重編程t細胞和造血細胞的方法

專利名稱：重編程t細胞和造血細胞的方法
重編程T細胞和造血細胞的方法本申請是申請號為201080024535.2、申請日為2010年6月4日、發明名稱為“重編程T細胞和造血細胞的方法”的中國專利申請的分案申請。
背景技術：
本申請要求2009年6月5日提交的美國申請號61/184，546和2009年9月4日提交的美國申請號61/240，116的優先權，它們的全部公開內容無所放棄地通過引用方式特別全文并入本文。
1.發明領域本發明大體上涉及分子生物學和干細胞領域。更具體而言，本發明涉及體細胞、尤其是T細胞和造血細胞的重編程(reprogramming)。2.相關技術描述一般而言，干細胞是未分化的細胞，其能夠產生成熟的功能性細胞的演替。例如，造血干細胞可以產生任意的不同類型的末端分化的血液細胞。胚胎干(ES)細胞源自胚胎，其是多能的，因此具有發育成任意器官或組織類型，或至少潛在地發育成完整胚胎的能力。誘導的多能干細胞(induced pluripotent stem cell),通常簡稱為iPS細胞或iPSC，是一類人工地從非多能細胞(通常為成年體細胞)衍生而來的多能干細胞。人們相信，在很多方面，誘導的多能干細胞與天然多能干細胞例如胚胎干細胞是相同的，例如在以下方面:某些干細胞基因和蛋白的表達、染色質甲基化的式樣、加倍時間、類胚體(embryoidbody)的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合體的形成以及潛能和分化能力，但是其與天然多能干細胞的相關性的完整程度仍待確定。IPS細胞首先于2006年從小鼠細胞中產生(Takahashi等人，2006)，于2007年從人類細胞中產生(Takahashi等人，2007a; Yu等人，2007)。這在干細胞研究中被認為是重要的進展，因為這可以允許研究人員獲得多能干細胞而不必爭議性地使用胚胎，多能干細胞在研究中具有重要意義并且具有潛在的治療性應用。在人類中，iPS細胞通常是從皮膚成纖維細胞產生。然而，對于皮膚生物活組織的需求和在體外擴增成纖維細胞數個傳代的需要使其成為用于產生患者特異性干細胞的麻煩的來源。此外，以前的用于重編程人的體細胞的方法是不方便的，因為它們需要從人類受試者直接獲得體細胞，或將細胞維持于費力的細胞培養系統中。因此，需要開發用于從替代性來源誘導多能干細胞的簡單、方便和易達的方法 。在開發本發明時，本發明人考慮到血液樣品可以作為來源，因為血液可以從患者或健康個體中收集，儲存并轉移，例如，從中心單位分配至一個或多個遠的地區。然而，據本發明人所知，在本申請之前，沒有關于從來自這樣的臨床可達來源的T細胞產生多能干細胞的報道，這說明對于開發此類技術的顯著需求。發明概述本發明克服了本領域中的主要缺點:提供了通過重編程而衍生自T細胞和/或造血祖細胞的誘導的多能干細胞。本方法能夠從臨床可達的T細胞來源、例如3ml全血樣品產生iPS細胞，避免了動員造血細胞的需要。在其它實施方式中，可以從血液樣品獲得造血細胞，例如人類或哺乳動物⑶34+CD45+CD43+造血前體細胞，并轉化為iPS細胞。可以從外周血的血液樣品獲得造血前體細胞，例如通過富集⑶34+細胞或消除非⑶34+細胞譜系。在一些實施方式中，可以從血液樣品、例如冷凍或冷凍保存的血液樣品獲得⑶34+造血細胞:在獲得血液樣品之前不動員受試者中的CD34+造血祖細胞而獲得。通過這種方式，可以從多種血液樣品、包括存在于血庫中的外周血樣品廣生iPS細胞。因此，提供了用于從T細胞和/或造血祖細胞產生誘導的多能干細胞的方法，包括下列步驟:Ca)獲得包含T細胞和/或造血祖細胞的細胞群體；和(b)從所述細胞群體的T細胞和/或造血祖細胞產生iPS細胞以提供iPS細胞群體。細胞群體的示例性來源可以包括但不限于:血液樣品、血液成分、骨髓、淋巴結、胎兒肝臟或臍帶。細胞群體的來源可以包括血液樣品或源自血液樣品的細胞，其中所述血液樣品獲自在獲得血液樣品之前不外部動員受試者中的造血祖細胞(例如，通過向受試者外部施用造血生長因子)的受試者。細胞群體可以獲自冷凍保存的血液樣品，或者細胞群體的來源或細胞群體可以經過冷凍保存。在實施例中證明了冷凍保存的血液樣品可以用作T細胞的來源以成功地重編程為iPS細胞。本發明的一些方面的具體特點是通過使用小體積的血液樣品而實施本發明的一些方面的能力。血液樣品的適當的體積可以是大約I至大約5ml，大約I至10ml，大約I至15ml，或更具體為大約3ml。可以通過外部施用的G-CSF誘導造血干細胞/祖細胞、例如⑶34+細胞，以誘動進入外周血，以在外周血來源中富集。在本發明的一些方面中發現:來自未動員的供體的外周血細胞能夠實現成功的重編程，因此，無需通過外部施用的生長因子動員骨髓細胞。因此，在具體的方面，細胞群體的來源可以是這樣的受試者:其細胞未經過一種或多種外部施用的造血生長因子、例如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)動員。如在本文中可相互替換使用的術語“外部的(extrinsic) ”或“外部的(external) ”是指從生物體外施用動員劑(mobilizing agent),而不是使用已經通過源自生物體內的內在因子在一定程度上被動員了的CD34+細胞。為了提供適合于重編程的T細胞群體，可以在激活T細胞的條件下在體外制備包含T細胞的細胞群體，例如在存在抗-CD3抗體的情況下進行，或在體內進行(并因此具有針對特定抗原的特定TCR，例如黑素瘤的癌癥抗原，例如GP-100)。這也可以包括使用本領域已知的四聚體、疫苗和/或體外肽刺激。也可以在體外以一種或多種細胞因子(例如IL-2)培養細胞群體以擴增其中的T細胞群體。T細胞可以是人類T細胞。在具體的方面，T細胞可以是⑶4+，⑶8+T細胞，或其組合。T細胞的非限制性實例包括T輔助I(THl)細胞、T輔助2 (TH2)細胞、TH17細胞 、細胞毒性T細胞、調節性T細胞、天然殺傷T細胞、幼稚T細胞、記憶T細胞、Y δ T細胞和任意T細胞。在一些方面，細胞群體包含大約80%至大約99%、大約90%至大約99%、大約97%至大約99%或任何中間范圍的T細胞，這可以對應于至少、大約或至多lxlO3，2xl03, 3xl03, 4xIO3, 5xl03, 6xl03, 7xl03, 8xl03, 9xl03, IxlO4, 2xl04, 3xl04, 4xl03, 5xl04, 6xl04, 7xl04, 8xl04, 9xlO4, IxlO5, 2xl05，3xl05，4xl05，5xl05，6xl05，7xl05，8xl05，9xl05，IxlO6, 2xl06T 細胞或其中任意范圍。例如，本發明人證明了在96孔板中以少至大約1-5χ103Τ細胞/孔重編程(圖6A-6B)。為了提供造血前體細胞的群體，可以在引起CD34+細胞的富集或擴增的條件下制備包含造血細胞的細胞群體。具體地，本發明發現:無需動員骨髓細胞以獲得足夠的用于重編程的CD34+細胞。