔗糖異麥芽糖酶。泳道:1，IOObp DNA梯(Bioline) ; 2，第 I 日；3，第 3 日；4，第 6 日；5，第 8日；6，第10日；7，第13日；8，第14日，9，第陰性對照。(B)菌株DSM23964和脆弱擬桿菌DSM1396的檢測。泳道:1，IOObp DNA梯；2，第一洗滌步驟后的菌株DSM23964 ;3，第六洗滌步驟后的菌株DSM23964 ; 4，菌株DSM23964+Caco_2細胞；5，第一洗滌步驟后的脆弱擬桿菌DSM1396 ; 6，第六洗滌步驟后的脆弱擬桿菌DSM1396 ; 7，脆弱擬桿菌DSM1396+Caco-2 細胞;8，Caco-2 細胞；9，菌株 DSM23964 ; 10，脆弱擬桿菌 DSM1396 ;11，陰性對照。(C)嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)的檢測。泳道:I,第一洗滌步驟后的嗜酸乳桿菌DSM9126 ; 2，第六洗滌步驟后的嗜酸乳桿菌DSM9126 ; 3，嗜酸乳桿菌DSM9126+Caco-2細胞；4，Caco-2細胞；5，嗜酸乳桿菌DSM9126 ; 6，陰性對照；7，IOObp DNA 梯。
[0101]圖5顯示90天口服毒性研究期間小鼠的體重和食物消耗量。(A)雄性對照的體重:NMRI小鼠。(B)雌性對照的體重:NMRI小鼠。(C)雄性對照的食物消耗量:NMRI小鼠。(D)雌性對照的食物消耗量:NMRI小鼠。每組均值:組I (O)、組2 (I X IO6)、組3 (I X IO7)、組4 (I X IO8) CFU的解木聚糖擬桿菌DSM23964和組5 (I X IO11)解木聚糖擬桿菌DSM23964巴氏消毒/動物/日。統計顯著性由P≤0.01指示。值根據Dunnett檢驗。
[0102]圖6顯示通過物種特異性多重PCR檢測到所注射溶液中的污染。泳道:1，陽性對照(解木聚糖擬桿菌DSM23964) ； 2，溶液2 (I X IO9個脆弱擬桿菌RMA6791/ml)；3，溶液3(1X109個解木聚糖擬桿菌DSM23964/ml) ； 4，溶液4(1.5X IO8個脆弱擬桿菌RMA6791/ml) ； 5，溶液 5 (1.5 X IO8 個解木聚糖擬桿菌 DSM23964/ml) ； 6，溶液 6 (5 X IO6個脆弱擬桿菌RMA6791/ml) ; 7，溶液7 (5 X IO6個解木聚糖擬桿菌DSM23964/ml)，8，陽性對照(脆弱擬桿菌RMA6791) ； 9，溶液I (對照組)。污染對照:泳道10，90%脆弱擬桿菌RMA6791和10%解木聚糖擬桿菌DSM23964的混合物；泳道11，10%脆弱擬桿菌RMA6791和90%解木聚糖擬桿菌DSM23964的混合物。泳道12，Ikb DNA梯(Fermentas)。
[0103]圖7顯示來自穿刺膿腫的分離DNA的物種特異性PCR。 (A)在用解木聚糖擬桿菌DSM23964注射的動物的膿腫中檢出解木聚糖擬桿菌。泳道:1，IOObp DNA梯(Fermentas) ； 2-3,組 3 (4.6X IO9 個解木聚糖擬桿菌 DSM23964/kg bw) ； 4-5,組
5(6.9 X IO8個解木聚糖擬桿菌DSM23964/kg bw) ； 6-7,組7 (2.3 X IO7個解木聚糖擬桿菌DSM23964/kg bw) ； 8，陽性對照(解木聚糖擬桿菌DSM23964) ； 9，陰性對照(水)。(B)在用脆弱擬桿菌RMA6791注射的動物的膿腫中檢出脆弱擬桿菌。泳道:1，IOObp DNA梯(Fermentas) ； 2-3,組 2 (4.6X IO9 個脆弱擬桿菌 RMA6791/kg bw) ； 4-5,組 Μ6.9Χ108個脆弱擬桿菌 RMA6791/kg bw) ； 6-7,組 6 (2.3 X IO7 個脆弱擬桿菌 RMA6791/kgbw)，8，陽性對照(脆弱擬桿菌RMA6791) ； 9,陰性對照(水)；10, Ikb DNA梯(fermentas)。
實施例
[0104]實施例1:本發明的微生物是解木聚糖擬桿菌物種的獨特菌株。
[0105]1.1分類學分析1: 16S rRNA序列相似性
[0106]使用通用引物27f (5，-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:1))和 519r (5，-GWATTACCGCGGCKGCTG-3’(SEQ ID NO: 2))，通過 PCR 擴增菌株 CTCl 的 16S rRNA 基因序列(480個堿基)。通過使用高純PCR產物純化試劑盒(Roche，印第安納波利斯，USA)純化PCR產物并且通過使用低DNA質量梯(Invitrogen，Carlsbad, USA)估計DNA濃度和產物大小。使用DYEnamic? ET染料終止循環測序試劑盒(Amersham Bioscience)和ABIPRISM3100毛細管測序儀(Applied Biosystems)根據制造商的說明書，對PCR產物測序。起初通過BLAST程序(Altschul等人，,1997)和megaBLAST (Zhang等人，2000)程序針對具有合格發表的原核名稱的模式菌株的數據庫(Chun等人，2007)實施系統進化鄰居的鑒定。隨后選擇具有最高評分的50個序列以便使用總體比對算法計算配對序列相似性，這在 EzTaxon 服務器處實施(http://www.eztaxon.0rg/ ； Chun 等人，2007)。通過使用程序MEGA第5版(Tamura，2007)去除比對空位和模糊堿基，手工修正所產生的多重序列比對結果，并且根據鄰接法(Saitou和Nei，1987)采用程序MEGA第5版(Tamura，2007)，構建進化系統樹。
