專利名稱：水生黃桿菌及其在微生物轉化制備l-色氨酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株新的產L-酰胺酶菌株——水生黃桿菌(Flavobacteriumaquati) ZJB-09211，及其在微生物轉化制備L-色氨酸中的應用。
背景技術：
L-色氨酸在生物體內不能自然合成，需要從食物中攝取，是動物和一些真菌生命活動中的必需氨基酸。L-色氨酸在蛋白質中含量很低，平均含量約或更少。L-色氨酸能調節蛋白質的合成、調節免疫及消化功能、增加5-羥色胺代謝作用以及增強認知能力等，因此在人和動物的新陳代謝、生長發育中有重要作用。L-色氨酸的這些營養和藥用價值使其被廣泛應用于醫藥、飼料和食品等行業。L-色氨酸可以采用蛋白質水解法、化學合成法-和微生物法來生產。微生物法大體上可分為酶促轉化法和直接發酵法1982年日本的Nakai (EP 43211)利用L-酰胺酶將DL-色氨酰胺水解獲得L-色氨酸及D-色氨酰胺，然后再利用化學法生產D-色氨酸，其得率達到92%。 Komeda 禾口 Asano (Enzyme and Microbial Technology, 2008,43 :276-283)于 2008 年從 Brevibacterium iodinum中克隆了具有D-氨基酰胺酶，該酶對多種不同類型的氨基酰胺都具有很好的酶活，其對色氨酰胺也具有一定的活力。
發明內容
本發明目的是提供一株可用于制備光學純L-色氨酸的新菌種——水生黃桿菌 (Flavobacterium aquati) ZJB-09211，及其在微生物制備L-色氨酸中的應用。本發明采用的技術方案是水生黃桿菌(Flavobacterium aquati)ZJB-09211，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏日期2011年10月17日，保藏編號 CCTCC NO :M 2011354。該新菌株的特征如下生理生化特征革蘭氏陰性，接觸酶陽性，氧化還陽酶陽性，其他陽性項目是組氨酸同化、D-麥芽糖、乙酸鹽、丙酸鹽同化、水楊素、DL-乳酸鹽同化，戊酸鹽同化、D-蜜二糖、葵酸鹽、丙氨酸同化、D-葡萄糖、蔗糖、脯氨酸、N-乙酰-葡萄糖胺、丙二酸鹽利用；全部陰性的項目是檸檬酸鹽利用、衣康酸鹽同化、D-甘露醇、阿拉伯糖、3-羥基-丁酸鹽、D-山梨醇、4-羥基-苯甲酸鹽同化、3-羥基-苯甲酸鹽同化、D-核糖、2-酮基葡萄糖、肌醇、糖原、L-巖澡糖、5-酮基葡糖酸鹽、辛二酸鹽同化、絲氨酸同化、明膠液化、L-鼠李糖、吲哚產生。本發明所涉及的微生物是通過以下的程序篩選得到的 1)將由浙江省內各地采回的土樣和污水樣接種到富集培養基中，在30°C，150rpm 的搖床上培養3天，待培養基變混濁后，取Iml培養液轉接到新鮮的富集培養基中，再培養3天。如此重復4 5個循環。富集培養基以1 2. 5g/L(終濃度)色氨酰胺為唯一碳、氮源，再加入其他物質配方如下(終濃度)=K2HPO4 · 12H20 1. 0 2. 5g/L，KH2PO4 1. 0 2. Og/ L，MgSO4 · 7H20 :0. 2 0. 5g/L，FeSO4 · 7H20 :0. 01 0. 05g/L，以自來水配制。2)最后一次富集培養液稀釋后涂布到平板培養基上，挑取單菌落至斜面保藏。平板培養基為富集培養基中加入15 20g/L的瓊脂。3)挑取的單菌落接種到發酵培養基，組份如下(終濃度)葡萄糖10. 0 20. Og/ L，牛肉膏 5. 0 10. Og/L，蛋白胨 2. 0 5. Og/L, NaCl 1. 0 3. Og/L, K2HPO4L 0 2. Og/ L, KH2PO4L 0 2. Og/L, MgSO4O. 2 0. 5g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L,乙酰胺 2. 0 5. Og/L, pH自然(121°C下，滅菌20min)，自來水配制；25 45°C下，搖瓶轉速100 300rpm，培養 48h 72h，離心后懸浮于蒸餾水體系中。然后利用手性液相色譜法篩選產L-酰胺酶的菌株。4)對通過上述方法篩選到的產L-酰胺酶菌株，通過水解轉化反應進行復篩。按照上述方法培養得到的菌體，離心后懸浮于蒸餾水體系中，加入色氨酰胺作為底物，進行轉化；用手性液相色譜法分析產物的含量及光學純度。手性色譜法的具體操作條件為美國戴安U3000液相色譜儀，變色龍色譜工作站； 美國CHIR0BI0TIC 手性液相色譜柱；流動性為乙腈0. 5%醋酸=80 20，流速為ImL/ min ；進樣量3 μ L，檢測波長為278nm，柱溫為30°C。通過Plackett-Burman考察了碳源、氮源、誘導劑與金屬離子等培養基組分對水生黃桿菌ZJB-09211菌株酶活的影響，得到水生黃桿菌ZJB-09211的最佳產酶培養基組成為(終濃度)葡萄糖9.0 15. 0g/L，酵母粉6. 0 10. 0g/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L, K2HPO4O. 5 1. 5g/L，NaCl 0. 5 lg/L，乙酰胺 1 3. 0g/L，溶劑為水。水生黃桿菌ZJB-09211的最佳培養條件為起始pH 6. 0 8. 5，裝液量5 30%， 培養溫度20 30°C，搖床轉速100 300rpm，培養時間M 72小時。本發明還涉及所述的水生黃桿菌ZJB-09211在微生物轉化制備L-色氨酸中的應用。具體的，所述應用為以外消旋色氨酰胺為反應底物，加入水生黃桿菌ZJB-09211 經產酶培養獲得的含酶菌體細胞，28 35°C搖床振蕩條件下進行轉化反應1 30小時，反應液經分離純化得到所述L-色氨酸。