例如，可以使用磁激活的細胞分選(MACS)或熒光激活的細胞分選(FACS)來富集CD34+造血細胞；在一些實施方式中，可以使用Indirect CD34MicroBead Kit或Direct CD34MicroBead Kit (均可獲自 Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)與MACS從樣品、例如外周血樣品富集CD34+造血細胞。本領域已知還有另外的方法用于從外周血獲得經動員的⑶34+造血祖細胞，包括Gratwohl等人(2002)描述的方法。但是，在一些優選實施方式中，可以從未暴露于一種或多種造血生長因子的受試者獲得⑶34+造血前體細胞；因此，⑶34+造血前體細胞可有利地獲自未經一種或多種外部施用的生長因子動員的供體的血液樣品，包括通常存在于血庫中的血液樣品。在其它實施方式中，可以通過消除成熟的造血細胞、例如T細胞、B細胞、NK細胞、樹突細胞、單核細胞、粒細胞和/或紅細胞而富集樣品中的⑶34+細胞。對于譜系消除，可以以抗體混合物(例如⑶2、⑶3、⑶lib、⑶14、⑶15、⑶16、⑶19、⑶56、⑶123、⑶235a中的一項或多項)溫育細胞懸浮液，然后其可用于除掉上述譜系陽性細胞(例如Karanu等人，2003)。譜系細胞消除試劑盒(MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, Germany)也是商業上可獲得的，并且可用于此目的。在一些實施方式中，可以使用SCF、Flt3L和/或IL-3細胞因子的組合，使用例如Akkina等人(1996)描述的方法或StemPro -34培養基(可獲自Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),擴增并增殖⑶34+細胞，然后轉化為iPS細胞。本發明人預想到:通過本發明描述的方法實質上可以將任意造血祖細胞或⑶34+造血細胞重編程為iPS細胞。在一些實施方式中，可以通過本文提供的方法將獲自或衍生自外周血樣品的造血前體細胞轉化為iPS細胞。造血前體細胞可以表達⑶34和⑶45，或⑶34，⑶45，和⑶43。在一些情況下，可能需要從干細胞、例如人類胚胎干細胞(hESC)產生造血前體細胞；在這些實施方式中，可以產生在髓樣祖細胞中高度富集的⑶34+⑶43+⑶45+造血細胞，例如，按照 Choi等人(2009)的描述，通過共培養hESC與0P9飼養細胞來進行。在一些情況下，造血前體細胞對于⑶34可以是陰性的(例如Guo等人，2003);但預想到這些造血前體細胞可以分化為iPS細胞。為了從細胞群體的T細胞和/或造血祖細胞產生iPS細胞，方法可以包括將一種或多種重編程因子導入T細胞和/或造血祖細胞。在一些方面，重編程因子可以是重編程蛋白，包括Sox家族蛋白和Oct家族蛋白，其中一種或多種或每一種可以可操作地連接于用于細胞進入的蛋白轉導結構域。在本發明的另一個實施方式中，重編程因子可以由一個或多個表達盒編碼，并且可以包括例如，Sox家族蛋白和Oct家族蛋白。Sox和Oct被認為對于確定ES細胞性質的轉錄調節層級具有重要意義。例如,Sox可以是Soxl、Sox2、Sox3、Soxl5或Soxl8，特別是Sox2 ;0ct可以是0ct4。另外的因素可以增強重編程效率，例如Nanog、Lin28、Klf4、c_Myc、SV40大T抗原或Esrrb ;重編程因子的特定組合可以是包含Sox2、0ct4、Nanog和任選包含Lin-28的組合；或包含Sox2、0ct4、Klf和任選包含c_Myc的組合。在具體的實施方式中，一個或多個表達盒可以包含一個或多個多順反子轉錄單位。多順反子單元可以包含可操作地連接的編碼區的不同組合，例如(i)至少兩種重編程基因，例如Sox-Oct、c-Myc-Klf或Nanog_Lin28 ;備選地，(ii)連接于可選擇或可篩選標記物的重編程基因。方面α)可以是優選的，因為本發明人發現:使用具有2種重編程因子/載體(Sox2和0ct4、cMyc和Klf4、或Nanog和Lin28)而沒有任何熒光標志物的雙順反子載體(載體圖譜顯示于圖11A-11C)，而不是使用具有I個重編程因子和I個熒光標志物的4個單獨的雙順反子載體(此類載體的圖譜顯示于圖10)，使用前一種載體的重編程效率顯著改善，并且iPS集落較早出現( 第10-14天而非第20-24天)。為了在同一多順反子轉錄單位中共表達多個基因，多順反子轉錄單位可以包含內部核糖體進入位點(IRES)或編碼至少一種蛋白酶切割位點和/或自我切割肽的序列以進行多順反子轉錄。例如，自我切割肽是病毒2A肽。在另一個實施方式中，一個或多個表達盒包含于選自下列的重編程載體中:病毒載體，游離載體或轉位子。更具體而言，載體可以是逆轉錄病毒載體，例如鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、Akv-MLV、SL-3-3-MLV或其它密切相關的病毒。病毒載體還可以是慢病毒載體。在一些方面，轉錄調節元件可以包含長末端重復區(LTR)以介導病毒基因的整合。在備選方面，載體可以是游離載體，例如基于EBV的載體，或基于轉位子的載體。在其它實施方式中，可以通過脂質體轉染、核轉染、電穿孔、顆粒轟擊、磷酸鈣、多聚陽離子或多聚陰離子或適合用于將外源元件導入細胞的任何方法導入重編程因子。在另外一些方面，可以基于一個或多個胚胎干細胞特性來選擇iPS細胞，例如未分化的形態、胚胎干細胞特異性標志物、粘附性質、多能性、多譜系分化潛力或本領域已知的任何特征。例如，基于未分化的形態來選擇子代細胞是特別方便的。胚胎干細胞特異性標志物可以是選自 SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 或 Tra-1-81，Tra-2-49/6E,⑶F3, REXI, FGF4,ESG1, DPPA2, DPPA4和hTERT的一種或多種特異性標志物。可以在重編程之后的多個時間點執行該選擇步驟以確保細胞處于多 能狀態并且不返回至分化狀態。就與表面的粘附性質而言，iPS細胞也不同于T細胞和造血祖細胞，該性質也可用于方便的分離方法中。在具體的方面，可以基于基本上不表達導入的外源元件、例如包含于表達盒中的載體遺傳元件或報告基因來選擇iPS細胞，因為隨著細胞變成多能性的，重編程的細胞能夠使外源導入的物質沉默。因此，除了形態特征之外，基本上喪失整合性載體遺傳元件或報告分子表達例如熒光，是細胞被重編程的指示。例如，可以基于導入的報告分子基因，通過熒光激活的細胞分選(FACS)、CAT測定或發光測定來選擇報告分子表達的沉默。外源元件的“基本上喪失”或“基本上不含外源元件”意思是iPS細胞群體的少于1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%或任意中間百分率的細胞包含外源元件。