[0107]菌株CTCl的16S rRNA序列分析顯示這個菌株與解木聚糖擬桿菌DSM18836聚類(100%16S rRNA序列相似性)、與卵形擬桿菌ATCC8483聚類(97.5%)、與多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)ATCC29148 聚類(94.2%)并與 Bacteroides finegoldiiDSM17565聚類(92.2%)。通常認為16S rRNA基因序列趨異性方面≤97%的相似值對于物種劃定是顯著的(Stackebrandt 和 Goebel, 1994)。然而，Stackebrandt 和 Ebers (2006)已經推薦這種值可以增加至98.7-99%，同時不犧牲“物種”描述的品質和精度，并且作為分類學家的輔助。
[0108]1.2分類學分析2:全基因組DNA-DNA雜交
[0109]認為DNA-DNA雜交是分類學中的金標準。使CTCl菌株的全基因組與解木聚糖擬桿菌 DSM18836、卵形擬桿菌 DSM1896、多形擬桿菌 DSM2079 和 Bacteroides finegoldiiDSM17565的全基因組雜交(這些分析在DMSZ(德國微生物和細胞培養物保藏中心)處并由該機構進行)。簡而言之，將3g待比較的每個菌株的生物材料用于DNA制備。分析分離的DNA的純度并且使用弗氏壓碎器剪切DNA并使其在高溫變性(100°C，10分鐘)。將DNA優選地剪切成大小在200和600kDa之間的片段，主要部分為約450+/_100kDa。以分光光度方式使用在260nm處的吸光度測量每個菌株的DNA以及相等濃度的兩個菌株的DNA的混合物(樣品中的DNA終濃度是基本上相同的并且優選地位于約20和100μ g/ml之間，尤其約30 μ g/ml)的復性。通過迅速冷卻該溶液至DNA解鏈溫度以下25°C的溫度啟動復性，并且測量進行30分鐘。從單個細菌菌株的各自DNA和兩個菌株的DNA混合物的復性曲線的不同斜率計算DNA親緣關 系。具體而言，將復性速率V’確定為吸光度/分鐘(Λ A/t)的下降，并且根據De Ley等人給出的公式(見上文)結合程度(D)，即DNA親緣關系:
【權利要求】
1.一種食品，其包含解木聚糖擬桿菌(Bacteroides xylanisolvens)物種的微生物。
2.根據權利要求1所述的食品，其中所述解木聚糖擬桿菌物種微生物是作為DSM23964保藏的CTC1、由其衍生的微生物或CTCl同源物。
3.根據權利要求1或2所述的食品，其中所述解木聚糖擬桿菌物種微生物具有以下一個或多個特征: a)在DNA-DNA雜交測定法中，其與作為DSM23964保藏的CTCl顯示至少70%、優選地至少90%、至少95%、更優選地至少98%、最優選地至少99%的DNA-DNA親緣關系； b)其與作為DSM23964保藏的CTCl顯示至少98%、優選地至少99%或至少99.5%、更優選地100%的16S rRNA基因序列相似性水平；和/或 c)其能夠產生短鏈脂肪酸；和/或 d)其能夠在攝入后存活于胃中和任選地人類腸道中的條件；和/或 e)其具有以下一個或多個安全特征: (i)其對抗生素甲硝唑、美羅培南和/或克林霉素敏感； (ii)其不含質粒RP4(DSM3876)和 / 或質粒 pSClOl (DSM6202)； (iii)其不含β-內酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ；` (iv)其不含毒力因子脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)多糖A和/或脆弱擬桿菌腸毒素和/或由基因ompW編碼的“Ton B連接的外膜蛋白”； (v)其不顯示任何胞外DNA酶活性、胞外軟骨素酶活性、胞外透明質酸酶活性和/或胞外神經氨酸酶活性；和 (vi)其不附著于人結腸的上皮細胞；和/或 f)其穩定和/或均質地表達表面碳水化合物結構。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的食品，以產生用于顧客的每日劑量約IO6至約IO13個微生物的量或濃度包含解木聚糖擬桿菌物種微生物。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的食品，包含處于有活力、非增殖型、無活力或裂解形式的解木聚糖擬桿菌物種微生物。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的食品，所述食品選自發酵食品、益生食品、功能性食品、膳食補充劑和食品添加劑。
