一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組s1蛋白及其亞單位疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及其亞單位疫苗，該蛋白系將含有KDEL3基因序列、缺失III區的銅綠假單胞菌外毒素A基因序列和S1(m)基因序列的融合基因片段PE(△III)-S1(m)-KDEL3克隆至桿狀病毒載體中獲得重組載體，將所述的重組載體陽轉DH10Bac感受態細胞進行重組載體位點特異性轉座獲得重組桿狀質粒，將該重組桿狀質粒在脂質體介導下轉染Sf9細胞獲得重組Sf9細胞，經該重組Sf9細胞表達獲得。本發明在對S1基因哺乳動物密碼子偏嗜性優化的基礎上，首次利用桿狀病毒表達系統表達PE(△III)-S1(m)-KDEL3融合蛋白，以期獲得正確并高效表達融合蛋白的重組桿狀病毒。經IFA和Western?blot驗證重組桿狀病毒可正確表達融合蛋白且融合蛋白具有良好的反應原性。
【專利說明】一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及其亞單 位疫苗 【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1 蛋白及其亞單位疫苗。 【背景技術】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是具有囊膜的單鏈 正股RNA病毒，屬于I型冠狀病毒。同其他冠狀病毒一樣，PEDV S蛋白在誘導中和抗體、結 合細胞、促進病毒和細胞融合等方面發揮著重要作用[2]。研究表明，S蛋白的中和表位區域 大多位于S1區；另外，比較PEDV變異毒株和傳統毒株，S蛋白變異最大，主要變異發生在S1 區。
[0003] 銅綠假單胞菌外毒素 A (Pseudomonas exotoxin A, PEA)是由銅綠假單胞菌分泌的 細胞毒性外毒素。PEA由613個氨基酸組成，可分為三個不同結構域：1區包括la (l-252aa) 和Ib(365-404aa)兩部分，具有受體識別功能；II區（253-364aa)與毒素的跨膜就位有關； III區（405-613aa)是細胞毒性區域。PEA因具有極強的細胞毒性常作為生物導彈用于腫瘤 的治療，Pirker等將PEA和抗體偶聯用于抗腫瘤治療，取得了較好的結果；Batra等將PEA 和抗轉鐵蛋白受體偶聯制備免疫毒素，經小鼠試驗發現其具有較好的抗腫瘤活性。另外， PEA還具有佐劑的功能，缺失了 III區的ΡΕΑ(ΡΕ( Λ III))沒有細胞毒性，但具有結合細胞 并進入細胞的功能，ΡΕ( Λ III)可以作為載體使保護性抗原進入細胞，促進抗原遞呈細胞 遞呈功能。LyS-ASp-Gl U-LeU(KEDL)基序是一種內質網靶向轉運信號，能有效使與之偶聯的 外源抗原從高爾基體轉運至內質網，延長在內質網滯留時間。
[0004] 目前，研究人員嘗試了多種方法研究關于PEDV的疫苗，比如DNA疫苗、轉基因植物 疫苗和重組腺病毒疫苗等，但均沒有取得較好的免疫效果。因此需要提供一種具有良好反 應原性的PEDV的疫苗。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及其亞單 位疫苗。
[0006] 本發明的目的可以通過以下技術方案實現：
[0007] -種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白，該蛋白系將含有KDEL3基因 序列、缺失III區的銅綠假單胞菌外毒素 A基因序列和Sl(m)基因序列的融合基因片段 ΡΕ(Λ III)-Sl(m)-KDEL3克隆至桿狀病毒載體中獲得重組載體，將所述的重組載體陽轉 DHlOBac感受態細胞進行重組載體位點特異性轉座獲得重組桿狀質粒，將該重組桿狀質粒 在脂質體介導下轉染Sf9細胞獲得重組Sf9細胞，經該重組Sf9細胞表達獲得。
[0008] 上述SI (m)基因的序列為SEQ ID N0. 7,該SI (m)基因是以PEDV新變異株S基因 序列GenBank :KF453516為基礎，按昆蟲細胞偏性密碼子，設計出的密碼子優化的基因，即 SI (m)基因。將該SI (m)基因克隆至pVAX載體，可構建重組質粒pVAX-Sl (m)，該重組質粒 pVAX-Sl(m)可通過市場購買獲得。