優選的，所述產酶培養在組成如下的產酶培養基中進行葡萄糖9. 0 15. 0g/L, 酵母粉 6. 0 10. 0g/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L, K2HPO4O. 5 1. 5g/L, NaCl 0. 5 lg/L,乙酰胺1 3. 0g/L，溶劑為水，pH 6. 0 8. 5。優選的，所述產酶培養在20 30°C、100 300rpm條件下進行，培養時間M 72 小時。優選的，所述轉化反應在pH7. 0 7. 8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液中進行。優選的，底物添加量為0. 5 lOmg/mL緩沖液，含酶菌體細胞添加量以濕重計為10 100mg/mL緩沖液。優選的，為提高轉化效率，所述轉化反應的體系中還添加有體積為緩沖液體積 1 20%的助溶劑甲醇或乙酸乙酯。本發明的有益效果主要體現在提供了一種具有立體選擇性、可制備光學純L-色氨酸的新菌種，通過該菌種可制備高光學純度的L-色氨酸；本發明通過篩選得到不同于以往研究的新菌種，從而為考察在手性拆分方面的微生物菌種的多樣性、進而比較不同菌種在轉化途徑及反應機理上的差異提供了基礎。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 菌株的分離產L-酰胺酶產生菌的分離在9mL 0. 85% (w/w)的生理鹽水中加入Ig土樣、適量玻璃珠，搖勻，使成均勻的土壤懸液；吸取0. 5mL的土壤懸液接種到裝有30mL富集培養基的 250mL的三角瓶中，置于30°C，150rpm的搖床培養3天，等富集液出現渾濁后，再吸取0. 5mL 轉接到新鮮的培養基中，繼續培養3天；如此重復4 5個循環后，將富集液稀釋多個梯度， 涂布到分離平板上，獲得單菌落；富集培養基以色氨酰胺為唯一碳、氮源，組成如下(終濃度)=K2HPO4 ·12Η20 :lg/L， KH2PO4 :lg/L, MgSO4 · 7H20 :0. 2g/L，FeSO4 · 7H20 :0. 01g/L，色氨酰胺3g/L，用自來水配制， pH調為7.0 ；挑取的單菌落接種到富集培養基中，培養4817 后取樣，用手性液相色譜法檢測產物L-色氨酸的對應體過量值(e. e值)，篩選獲得一株e. e.值超過98%的菌株，該菌株被鑒定為水生黃桿菌Flavobacterium aquati,即為所述的微生物黃桿菌ZJB-09211 (CCTCC NO :M 2011354)。實施例2 菌株的培養斜面培養基組成牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，自來水配制后制成斜面；于平板上挑取黃桿菌ZJB-09211的單菌落，接種至斜面，于30°C恒溫培養箱內培養4 后，放入4 °C冰箱內保藏備用。實施例3 濕菌體細胞的獲得培養基配制葡萄糖10. 0g，牛肉膏 5. 0g，蛋白胨 2. 0g, KH2PO4, lg, K2HPO4Ig, NaCl lg，乙酰胺lg，自來水補足至IL ；250ml搖瓶裝液量25 %，接種一環水生黃桿菌ZJB-09211，于30°C、150rpm振蕩培養48h ；培養結束后發酵液離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集濕菌體細胞，懸浮于蒸餾水中，得濕菌體細胞含量為0. lg/mL的菌懸液，備用。實施例4 濕菌體細胞的獲得培養基配制葡萄糖10. 0g，酵母粉 7. 0g，KH2PO4L 0g，K2HPO4L 0g, NaCl lg,乙酰胺 l.Og，自來水補足至lL，pH 8. 0 ；250ml搖瓶裝液量20%，接種一環水生黃桿菌ZJB-09211，于30°C、150rpm振蕩培養48h ；培養結束后發酵液離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集濕菌體細胞，懸浮于50mM、pH 7. 8的磷酸鹽緩沖溶液中，得濕菌體細胞含量為0. 5g/mL的菌懸液，備用。實施例5 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 8)中，加入4mL實施例3所得菌懸液；力口入12mg外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應30小時。反應液離心，取上清液，經液相檢測，產物L-色氨酸的光學純度99. 5% e. e，轉化率49. 5%。實施例6:在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 8)中，加入1. 6mL實施例3所得菌懸液； 加入外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應1小時。反應液離心， 取上清液，經液相檢測，產物L-色氨酸的光學純度99. 2% e. e，轉化率42%。實施例7 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8)中，加入6mL實施例4所得菌懸液；力口入Mmg外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應1小時。反應液離心，取上清液，經液相檢測，產物L-色氨酸的光學純度99% e. e，轉化率48%。實施例8 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 8)中，加入4mL實施例3所得菌懸液；力口入外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應2小時。