7.一種用于產生發酵食品的方法，其中食品原料與用于發酵的起子培養物組合，特征在于添加解木聚糖擬桿菌物種微生物。
8.根據權利要求7所述的方法，具有以下一個或多個特征: a)使用所述解木聚糖擬桿菌物種微生物單獨或與另一種起子培養物組合作為起子培養物； b)將所述解木聚糖擬桿菌物種微生物在發酵期間或之后添加至發酵食品；和/或 c)所述解木聚糖擬桿菌物種微生物以有活力、非增殖、無活力或裂解形式使用； d)將所述解木聚糖擬桿菌物種微生物以至少IO6個細胞/毫升原料的量、優選地以約IO9至101°個細胞/毫升原料的量添加。
9.根據權利要求7或8所述的方法，包括至少一個以下方法步驟: -將食品原料用任選地含有解木聚糖擬桿菌物種微生物的起子培養物接種；-添加至少一種糖，優選地葡萄糖；并且 -溫育含有用于發酵的起子培養物的食品原料，優選地在無氧條件下。
10.根據權利要求7至9中任一項所述的方法，其中所述解木聚糖擬桿菌物種微生物具有以下一個或多個特征: a)其是CTCl(DSM23964)、由其衍生的微生物或CTCl同源物； b)在DNA-DNA雜交測定法中，其與作為DSM23964保藏的CTCl顯示至少70%、優選地至少90%、至少95%、更優選地至少98%、最優選地至少99%的DNA-DNA親緣關系； c)其與作為DSM23964保藏的CTCl顯示至少98%、優選地至少99%或至少99.5%、更優選地100%的16S rRNA基因序列相似性水平；和/或 d)其能夠產生短鏈脂肪酸；和/或 e)其能夠在攝入后存活于胃中和任選地人類腸道中的條件；和/或 f)其具有以下一個或多個安全特征: (i)其對抗生素甲硝唑、美羅培南和/或克林霉素敏感； (ii)其不含質粒RP4(DSM3876)和 / 或`質粒 pSClOl (DSM6202)； (iii)其不含β-內酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ； (iv)其不含毒力因子脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)多糖A和/或脆弱擬桿菌腸毒素和/或由基因ompW編碼的“Ton B連接的外膜蛋白”； (v)其不顯示任何胞外DNA酶活性、胞外軟骨素酶活性、胞外透明質酸酶活性和/或胞外神經氨酸酶活性；和 (vi)其不附著于人結腸的上皮細胞。
11.發酵食品，通過根據權利要求7至10中任一項所述的方法可獲得。
12.作為DSM23964保藏的菌株CTC1、由其衍生的微生物或CTCl同源物的微生物。
13.根據權利要求12所述的微生物，其中從CTCl或CTCl同源物衍生的微生物具有以下一個或多個特征: a)其是解木聚糖擬桿菌物種微生物； b)在DNA-DNA雜交測定法中，其與作為DSM23964保藏的CTCl顯示至少70%、優選地至少90%、至少95%、更優選地至少98%、最優選地至少99%的DNA-DNA親緣關系； c)其與作為DSM23964保藏的CTCl顯示至少98%、優選地至少99%或至少99.5%、更優選地100%的16S rRNA基因序列相似性水平；和/或 d)其能夠產生短鏈脂肪酸；和/或 e)其能夠在攝入后存活于胃中和任選地人類腸道中的條件；和/或 f)其具有以下一個或多個安全特征: (i)其對抗生素甲硝唑、美羅培南和/或克林霉素敏感； (ii)其不含質粒RP4(DSM3876)和 / 或質粒 pSClOl (DSM6202)； (iii)其不含β-內酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ； (iv)其不含毒力因子脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)多糖A和/或脆弱擬桿菌腸毒素和/或由基因ompW編碼的“Ton B連接的外膜蛋白”； (v)其不顯示任何胞外DNA酶活性、胞外軟骨素酶活性、胞外透明質酸酶活性和/或胞外神經氨酸酶活性；和(Vi)其不附著于人結腸的上皮細胞。
14.組合物，其包含根據權利要求12或13所述的微生物。
15.用于產生根據權利要求1至6中任一項所述的食品的方法，包括步驟:將解木聚糖擬桿菌物種微生物添加至包含至少一種食品原料的組合物或添加至加工的食品物料。
16.根據權利要求15所述的方法，其中解木聚糖擬桿菌物種微生物是根據權利要求12或13所述的微生物。
17.解木聚糖擬桿菌物種微生物用于產生食品、尤其作為用于發酵的起子培養物的用途。
18.根據權利要求17所述的用途，其中解木聚糖擬桿菌物種微生物是根據權利要求12或13所述 的微生物。
【文檔編號】A23L1/30GK103874428SQ201280040687
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年8月22日 優先權日:2011年8月22日
【發明者】S·格勒茨, P·烏爾瑟默, K·陶陶尼安 申請人:葛萊高托普有限公司