[〇〇〇9] 所述的桿狀病毒載體為pFastBac?Dual質粒。
[〇〇1〇] 一種重組載體pF-PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3,其在于是將含有KDEL3基因序 列、缺失III區的銅綠假單胞菌外毒素 A基因序列和Sl(m)基因序列的融合基因片段 ΡΕ( Λ III)-S1 (m)-KDEL3 克隆至桿狀病毒載體 pFastBac?Dual 質粒的 Notl 和 Hindlll 兩 個酶切位點間所得。
[0011] 上述的重組載體pF-PE( Λ III)-Sl(m)-KDEL3,其克隆過程包含以下步驟：
[0012] (1)以pVAX-Sl (m)質粒為模板，引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3經PCR擴增含有 KDEL3基因序列的SI (m)，即SI (m)-KDEL3 ;以經煮沸的假單胞菌菌液為模板，引物SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5擴增缺失III區的PE基因，S卩PE( Λ III);
[0013] (2)通過Notl和Xhal兩個酶切位點將所得到的基因片段ΡΕ( Λ III)克隆 入桿狀病毒載體中獲得重組載體pF_PE( Λ III);通過Xhal和Hindlll兩個酶切位點 將所得到的基因片段Sl(m)-KDEL3克隆入重組載體pF-PE(A III)中獲得重組載體 pF-PE( Λ III)-S1(m)-KDEL3。
[0014] 一種重組重組桿狀質粒，是將上述的重組載體pF-PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3陽轉 DHlOBac感受態細胞進行重組載體位點特異性轉座所得。
[0015] 一種重組Sf9細胞，其在于含有上述的重組桿狀質粒。
[〇〇16] 上述豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白的制備方法，包括如下步驟：
[0017] (1)以pVAX-Sl (m)質粒為模板，引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3經PCR擴增含有 KDEL3基因序列的SI (m)，即SI (m)-KDEL3 ;以經煮沸的假單胞菌菌液為模板，引物SEQ ID Ν0· 4和SEQ ID Ν0· 5擴增缺失III區的PE基因，S卩PE( Λ III);
[0018] (2)通過Notl和Xhal兩個酶切位點將所得到的基因片段ΡΕ( Λ III)克隆 入桿狀病毒載體中獲得重組載體pF_PE( Λ III);通過Xhal和Hindlll兩個酶切位點 將所得到的基因片段Sl(m)-KDEL3克隆入重組載體pF-PE(A III)中獲得重組載體 pF-PE( Λ III)-SI(m)-KDEL3 ;
[0019] (3)將所述的重組載體pF-PE ( Λ III)-SI (m)-KDEL3陽轉DHlOBac感受態細胞進 行重組載體位點特異性轉座獲得重組桿狀質粒，在脂質體介導下將重組桿狀質粒轉染Sf9 細胞，經該重組Sf9細胞表達獲得所述的重組蛋白。
[0020] 上述的制備方法，其所述的桿狀病毒載體為pFastBac?Dual質粒。
[0021] 一種亞單位疫苗，其在于包含有上述的重組Sf9細胞表達的豬流行性腹瀉病毒新 變異毒株重組S1蛋白及佐劑。
[0022] 本發明所述的KDEL3是3個相同蛋白質序列（Lys-Asp-Glu-Leu，KDEL)的串聯。
[0023] 本發明根據哺乳動物細胞偏性密碼子設計優化豬流行性腹瀉病毒（PEDV)變 異毒株S1基因（Sl(m))，通過PCR方法擴增構建成功Sl(m)基因、含有KDEL3基因序列 的Sl(m)基因（Sl(m)-KDEL3)、含有KDEL3基因序列并缺失III區的銅綠假單胞菌外毒 素 A基因（ΡΕ(Λ III)-KDEL3)和ΡΕ(Λ III)-Sl(m)-KDEL3融合基因片段，分別克隆至 pFastBac?Dual質粒，經酶切及測序鑒定獲得重組質粒。將重組質粒轉化DHlOBac感受態 細胞，經兩次藍白斑篩選和PCR鑒定獲得重組Bacmid質粒。在脂質體介導下將重組Bacmid 質粒轉染Sf9細胞，經過重組Sf9細胞表達獲得四種重組桿狀病毒。