iPS細胞群體可以基本上不含整合的、外源的病毒元件。為了 iPS細胞的臨床施用，方法還可以包括使iPS細胞分化為分化的細胞，例如，心肌細胞、造血細胞、肌細胞、神經元、成纖維細胞、胰腺細胞、肝細胞或上皮細胞。在另一個方面，可以公開從如上文所述的iPS細胞群體分化而來的分化的細胞、組織或器官。組織可以包括神經、骨、腸、上皮、肌肉、軟骨或心臟組織；器官可以包括腦、脊髓、心臟、肝、腎、胃、腸或胰腺。在一些方面，分化的細胞、組織或器官可用于組織移植、藥物篩選或發育研究以替代胚胎干細胞。在另一個方面，也可以公開根據如上所述的方法產生的誘導的多能干細胞。還可以提供誘導的多能干細胞，其包含含有T細胞受體基因的V、D和J區段的不完整組的基因組(相對于胚胎干細胞，其可以是人類細胞)。在具體的方面，誘導的多能干細胞可以基本上不含整合的、外源病毒元件。本發明的方法和/或組合物的上下文中所討論的實施方式可以就本文描述的任何其它方法或組合物來應用。因此，涉及一種方法或組合物的實施方式也可以應用于本發明的其它方法和組合物。提及核酸時，如本文使用的術語“編碼(encode)”或“編碼(encoding)”用于使本發明易于被技術人員所理解，但是這些術語可以分別與“包含(comprise)”或“包含(comprising)”相互替換地使用。如本文說明書中使用的“一種(a)”或“一種(an)”可以指一個或多個。如本文權利要求中所使用，當與詞語“包含”一起使用時，詞語“一種(a)”或“一種(an)”可以指一個或多個。除非明確指明僅指替代物或者替代物是相互排斥的，否則權利要求中使用的術語“或”可用于指“和/或”，雖然本公開內容支持僅指替代物和“和/或”的定義。如本文使用的“另一個”可以指至少第二個或更多個。在本申請全文中，術語“大約”用于表示某數值包括用于測定該數值的設備、方法的誤差的內在差異，或者存在于研究受試者之間的差異。本發明的其它內容、特征和優勢將通過以下詳細描述變得明顯。但是應該理解，雖然詳細描述和具體實施例指明了本發明的優選實施方式，但是僅是為了解釋目的而提供，因為本發明精神和范圍內的多種改變和修飾對于閱讀了該詳細描述的本領域技術人員將是明顯的。


以下附圖構成本說明書的一部分，包括這些附圖是為了進一步說明本發明的某些方面。通過參考一個或多個這些附圖并聯合本文提供的具體實施方式
的詳細描述將更好地理解本發明。圖1:T-細胞重編程過程的概覽，開始于激活的T細胞，并產生具有hESC樣形態的iPSC集落。在Olympus 1X71顯微鏡下分別以10倍和20倍物鏡獲得T細胞和iPSC集落圖 像。圖2A-2C:來自人T細胞的誘導的多能干細胞的衍生和表征。圖2A:輸入細胞的CD3表面表達的流式細胞術分析。(i)來自代表性供體的PBMC群體的第-3天非激活的PBMC和第O天激活的T細胞上的⑶3表面表達。(ii)對代表性供體中的轉導后72小時的轉導細胞群體(GFP+)設門的⑶3表達，以顯示⑶3+細胞的優先轉導。(iii) 10個供體真空采血管產生的樣品的平均的上述度量(1-1i)的直方圖。圖2B:代表性的白細胞去除術(“TiPS L-2”)和 Vacutainer ( “TiPS V-1”)衍生的 TiPS 系中的 hESC 多能性標記物0CT4、Tra-1-81、SSEA-3和SSEA-4的流式細胞術分析。圖2C:使用靶向TCRP基因座的V-J區內的保守區的多重PCR引物，分析T細胞受體(TCR) β鏈重排。多克隆的起始T細胞群體由電泳圖譜上的正確片段大小范圍內的擴增子峰的鐘形曲線表示。成纖維細胞(非T細胞)iPS細胞(〃Fib-1PS〃)在TCRii基因座上缺少種系重排，并作為陰性對照。克隆衍生的TiPS系(來自2個白細胞去除術系和I個Vacutainer 系的代表性數據，分別是“TiPS L-l”，“TiPS L-2”;和“TiPS V_2”)顯示出確定大小的一個特征峰。DNA片段分析是在ABI3730DNA分析儀上進行的。圖3A-3D:來自人T細胞的誘導的多能干細胞的表征。圖3A:就hES細胞標志物基因 DNMT38, LEFTB, NODAL, REXI, ESG1, TERT,⑶F3 和 UTFl 的表達，通過 RT-PCR 分析來自白細胞去除術(“TiPS L-1 和 L-2”)和 Vacutainer ( “TiPS V-2”)的代表性的 TiPS 細胞系。GAPDH用作每個樣品的陽性上樣對照。圖3B:通過PCR分析基因組DNA確認轉基因的整合。使用針對目標重編程基因(“RG”)的正向引物和針對IRES的反向引物。0CT4正向和反向引物用作PCR反應陽性對照，如載體圖譜所示。圖3C =TiPS細胞系的RT-PCR分析顯示了外源轉基因的沉默，GAPDH作為每個樣品的陽性對照。hESC系Hl和成纖維細胞衍生的iPSC系(Fib-1PS)作為陽性細胞對照，激活的供體的T細胞作為陰性細胞對照。圖3D:TiPS克隆表達人胚胎干細胞特異性多能標志物，如流式細胞術分析所示。圖4A-4E:TiPS細胞系的體內和體外分化潛力。圖4A:畸胎瘤的形成顯示了體內分化潛力。注射進入SCID/beige小鼠的TiPS細胞在5-12周時形成畸胎瘤。蘇木精和伊紅染色顯示了與從三個原始胚層的衍生一致的組織，包括:具有杯狀細胞的簡單上皮，其表示胃腸或呼吸組織(內胚層)、軟骨(中胚層)和視網膜色素上皮(外胚層)。使用Olympus1X71顯微鏡，使用40倍物鏡獲得來自TiPS L-2細胞系的代表性圖像。圖4B:體外分化為神經元。將TiPS L-2細胞誘導為神經元分化，作為聚集體，然后使用Alexa Fluor594 二抗就神經元標志物β II1-微管蛋白進行染色；以Hoechst對比染色細胞核。使用20倍物鏡獲得圖像。調節對比度，使用Image J軟件合并圖像。圖4C:通過細胞聚集方法進行TiPS細胞的心臟誘導。細胞聚集體在第14-15天含有跳動的心臟肌鈣蛋白T(cTNT)陽性的心肌細胞。顯示了來自代表性樣品的流式細胞術數據。使用10倍物鏡獲得圖像。圖4D:體外分化為造血祖細胞。通過無血清類胚體(EB)分化程序，在兩個TiPS系中分化12天而產生的造血祖細胞(HPC)，與hESC系(Hl)和成纖維細胞衍生的iPSC系(Fib-1PS)進行對比。通過流失細胞術，通過將EB分離為單個細胞并以熒光團綴合的針對⑶34，⑶45，⑶43，⑶31，⑶41和⑶235a的單克隆抗體進行染色來定量HPC。圖4E:通過將EB分化和個體化的細胞置于無血清的MethoCult培養基而進行造血克隆形成性(CFU)檢驗，所述培養基中含有細胞因子SCF，G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6和ΕΡ0。溫育14天之后，根據形態學標準將集落測評為紅細胞(CFU-E/BFU-E)、巨噬細胞(CFU-M，數據未顯示)、粒細胞(CFU-G，數據未顯示)、粒細胞-巨噬細胞(CFU-GM)和粒細胞-紅細胞-巨噬細胞-巨核細胞(CFU-GEMM)。也標示出了總CFU計數(CFU)。使用Olympus CKX41顯微鏡以2倍物鏡獲取圖像。圖5:iPSC克隆追蹤。從畸胎瘤樣品分離基因組DNA并與它們的親代細胞系就TCR^鏈的重排進行比較。顯示了來自細胞系TiPSV-1的代表性數據。衍生的畸胎瘤具有親代細胞系的克隆性重排。使用靶向TC RP基因座的V-J區內的保守區的多重引物進行PCR分析。在ABI3730DNA分析儀上進行DNA片段分析。背景彡1000RFU。圖6A-6B:以96-細胞形式重編程T細胞。圖6A:以雙順反子載體S0(Sox2和0ct4)和CK (c-Myc和Klf4)感染供體A的T細胞并鋪板于MEF。進行活細胞抗_Tral_60標記以檢測iPS細胞集落。圖6B:以雙順反子載體S0(Sox2和0ct4)和NL (Nanog和Lin28)感染供體A的T細胞并鋪板于MEF。進行活細胞抗-Tral-60標記以檢測iPS細胞集落。輸入細胞數顯示為“輸入數目(Input#) ”以表示起始材料中的T細胞數。