反應液離心，取上清液，產物L-色氨酸的光學純度99 % e. e，轉化率48 %。實施例9 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8)中，加入4mL實施例4所得菌懸液；力口入36mg外消旋色氨酰胺作為底物，于恒溫水浴搖床振蕩反應2小時。反應液離心，產物L-色氨酸的光學純度99% e. e，轉化率42%。實施例10 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 0)中，加入4mL實施例3所得菌懸液；力口入48mg外消旋色氨酰胺作為底物。于32°C恒溫水浴搖床振蕩反應1小時。反應液離心，取上清液萃取，產物L-色氨酸的光學純度98. 9% e. e，轉化率49%。實施例11 在10mL、50mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7. 5)中，加入4mL實施例3所得菌懸液； 加入48mg外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應1小時。反應液離心， 取上清液，產物L-色氨酸的光學純度99% e. e，轉化率48%。實施例12 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8)中，加入4mL實施例4所得菌懸液；力口入48mg外消旋色氨酰胺作為底物和0. 3mL甲醇，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應1小時。反應液離心，取上清液，產物L-色氨酸的光學純度99. 3% e. e，轉化率49%。實施例13 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8)中，加入4mL實施例4所得菌懸液；力口入48mg外消旋色氨酰胺作為底物和ImL甲醇，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應1小時。反應液離心，取上清液，產物L-色氨酸的光學純度99. 5% e. e，轉化率48%。實施例14 在10ml、50mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7. 4)中，加入4mL實施例3所得菌懸液； 加入48mg外消旋色氨酰胺和0. 6mL乙酸乙酯，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應1小時。反應液離心，取上清液，產物L-色氨酸的光學純度99. 2% e. e，轉化率48%。
權利要求
1.水生黃桿菌(Flavobacteriumaquati)ZJB_09211，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏日期2011年10月17日，保藏編號 CCTCC NO :M 2011354。
2.如權利要求1所述的水生黃桿菌ZJB-09211在微生物轉化制備L-色氨酸中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述應用為以外消旋色氨酰胺為反應底物， 加入水生黃桿菌ZJB-09211經產酶培養獲得的含酶菌體細胞，28 35°C搖床振蕩條件下進行轉化反應1 30小時，反應液經分離純化得到所述L-色氨酸。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述產酶培養在組成如下的產酶培養基中進行葡萄糖 9. 0 15. Og/L,酵母粉 6. 0 10. Og/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L，K2HPO4O. 5 1. 5g/ L，NaCl 0. 5 lg/L，乙酰胺 1 3. Og/L，溶劑為水，pH 6. 0 8. 5。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述產酶培養在20 30°C、100 300rpm條件下進行，培養時間M 72小時。
6.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述轉化反應在pH7.0 7. 8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液中進行。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述轉化反應的體系中還添加有體積為緩沖液體積1 20%的甲醇或乙酸乙酯。
全文摘要
本發明提供了一株可用于制備光學純L-色氨酸的新菌種——水生黃桿菌(Flavobacterium aquati)ZJB-09211，及其在微生物制備L-色氨酸中的應用。該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏日期2011年10月17日，保藏編號CCTCC M2011354。本發明提供了一種具有立體選擇性、可制備光學純L-色氨酸的新菌種，通過該菌種可制備高光學純度的L-色氨酸；本發明通過篩選得到不同于以往研究的新菌種，從而為考察在手性拆分方面的微生物菌種的多樣性、進而比較不同菌種在轉化途徑及反應機理上的差異提供了基礎。
文檔編號C12P13/22GK102559540SQ20111040510
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者徐建妙, 沈寅初, 鄭裕國, 陳奔 申請人:浙江工業大學