經PCR、IFA和Western blot鑒定四種重組桿狀病毒均能在Sf9細胞中正確表達目的蛋白SI (m)、SI (m)-KDEL3和 PE ( Λ III) -S1 (m) -KDEL3。將這3種蛋白分別加入佐劑，制成PEDV亞單位疫苗，進行小 鼠免疫試驗。將50只清潔級小鼠隨機分為5組，每組10只，第1、2和3免疫組分別免疫 rBac-PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3、rBac-Sl (m) -KDEL3 和 rBac-Sl (m);第 4 和 5 免疫組分別 免疫rBac-PE ( Λ III)-KDEL3和PBS，為陰性對照組。免疫途徑是背部皮下多點注射，首免 后21d以相同途徑和劑量加強免疫。首免后35d和49d采血和采取脾臟，檢測特異性抗體、 中和抗體、淋巴細胞增殖指數、IL-4和IFN-γ含量。結果顯示：首免后21d，第1、2和3免 疫組均能產生PEDV特異性抗體和中和抗體，首免后49d達到最高，與對照組抗體水平相比 均差異顯著（P < 〇. 05)，并且第1免疫組的特異性抗體水平明顯高于第2和第3免疫組（P < 0. 05)。首免后49d，第1免疫組淋巴細胞增值指數的平均值明顯高于第2和3免疫組 (P<0.05);細胞培養上清中IL-4和IFN-γ含量檢測，第1、2和3免疫組細胞因子含量明 顯高于對照組（P< 0.01)，并且第1免疫組IFN-γ含量與2和3免疫組相比差異明顯（P < 0. 05)。證明rBac-PE( Λ III)-Sl(m)-KDEL3蛋白具有PEDV免疫特性，可用于制備PEDV 亞單位疫苗。
[0024] 目前，還沒有利用昆蟲桿狀病毒表達系統制備PEDV亞單位疫苗的報道。本研究首 次將ΡΕ(ΛΙΙΙ)與密碼子優化的Sl(Sl(m))在桿狀病毒中融合表達，旨在提高S1蛋白的 免疫原性；并在此基礎上，制備亞單位疫苗，通過小鼠試驗驗證其免疫特性，為防控PEDV提 出新的思路。
[0025] 本發明的有益效果：
[0026] 本發明在對S1基因哺乳動物密碼子偏嗜性優化的基礎上，首次利用桿狀病毒表 達系統表達PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3融合蛋白，以期獲得正確并高效表達融合蛋白的重組 桿狀病毒。經IFA和Western blot驗證重組桿狀病毒可正確表達融合蛋白且融合蛋白具有 良好的反應原性。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1目的基因的PCR擴增
[0028] A:M:DL5000DNA Marker ；1 :Negative control ；2:Sl(m) ；3:SI (m)-KDEL3
[0029] B:M: lOObp DNA Marker ； 1: Negative control ；2:ΡΕ(ΔΙΙΙ) -KDEL3 ；3:ΡΕ(ΔΙΙΙ)
[0030] 圖2重組載體的酶切鑒定
[0031] A:M: lkb DNA Marker ； 1 : pF-PE ( Δ III) -KDEL3 (Notl/Xhal)； 2:pFastBac?dual(Notl/Xhal)；
[0032] B:M: lkb DNA Marker ；1 :pF-PE ( Δ III) -SI (m) -KDEL3 (Notl/Xhal)； 2:pF-PE( Δ III)-S1(m)-KDEL3(XhaI/HindIII) ；3:pFastBac?dual(Notl/Xhal)
[0033] C : M : lkb plus DNA Marker ； 1 : pF~S 1 (m)-KDEL3 (Xha I/H i n d 111)； 2:pFastBac?dual(Xhal/HindlII)；
[0034] D:M:lkb plus DNA Marker ；l:pF-Sl(m) (Xhal/Hindlll) ；2:pFastBac?dual (Xhal/ Hindlll);圖 3 重組 Bacmid 的 PCR 鑒定
[0035] A:M:DL5000DNA Marker ；l:Negative control ；2:rBacmid-Sl (m) (SI (m)-F/M13R)； 3:rBacmid-Sl (m)-KDEL3(Sl (m)-F/M13R);