圖7:DNA指紋分析。在所分析的8個STR基因座上檢測的所有15個等位基因多態性而言，短串聯重復(STR)分析顯示TiPS細胞系與親代的激活的T細胞是相同的。顯示了來自2個TiPS系(TiPS L-1和TiPS L-2)的代表性數據。圖8:堿性磷酸酶(AP)染色。TiPS系TiPS L-1和TiPS L-2是AP陽性的。在HPScanJet G3110計算機掃描儀上獲取圖像。圖9:TiPS細胞系顯示出正常核型。TiPS細胞系“TiPS L-1”和“TiPS L-2”在MEF上生長6個傳代，系“TiPS V-1”和“TiPS V-2”分別在Matrigel上生長總共18個傳代中的8個傳代，總共34個傳代中的30個傳代。使細胞進行G顯帶分析，沒用檢測到克隆性異
堂
巾O圖10.用于重編程實驗的MMLV逆轉錄病毒構建體的載體圖譜。“RG”表示重編程基因。圖11A-11C:用于重編程實驗(具有改善的重編程)的雙順反子MMLV逆轉錄病毒構建體的載體圖譜。圖1IA:MMLV-0ct4-1RES-Sox2的載體圖譜(簡寫為“0ct4-Sox2”)。圖1lB:MMLV-cMyc-1RES-Klf4 的載體圖譜(簡寫為 “cMyc_Klf4”)。圖1lC:MMLV-Nanog-1RES-Lin28 的載體圖譜(簡寫為 “Nanog_Lin28”)。
具體實施例方式1.緒論

通過病毒轉移確定的因子例如S0X2, 0CT4, NANOG和LIN28或S0X2, 0CT4, c-Myc和KLF4，在體外重編程體細胞為未分化的多能狀態(Yu等人，2007; Takahashi等人，2007b)，已經開啟了使用多種細胞類型產生患者特異性人iPSC的方式(Loh等人，2009; Aasen等人，2008)。通過短暫表達基因或通過使用適當轉錄因子的蛋白質轉導，通過衍生iPSC，進一步發展了該想法。到目前為止，人類中的主要的iPSC研究著眼于以成纖維細胞作為細胞來源。雖然成纖維細胞由于其商業可獲得性和基因遞送的容易性而提供了作為起始材料的數種優點，但它們對于大規模臨床衍生iPSC系是亞最佳的，這是因為需要侵入性皮膚活組織檢查，并且難以從原代組織建立穩定的系。未動員的外周血可能是用于重編程的理想細胞來源，因為容易獲得患者樣品(Maherali and Hochedlinger，2008)。另外，在世界范圍內的生物貯庫中儲存了來自活的和死亡的供體的大量的冷凍的血液樣品(Kleeberger等人，1999)。本發明通過從T細胞和/或造血前體細胞產生誘導的多能干細胞而克服了與目前的重編程技術相關的數個主要問題。如本發明所發現:可以從Iml全血的等量物獲得更豐富的和易處理的血液細胞來源以從T淋巴細胞衍生iPSC。這些T細胞衍生的iPSC(“TiPS”)與hESC以及成纖維細胞衍生的iPSC系具有共同的基本特征。另外，它們保留它們的特征性T細胞受體(TCR)基因重排，該性質可用于例如，作為遺傳追蹤標志物或用于再分化實驗以研究人類T細胞發育。在本發明之前，本發明人對于重編程T細胞或造血祖細胞的成功的可能性是非常不確定的，有數個原因:首先，不確定血液樣品中的T細胞和/或造血前體細胞是否以足以進行重編程的量存在。第二，尚未研究過由T細胞受體基因的V(D) J重組造成基因喪失在重編程中的可能的效應。第三，目前已經被重編程的多數細胞類型是粘附性細胞。T細胞是非粘附性的，并且以懸浮方式培養。直至本發明，尚不清楚進行重編程的T細胞可以轉變為適合于粘附性iPS細胞的粘附培養條件。因此，本發明的方法是首次從T細胞或造血前體細胞產生iPS細胞。T細胞可以容易地從多種來源獲得，例如小體積的血液樣品。類似的，造血前體細胞例如“⑶34+/⑶43+/⑶45+/⑶3K ”或“⑶34'⑶133+/⑶3K ”造血前體細胞可以從外周血樣品富集。本發明的特別的優點在于:T細胞受體的重排的和減少的V、D、J基因區段，其可以在重編程的子代細胞中保留。這作為T細胞衍生的iPS細胞的不同克隆群體的特定特征或“條形碼”，也可以輔助那些未經歷V(D)J重組的來自多能干細胞的iPS細胞的分化。另外，T細胞與iPS細胞之間的粘附性質的差異帶來了自動化分離上的優勢。類似的，造血前體細胞與iPS細胞之間的粘附性質的差異可用于分離。通過將重編程的T細胞或造血祖細胞轉移到適合于粘附的培養條件，例如將經輻射的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)置于T細胞的培養容器的底部，衍生自T細胞或造血祖細胞的iPS細胞可以粘附至底部，而T細胞和/或造血祖細胞保留在懸浮液中。以下描述了本發明的進一步的實施方式和優點。I1.定義“重編程”是這樣的方法:相對于沒有進行重編程的相同條件，其賦予細胞可測的增加的形成至少一種新細胞類型的能力的子代(無論是在培養物中還是在體內)的能力。更具體而言，重編程是賦予體細胞多能潛力的方法。意思是，在足夠的增殖之后，可測比例的子代具有新細胞類型的表型特征(如果在重編程之前基本上沒有此類子代能夠形成)；或者，具有新細胞類型的特征的比例比重編程之前是可測的增加。在某些條件下，具有新細胞類型的特征的子代比例可以是至少大約1%、5%、25%或更高，按次序以漸增為優選。T細胞的“激活劑”或激活T細胞的條件是指:激活T細胞的刺激物,并且包括抗原，其可以呈遞于抗原呈遞細胞上或其它的表面；多克隆激活劑，其結合很多T細胞受體(TCR)復合物而與特異性無關，并包括凝集素，例如伴刀豆球蛋白-A(Con-A)和植物凝集素(PHA)以及試劑，例如特異性結合TCR或CD3蛋白上的不變的框架表位的抗體；和超抗原(superantigen)，其刺激大量的T細胞，并且包括例如，腸毒素，例如葡萄球菌腸毒素。術語“T淋巴細胞”和“T細胞”相互替換地使用，是指:表達T細胞抗原受體(TCR)的細胞，所述受體當與一種或多種MHC分子或一種或多種非經典的MHC分子一起顯示于抗原呈遞細胞表面或基質上時，能夠識別抗原。“⑶4+T細胞”是指在其表面表達⑶4并且與細胞介導的免疫應答相關的T細胞子集。它們的特征在于刺激之后的分泌譜，其可以包括分泌細胞因子，例如IFN-Y、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-1O。“⑶4”是55kD的糖蛋白，其最初定義為T淋巴細胞上的分化抗原，但也存在于其它細胞上，包括單核細胞/巨噬細胞。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族的成員，并且被指是II類MHC(主要組織相容性復合體)限制性免疫應答中的聯合識別元件。在T淋巴細胞上，它們定義了輔助/誘導子集。