[0036] B:M:DL5000DNA Marker ； 1: rBacmid-PE ( Δ 111)-KDEL3 (PE ( Δ III)-F/ PE (Δ 111) -R) ； 2: Negat i ve contro 1 ； 3: rBacmi d-PE (Δ 111) -S1 (m) -KDEL3 (PE (Δ 111) -F/ M13R)；
[0037] 圖4重組桿狀病毒感染Sf9細胞的CPE
[0038] A:rBac-PE( Λ III)-KDEL3 ;B:rBac-PE( Λ III)-Sl(m)-KDEL3 ;C:正常細胞； D:rBac-Sl(m) ；E:rBac-Sl(m)-KDEL3
[0039] 圖5IFA鑒定不同病毒感染的Sf9細胞內重組SI蛋白和PE( Λ III)蛋白的表達
[0040] 圖6不同病毒感染的Sf9細胞中S1蛋白（Α)、ΡΕ( Λ III)蛋白⑶的Western blot鑒定
[0041] A: 1 :rBac-PE( Λ III)-SI (m)-KDEL3 ;2:rBac-Sl (m)-KDEL3 ;3:rBac-Sl (m) ;4:Sf9
[0042] B: 1:rBac-PE( Λ III)-S1 (m)-KDEL3 ;2:rBac-PE( Λ III)-KDEL3 ;3:Sf9
[0043] 圖 7ELISA 抗體（A)和中和抗體⑶檢測（Serum samples (n = 5)were collected at various time-points. Data were shown as mean + S. D.)
[0044] 圖 8PEDV 特異的淋巴細胞增殖應答（Data were shown as mean 土 S. D.)
[0045] 圖9脾臟淋巴細胞中細胞因子IL-4⑷和IFN-r⑶含量（Data were shown as mean + S. D.) 【具體實施方式】
[0046] 1.材料與方法
[0047] 1. 1毒株、質粒和細胞
[0048] E. coilDH5a、Vero細胞、PEDV弱毒株DR13由本實驗室保存。假單胞菌購自中國 獸醫藥品監察所。昆蟲桿狀病毒表達系統中的pFastBac TMDual質粒、pVAX-Sl (m)質粒、Sf9 昆蟲細胞和DHlOBac菌株購自Invitrogen。以上的試驗材料為常規材料，本領域技術人員 均可通過市場購買得到。
[0049] 1. 2試劑及實驗動物
[0050] 兔抗S1蛋白多克隆抗體、鼠抗假單胞菌外毒素 A蛋白多克隆抗體由本實驗室制 備保存（可通過常規實驗方法制備）。DNA凝膠回收試劑盒、Plasmid Miniprep Kit購自 BI0MEGA公司。HRP標記的羊抗鼠 IgG、羊抗兔IgG和FITC標記的羊抗鼠 IgG、羊抗兔IgG購 自武漢博士德公司。轉染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。T4DNA連接酶、 限制性內切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。Grace, s培養基、FBS購自Gibco公司。 異丙醇和無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司。三氯甲烷購自上海凌峰化學試劑有限 公司。
[0051] 清潔劑ICR小鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心。
[0052] 1.3目的基因的擴增
[0053] 1.3.1 引物
[0054] 根據GenBank發布的假單胞菌外毒素 A基因（PE)、S1 (m)基因序列（SEQ ID N0. 7) 設計合成引物，引物序列如下：
[0055] 表1用于擴增不同S1和ΡΕ( Λ III)片段的引物及其序列
[0056]
【權利要求】
1. 一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白，其特征在于該蛋白系將含有KDEL3 基因序列、缺失III區的銅綠假單胞菌外毒素 A基因序列和SI (m)基因序列的融合基因片 段PE ( Λ III)-SI (m)-KDEL3克隆至桿狀病毒載體中獲得重組載體，將所述的重組載體陽轉 DHlOBac感受態細胞進行重組載體位點特異性轉座獲得重組桿狀質粒，將該重組桿狀質粒 在脂質體介導下轉染Sf9細胞獲得重組Sf9細胞，經該重組Sf9細胞表達獲得。
2. 根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白，其特征在于所述 SI (m)基因的序列為SEQ ID NO. 7。
3. 根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白，其特征在于所述 的桿狀病毒載體為pFastBac?Dual質粒。
4. 一種重組載體pF-PE( Λ III)-SI (m)-KDEL3,其特征在于是將含有KDEL3基因 序列、缺失III區的銅綠假單胞菌外毒素 A基因序列和Sl(m)基因序列的融合基因片段 ΡΕ( Λ III)-S1 (m)-KDEL3 克隆至桿狀病毒載體 pFastBac?Dual 質粒的 Notl 和 Hindlll 兩 個酶切位點間所得。
5. 根據權利要求4所述的重組載體pF-PE( Λ III)-S1 (m)-KDEL3,其特征在于其克隆 過程包含以下步驟： (1) 以pVAX-Sl (m)質粒為模板，引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3經PCR擴增含有KDEL3 基因序列的SI (m)，即SI (m) -KDEL3 ;以經煮沸的假單胞菌菌液為模板，引物SEQ ID NO. 4和 SEQ ID NO. 5擴增缺失III區的PE基因，即ΡΕ (Λ III); (2) 通過Notl和Xhal兩個酶切位點將所得到的基因片段PE( Λ III)克隆入 桿狀病毒載體中獲得重組載體PF-PE(AIII);通過Xhal和Hindlll兩個酶切位點 將所得到的基因片段Sl(m)-KDEL3克隆入重組載體pF-PE( Λ III)中獲得重組載體 pF-PE (Δ III)-Sl(m)-KDEL3〇
6. -種重組重組桿狀質粒，其特征在于是將權利要求4或5所述的重組載體 pF-PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3陽轉DHlOBac感受態細胞進行重組載體位點特異性轉座所得。
7. -種重組Sf9細胞，其特征在于含有權利要求6所述的重組桿狀質粒。
8. 權利要求1?3中任意一項所述豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白的制備 方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 以pVAX-Sl (m)質粒為模板，引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3經PCR擴增含有KDEL3 基因序列的SI (m)，即SI (m) -KDEL3 ;以經煮沸的假單胞菌菌液為模板，引物SEQ ID NO. 4和 SEQ ID NO. 5擴增缺失III區的PE基因，S卩ΡΕ (Λ III); (2) 通過Notl和Xhal兩個酶切位點將所得到的基因片段PE( Λ III)克隆入 桿狀病毒載體中獲得重組載體pF_PE( Λ III);通過Xhal和Hindlll兩個酶切位點 將所得到的基因片段Sl(m)-KDEL3克隆入重組載體pF-PE(A III)中獲得重組載體 pF-PE(Λ III)-SI(m)-KDEL3 ; (3) 將所述的重組載體pF-PE (Λ III)-SI (m)-KDEL3陽轉DHlOBac感受態細胞進行 重組載體位點特異性轉座獲得重組桿狀質粒，在脂質體介導下將重組桿狀質粒轉染Sf9細 胞，經該重組Sf9細胞表達獲得所述的重組蛋白。
9. 根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于所述的桿狀病毒載體為 pFastBac?Dual 質粒。
10. -種亞單位疫苗，其特征在于包含有權利要求1所述的重組Sf9細胞表達的豬流行 性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及佐劑。
【文檔編號】C12N5/10GK104046637SQ201410315228
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年7月3日 優先權日:2014年7月3日
【發明者】姜平, 趙攀登, 白娟 申請人:南京農業大學