“⑶8+T細胞”是指在其表面表達⑶8的T細胞子集，是I類MHC限制性的，并作為細胞毒性T細胞發揮作用。“CD8”分子是存在于胸腺細胞和細胞毒性和抑制性T淋巴細胞上的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成員，并且是I類主要組織相容性復合體限制性相互作用中的聯合識別元件。“造血祖細胞”或“造血前體細胞”是指定向于造血譜系但能夠進一步造血分化的細胞，其包括造血干細胞、多潛能造血干細胞(成血細胞)、髓樣祖細胞、巨核細胞祖細胞、紅細胞祖細胞和淋巴樣祖細胞。造血干細胞(HSC)是多潛能干細胞，其產生所有的血液細胞類型，包括髓樣(單核細胞和巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性細胞、嗜曙紅細胞、紅細胞、巨核細胞/血小板、樹突細胞)和淋巴樣譜系(T細胞、B細胞、NK細胞)。造血祖細胞可以表達⑶34。造血祖細胞可以共表達⑶133并且對于⑶38之表達是陰性的。在一些實施方式中，某些人類造血細胞可以不表達⑶34，但這些細胞也可以通過本文公開的方法轉化為iPS細胞。造血前體細胞包括⑶34+/⑶45+造血前體細胞和⑶34+/⑶45+/⑶43+造血前體細胞。⑶34+/⑶43+/⑶45+造血前體細胞可以就髓樣前體細胞高度富集。造血細胞的多個譜系，例如⑶34+/⑶43+/⑶45+造血前體細胞，可以通過本文公開的方法轉化為iPS細胞。造血細胞可以包括原始造血細胞的多個子集，包括:⑶347⑶133+/⑶38-(原始造血前體細胞)、CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/_)(紅細胞-巨核細胞生成性的)、Iin (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (-)(多潛能)，以及lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(偏髓樣的)細胞、CD133+/ALDH+(醛脫氫酶)(例如Hess等人2004;Christ等人，2007)。預想到:可以按照本文的描述將任意這些原始造血細胞類型或造血前體細胞轉化為iPS細胞。“載體”或“構建體”(有時稱作基因遞送或基因轉移“介質”)是指大分子或分子復合物，其包含要被遞送(體外或體內)進入宿主細胞的多核苷酸。載體可以是線性或環形分子。“質粒”是通常類型的載體，是分離自染色體DNA的染色體外DNA分子，其能夠獨立于染色體DNA而復制。在一些情況 下，其是環形的和雙鏈的。“表達構建體”或“表達盒”意思是能夠指導轉錄的核酸分子。表達構建體至少包括啟動子或功能上等同于啟動子的結構。還可以包括另外的元件，例如增強子和/或轉錄終止信號。當用于與細胞或生物體中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸相關時，術語“外源的”是指通過人工或天然方法被導入該細胞或生物體中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸；或者，當用于與細胞相關時，是指通過人工或天然方法被分離然后被導入其它細胞或導入生物體的細胞。外源核酸可以來自不同的生物體或細胞，或者其可以是天然存在于生物體或細胞中的核酸的一個或多個另外的拷貝。外源細胞可以來自不同的生物體，或者其可以來自相同的生物體。通過非限制性舉例來講，外源核酸位于與天然細胞中的染色體位置不同的染色體位置上，或者其兩側是不同于天然狀態下的核酸序列。術語“對應于”在本文中用于意指多核苷酸序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的(即相同的，非嚴格進化相關)；或，多肽序列與參考多肽序列是相同的。與此對比，術語“互補于”在本文中用于意指互補性序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的。舉例解釋:核苷酸序列"TATAC"對應于參考序列"TATAC"并且互補于參考序列"GTATA"。“編碼”特定蛋白的“基因”、“多核苷酸”、“編碼區”、“序列”、“區段”、“片段”或“轉
基因”是指:在體外或體內時，當被置于合適的調節序列控制下時，轉錄并任選也被翻譯成基因產物例如多肽的核酸分子。編碼區可以以cDNA、基因組DNA或RNA形式存在。當以DNA形式存在時，核酸分子可以是單鏈的(即正義鏈)或雙鏈的。編碼區的邊界由5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子來確定。基因可以包括但不限于，來自原核或真核mRNA的cDNA，來自原核或真核DNA的基因組DNA序列，以及合成的DNA序列。轉錄終止序列通常位于基因序列的3’端。術語“細胞”在本文中以其在本領域中最寬的含義使用，是指作為多細胞生物體的組織的結構單元的活體，其由膜結構環繞，所述膜結構將其與外界隔離，其具有自我復制的能力，并且具有遺傳信息和用于表達它的機制。如本文使用的“細胞”可以是天然存在的細胞或人工修飾的細胞(例如，融合細胞、遺傳修飾的細胞等)。如本文使用的術語“干細胞”是指能夠自我復制和具有多能性的細胞。通常而言，干細胞能夠使受損的組織再生。本文的干細胞可以是但不限于，胚胎干(ES)細胞或組織干細胞(也稱作組織特異性干細胞，或成體干細胞)。任何具有上述能力的人工產生的細胞(例如本文使用的融合細胞、重編程細胞等)都可以是干細胞。“胚胎干(ES)細胞”是源自早期胚胎的多能干細胞。ES細胞首先于1981年建立，從1989年開始，其也被用于產生敲除小鼠。在1998年建立了人ES細胞，目前正開始應用于再生醫學。與ES細胞不同，組織干細胞具有有限的分化潛力。組織干細胞存在于組織中的特定位置，并且具有未分化的細胞內結構。因此，組織干細胞的多能性通常較低。組織干細胞具有較高的核質比并且具有極少的細胞內細胞器。多數組織干細胞具有低的多能性、長的細胞周期和超出個體壽命的增殖能力。基于細胞所來源的位點例如皮膚系統、消化系統、骨髓系統、神經系統等，組織干細胞被分成多個類別。皮膚系統中的組織干細胞包括表皮干細胞、毛囊干細胞等。消化系統中的組織干細胞包括胰腺(普通)干細胞、肝臟干細胞等。骨髓系統中的組織干細胞包括造血干細胞、間質干細胞等。神經系統中的組織干細胞包括神經干細胞、視網膜干細胞等。“誘導的多能干細胞”通常簡寫為iPS細胞或iPSC，是指通過導入被稱作重編程因子的某些因子以人工方式從非多能細胞制備的一類多能干細胞，所述非多能細胞通常是成年體細胞或末端分化的細胞，例如成纖維細胞、造血細胞、肌細胞、神經元、表皮細胞等。“多能性”是指干細胞具有分化成構成一種或多種組織或器官或特別是三個胚層中的任一個的所有細胞的潛力:內胚層(胃內層、胃腸道、肺)、中胚層(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚層(表皮組織和神經系統)。如本文使用的“多能干細胞”是指能夠分化成源自三個胚層中的任一個的細胞的細胞，例如，全能細胞或誘導的多能細胞的直接后代。就核酸分子而言的“可操作地連接”意指按照允許核酸分子轉錄的方式連接的兩個或更多個核酸分子(例如待轉錄的核酸分子、啟動子和增強子元件)。就肽和/或多肽分子而言，“可操作地連接”意指按照產生單一多肽鏈、即融合多肽(其具有融合物的每個肽和/或多肽成分的至少一個性質)的方式連接的兩個或更多個肽和/或多肽分子。特別地，融合多肽是嵌合的，即，由異源分子組成。

“同源性”是指兩個多核苷酸或兩個多肽之間的同一性百分率。一個序列與另一個之間的對應性可以通過本領域已知的技術來確定。例如，同源性可以這樣確定:通過比對序列信息并使用容易獲得的計算機程序而直接比較兩個多肽分子之間的序列信息。備選地，同源性可以這樣確定:在同源區形成穩定雙鏈體的條件下使多核苷酸雜交，然后以單鏈特異性核酸酶消化，并測定消化片段的大小。當使用如上所述的方法測定，至少大約80%、特別是至少大約90%、最特別是至少大約95%的核苷酸或氨基酸各自在確定長度的分子上匹配時，兩個DNA或兩個多肽序列彼此是“實質上同源的”。II1.干細胞的一般背景在本發明的一些實施方式中，公開了通過將重編程因子導入體細胞中而重編程體細胞、尤其是T細胞的方法。這些細胞的子代可以在如下所述的多個方面與胚胎干細胞相同，但基本上不含外源遺傳元件。理解胚胎干細胞的特征可以輔助選擇誘導的多能干細胞。從干細胞重編程研究中獲知的重編程因子可用于這些新方法。還考慮到這些誘導的多能干細胞可以潛在地用于替換胚胎干細胞以用于治療性和研究性應用，因為使用后者具有倫理方面的阻礙。A.干細胞多數情況下(如果不是全部)干細胞是發現于多細胞生物體中的細胞。其特征在于通過有絲細胞分裂進行自我更新的能力以及分化為多種特化細胞類型的能力。兩種主要類型的哺乳動物干細胞是:發現于胚泡的胚胎干細胞，和發現于成體組織中的成年干細胞。在發育中的胚胎中，干細胞能夠分化成所有的特化胚胎組織。在成年生物體中，干細胞和祖細胞作為身體的修復系統，補充特化細胞，但也維持再生器官例如血液、皮膚或腸組織的正常周轉。由于干細胞可以通過細胞培養而生長并轉化為具有與多種組織例如肌肉或神經的細胞一致的特征性特化細胞，所以已經建議其用于醫學治療。尤其是，通過治療性克隆產生的胚胎細胞系、自體同源胚胎干細胞，以及來自臍帶血或骨髓的高度可塑性的成年干細胞被認為是有前景的候選物。最近 ，成年細胞重編程為誘導的多能干細胞已經具有替代胚胎干細胞的巨大潛力。B.胚胎干細胞胚胎干細胞系(ES細胞系)是源自胚泡或更早的桑葚胚時期的胚胎的內細胞群(ICM)的外胚層組織的細胞培養物。胚泡是早期胚胎——在人類中是大約4至5天，由50-150個細胞組成。ES細胞是多能的，在發育過程中產生三個主要胚層:外胚層、內胚層和中胚層的所有衍生物。換言之，當給予特定細胞類型的足夠和必需的刺激時，它們可以發育為成體的200種以上的細胞類型中的每一種。它們對胚胎外的膜或胎盤沒有貢獻。到目前為止，幾乎所有的研究都是使用小鼠胚胎干細胞(mES)或人類胚胎干細胞(hES)進行的。二者都具有實質性的干細胞特征，但是它們需要差異極大的環境以維持未分化狀態。小鼠ES細胞可以生長于明膠層上，并且需要白血病抑制因子(LIF)的存在。人ES細胞可以生長于小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養層上，通常需要堿性成纖維細胞生長因子(bFGF或FGF-2)的存在。如果沒有最佳培養條件或遺傳操作(Chambers等人，2003)，胚胎干細胞將迅速分化。人類胚胎干細胞還可以根據數種轉錄因子和細胞表面蛋白的存在來確定。轉錄因子0ct4、Nanog和Sox2構成核心調節網絡，其確保引起分化的基因的阻抑和多能性的維持(Boyer等人，2005)。最常使用的鑒定hES細胞的細胞表面抗原包括糖脂SSEA3和SSEA4以及硫酸角質素抗原Tra-1-60和Tra-1-81。經過20年的研究之后，沒有經批準的使用胚胎干細胞的治療或人類試驗。ES細胞是多能細胞，其需要特定的信號以進行正確的分化——如果直接注入體內，ES細胞將分化成很多不同類型的細胞，引起畸胎瘤。使ES細胞分化為可用的細胞并避免移植排斥僅僅是胚胎干細胞研究仍然面臨的障礙中的一小部分。很多國家目前禁止ES細胞的研究或新的ES細胞系的產生。由于胚胎干細胞具有無限擴增和多能性的組合能力，胚胎干細胞仍然是損傷或疾病之后的再生醫學和組織替換的理論潛在來源。比較而言，解決這些問題的一種方案是通過直接重編程在體細胞中誘導多能狀態。IV.重編程因子用于誘導的重編程因子對于iPS細胞的產生具有關鍵意義。以下因子或其組合可用于本發明公開的方法中。在一些方面，重編程載體中將包括編碼Sox和Oct (特別是0ct3/4)的核酸。例如 ，一個或多個重編程載體可以包含編碼Sox2、0ct4、Nanog和任選Lin28的表達盒,或編碼Sox2、0ct4、Klf4和任選c_Myc的表達盒,或編碼Sox2、0ct4和任選 Esrrb 的表達盒,或編碼 Sox2、0ct4、Nanog、Lin_28、Klf4、c-Myc 和任選 SV40 大的 T 抗原的表達盒。編碼這些重編程因子的核酸可以包含在同一表達盒中、不同表達盒中、同一重編程載體中，或不同重編程載體中。0ct4和Sox基因家族的一些成員(Soxl、Sox2、Sox3和Soxl5)已經被鑒定為參與誘導過程的關鍵性轉錄調節子，其缺失會使誘導不能進行。另一方面，另外的基因，包括Klf家族的一些成員 0(1打、1(1€2、1(1€4和1(1€5)、Myc 家族的一些成員(c_Myc、L-Myc 和 N-Myc)、Nanog和Lin28已經被鑒定為增強誘導效率。0ct4(Pou5fl)是八聚合體(octamer, 〃0ct〃)家族轉錄因子之一,在維持多能性方面具有關鍵作用。0ct4+細胞例如卵裂球和胚胎干細胞中0ct4的缺失會導致自發的滋養層分化，因此0ct4的存在產生胚胎干細胞的多能性和分化潛力。〃0ct〃家族中的多個其它基因，包括0ct4的近親Octl和0ct6，不能引發誘導，因此證明了 Oct-4在誘導過程中的專有性。與0ct4類似,Sox基因家族與維持多能性相關,雖然其與多潛能(multipotent)和單能干細胞相關，而0ct4與此相反，0ct4專有性地在多能干細胞中表達。雖然Sox2是用于重編程誘導的最初基因，但是發現Sox家族中的其它基因也在誘導過程中同樣起作用。Soxl以類似于Sox2的效率產生iPS細胞，基因Sox3、Soxl5和Soxl8也產生iPS細胞，雖然效率較低。在胚胎干細胞中，Nanog以及0ct4和Sox2是促進多能性所需的。因此，當Yamanaka等人報道“Nanog對于誘導不是必需的、但Thomson等人報道可以使用Nanog作為因子之一來產生iPS細胞時，是令人驚奇的。Lin28是一種mRNA結合蛋白，其在胚胎干細胞和胚胎癌細胞中表達，與分化和增殖相關。Thomson等人證明其是產生iPS的一個因子，雖然其不是必需的。Klf基因家族的Klf4最初由Yamanaka等人鑒定,并由Jaenisch等人確認為用于產生小鼠iPS細胞的因子，并由Yamanaka等人證明是用于產生人類iPS細胞的因子。然而，Thompson等人報道:Klf4對于人類iPS細胞的產生不是必需的，事實上其不能產生人類iPS細胞。發現Klf2和Klf4是能夠產生iPS細胞的因子，相關的基因Klfl和Klf5同樣也是，雖然效率較低。Myc基因家族是牽涉于癌癥的原癌基因。Yamanaka等人和Jaenisch等人證明c-Myc是牽涉于小鼠iPS細胞之產生中的因子，Yamanaka等人證明其是牽涉于人類iPS細胞之產生中因子。然而,Thomson等人和Yamanaka等人報道c_Myc對于產生人類iPS細胞不是必需的。將"Myc"基因家族用于誘導iPS細胞對于iPS細胞最終作為臨床治療具有麻煩，因為25%的移植了 c-Myc誘導的iPS細胞的小鼠產生致命性畸胎瘤。N-Myc和L-Myc已經被鑒定為以類似的效率進行誘導(替代c-myc)。SV40大抗原可用于減少或防止當表達c-Myc時可能發生的細胞毒性。本發明中使用的重編程蛋白可以被具有大約相同的重編程功能的蛋白同源物替代。編碼這些同源物的核酸也可用于重編程。保守性氨基酸置換是優選的，即，例如，作為極性酸性氨基酸的天冬氨酸/谷氨酸；作為極性堿性氨基酸的賴氨酸/精氨酸/組氨酸；作為非極性或疏水性氨基酸的亮氨酸/異亮氨酸/甲硫氨酸/纈氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作為極性或不帶電的親水性氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸。保守性氨基酸置換還包括基于側鏈的分組。例如，具有脂肪族側鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理預期:將亮氨酸替換為異亮氨酸或纈氨酸、將天冬氨酸替換為谷氨酸、將蘇氨酸替換為絲氨酸、或類似地將氨基酸替換為結構上相關的氨基酸將不會對得到的多肽的性質產生大的影響。可以通過測定多肽的比活性容易地確定氨基酸替換是否產生功能性多肽。V.T細胞和/或造血前體細胞的重編程為了從目前本領域通常使用的皮膚成纖維細胞之外的備選來源提供iPS細胞，提供了用于重編程包含T細胞的細胞群體的方法。在一些實施方式中，激活并擴增T細胞以提供顯著數目的T細胞用于重編程。A.T 細胞 術語“T細胞”是指如本領域中定義的T淋巴細胞并意在包括胸腺細胞、未成熟T淋巴細胞、成熟的T淋巴細胞、靜止的T淋巴細胞或激活的T淋巴細胞。T細胞可以是⑶4+T細胞、⑶8+T細胞、⑶4+⑶8+T細胞或⑶4_CD8_細胞。T細胞也可以是T輔助細胞，例如T輔助I(THl)或T輔助2(TH2)細胞或TH17細胞，以及細胞毒性T細胞、調節性T細胞、自然殺傷T細胞、幼稚T細胞、記憶T細胞或Y δΤ細胞(Wi I son等人，2009; Wynn, 2005; Ladi等人，2006)。彼此差別在于至少一種標志物例如CD4的T細胞，在本文中被稱作T細胞的“子
隹”: ο輔助T細胞(效應T細胞或Th細胞)是適應性免疫系統的“中間者”。一旦被激活，它們迅速分裂并分泌被稱作細胞因子的小的蛋白，所述細胞因子調節或輔助免疫應答。取決于大小、接收到的細胞因子信號，這些細胞分化為TH1、TH2、TH3、TH17、THF或其它子集中的一種，它們分泌不同的細胞因子。⑶4+細胞與II類MHC相關。細胞毒性T細胞(TC細胞或CTL)破壞被病毒感染的細胞和腫瘤細胞，并且也被指參與移植排斥。這些細胞也被稱作CD8+T細胞(與I類MHC相關)，因為它們在其表面表達⑶8糖蛋白。通過SLOB與T調節性⑶4+⑶25+FoxP3+細胞的相互作用，這些細胞可以被滅活為無變應性狀態，這預防了自身免疫疾病，例如實驗性自身免疫性腦脊髓炎。
記憶T細胞是感染消退之后長期持續的抗原特異性T細胞的子集。在重新暴露于它們的同種抗原(cognate antigen)之后,它們迅速擴增為大量的效應T細胞,從而為免疫系統提供針對過往感染的“記憶”。記憶T細胞包括兩個子集:中心記憶T細胞(TCM細胞)和效應記憶T細胞(TEM細胞)。記憶細胞可以是⑶4+或⑶8+。調節性T細胞(Treg細胞)，以前被稱作抑制性T細胞，對于維持免疫耐受是關鍵性的。它們類似于表達常規a PTCR的⑶4+細胞。它們可以進一步表征為⑶25和Foxp3蛋白的共表達。它們的主要作用是在將近免疫反應的末期關閉T細胞介導的免疫力，并且抑制那些逃脫了胸腺中的陰性選擇過程的自身反應性T細胞。已經描述了 CD4+調節性T細胞的兩個主要類別，包括自然產生的Treg細胞和適應性Treg細胞。自然產生的Treg細胞(也稱作⑶4+⑶25+FoxP3+Treg細胞)產生于胸腺中，而適應性Treg細胞(也稱作Trl細胞或Th3細胞)可以在正常免疫應答過程中起源。通過被稱作FoxP3的細胞內分子的存在可以將自然產生的Treg細胞與其它T細胞區別開。F0XP3基因的突變可以阻止調節性T細胞發育，引起胎兒自身免疫疾病IPEX。

自然殺傷T細胞(NKT細胞)是異質的T細胞群體，其特征在于共表達α β或
Y6!'0 和多種爾受體，包括0)16，0)56，0)161，0)94，0)1583和0)15813。NK T 細胞具有在激活后迅速分泌大量細胞因子的能力。NK T細胞克隆分泌I型、2型或這兩種類型的細胞因子，其可以影響ThO細胞向Thl或Th2細胞的分化。NK T細胞被描述為:在小鼠中是表達不變的TCR Va 14的細胞，在人類中是表達不變的TCR V a 24的細胞。最近，也已經認識到了表達多種TCR的NK T細胞。⑶3+CD56+細胞代表NK T細胞群體的一種。NK T細胞可以是 CD4+CD8+，CD4- CD8 ' CD4 ^ CD8+ 或 CD4+CD8'Y δ T細胞(伽瑪德爾塔T細胞)代表在它們的表面具有獨特的T細胞受體(TCR)的T細胞的小的子集。大多數T細胞具有由被稱作α-和β-TCR鏈的兩個糖蛋白鏈構成的TCR。然而，在Y δ T細胞中，TCR由I個Y -鏈和I個δ -鏈組成。該組T細胞相對于α βΤ細胞較不常見(全部T細胞的5%)，但是在腸道粘膜中其豐度最高，在被稱作上皮內淋巴細胞(IEL)的淋巴細胞群體內。激活Y δ T細胞的抗原性分子仍然是未知的。但是，
Yδ T細胞不是MHC限制性的，并且似乎能夠識別整個蛋白，而不需要抗原呈遞細胞上的MHC分子呈遞肽。一些識別IB類MHC分子。人Vy9/VS 2Τ細胞構成外周血中的主要Y δΤ細胞群體，它們是獨特的，因為它們特異性且迅速對小的非肽微生物代謝物HMB-PP(異戊烯焦磷酸前體)作出應答。存在于來自健康供體的外周血中的T細胞的百分率估計如下:CD3+=70.78%±4.71; CD3+CD4=38.97%±5.66; CD3+CD8=28.955%±7.43; CD3+CD56+=5.22%±1 74;CD3_CD56+=10.305%±4.7;CD3+CD45RA=45.00%±7.19;CD3+CD45R0+=27.21%±7.34。T細胞可以是T細胞的純化的群體，或者備選地，T細胞可以在與不同類型的細胞、例如B細胞和/或其它外周血細胞的群體中。T細胞可以是T細胞的子集、例如CD4+T細胞的純化的群體，或者，它們可以是包含T細胞的不同子集的T細胞的群體。在本發明的另一個實施方式中，T細胞是已經在培養物中維持了延長的時間段的T細胞克隆。T細胞克隆可以轉化至不同程度。在具體的實施方式中，T細胞是在培養物中無限增殖的T細胞克隆。在本發明的優選實施方式中，T細胞是原代T細胞。術語“原代T細胞”意指包括獲自個體的T細胞，與在培養物中維持了延長的時間段的T細胞不同。因此，原代T細胞特別是獲自受試者的外周血T細胞。原代T細胞的群體可以主要由T細胞的一個子集組成。備選地，原代T細胞的群體可以由T細胞的不同子集組成。T細胞可以來自之前儲存的血液樣品，來自健康個體，或備選地，來自被某病況影響的個體。所述病況可以是感染性疾病，例如由病毒感染、細菌感染或任何其它微生物感染引起的病況，或過度增生性疾病，例如癌癥，例如黑素瘤。在具體的實施方式中，T細胞來自感染了人免疫缺陷病毒(HIV)的個體。在本發明的另一個實施方式中，T細胞來自患有自身免疫疾病或T細胞病癥或對其易感的受試者。T細胞可以來源于人、鼠或任何其它哺乳動物物種。B.造血祖細胞由于造血干細胞和造血祖細胞的顯著的醫學潛在意義，已經進行了實質性工作以試圖改善從胚胎干細胞分化造血祖細胞的方法。在成人中，主要存在于骨髓中的造血干細胞產生活躍分裂的造血(CD34+)祖細胞的異質群體，所述祖細胞分化為血液系統的所有細胞。雖然預期到CD34+內皮細胞可以被轉化為iPS細胞，但是在一些實施方式中，使用非內皮細胞的造血細胞可能是理想的；例如，在一些情況下，使用不表達CD31或VE-鈣粘蛋白的造血祖細胞或造血前體細胞可能是理想的。其它標志物，例如⑶43和/或⑶45標志物，也可用于輔助鑒定造血祖細胞(例如，Kadaja-Saarepuu等人，2008; Vodyanik等人，2006)。造血細胞包括原始造血細胞的多個子集，包括:CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/_)(紅細胞-巨核細胞生成性的)，Iin (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (-)(多潛能)，和lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(偏髓樣的)細胞。在成人中，造血祖細胞增殖并分化，引起每日產生數千億成熟的血液細胞。造血祖細胞也存在于臍帶血中。在體外，人胚胎干細胞可以分化為造血祖細胞。也可以從外周血樣品擴增或富集造血祖細胞。造血細胞可以來源于人、鼠或任何其它哺乳動物物種。C.細胞群體的來源造血干細胞(HSC)通常產生于骨髓中，但可被迫使進入血液，該過程被稱作動員(mobilization),在臨床上用于收獲外周血中大量數目的HSC。所選的一種動員劑是粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。可以通過血液成分去除法，在無擾狀態，或在外部施用造血生長因子例如G-CSF動員之后，收集在外周血中循環的CD34+造血干細胞或祖細胞。在動員之后收集的干或祖細胞的數目大于在無擾狀態下在血液成分去除法之后獲得的數目。在本發明的具體方面，細胞群體的來源是這樣的受試者:其細胞未經外部施用的因子動員，因為無需富集造血干細胞或造血祖細胞。用于本文描述的方法中的細胞的群體可以是哺乳動物細胞，例如人類細胞，非人靈長類細胞，嚙齒類細胞(例如小鼠或大鼠)，牛細胞，羊細胞，豬細胞，馬細胞，綿羊細胞，犬細胞，貓細胞，或其混合物。非人靈長類細胞包括稱猴細胞。細胞可以獲自動物，例如人類患者，或者它們可以來自細胞系。如果細胞是獲自動物，則它們可以用作，例如，未分離的細胞(即，混合的群體)；它們可以已經在培養物中建立，例如，通過轉化；或者它們可以已經經歷初步純化方法。例如，可以基于細胞表 面標志物的表達通過陽性或陰性選擇操作細胞群體；在體外或在體內以一種或多種抗原刺激；在體外或在體內以一種或多種生物修飾劑處理；或這些中的任意或全部項的組合。在示例性實施方式中，細胞群體經歷陰性選擇以消除非T細胞和/或特定T細胞子集。陰性選擇可以基于多種分子的細胞表面表達來進行，包括=B細胞標志物，例如⑶19和⑶20 ;單細胞標志物⑶14 ；NK細胞標志物⑶56。備選地，細胞群體可以經歷陰性選擇以消除非CD34+造血細胞和/或特定的造血細胞子集。陰性選擇可以基于多種分子的細胞表面表達來進行，例如，抗體的混合物(例如，⑶2，⑶3，⑶11b，⑶14，⑶15，⑶16，⑶19，⑶56，⑶123和⑶235a)，其可用于分離其它細胞類型，例如通過MACS或柱分離。細胞的群體包括外周血單核細胞(PBMC)、含有混合群體的全血或其級份，脾細胞，骨髓細胞，腫瘤浸潤性淋巴細胞，通過白細胞去除術獲得的細胞，生物活組織檢查樣品，淋巴結，例如從腫瘤引流的淋巴結。合適的供體包括經免疫的供體、非免疫的(原態)供體、經處理的或未經處理的供體。“經處理的”供體是已經暴露于一種或多種生物修飾劑的供體。“未經處理的”供體是未暴露于一種或多種生物修飾劑的供體。獲得包含T細胞的細胞群體的方法是本領域熟知的。例如，可以根據本領域已知的方法獲得外周血單核細胞(PBMC)。此類方法的實例見實施例部分并由Kim等人(1992) ;Biswas 等人(1990) ;Biswas 等人(1991)討論。從細胞群體獲得造血前體細胞的方法也是本領域熟知的。可以使用多種細胞因子擴增造血前體細胞，例如hSCF、hFLT3和/或IL-3 (Akkina等人，1996)，或者可以使用MACS或FACS富集⑶34+細胞。如上所述，也可使用陰性選擇技術來富集⑶34+細胞。也可以從受試者獲得細胞樣品，然后就所需的細胞類型富集之。例如，可以根據本文的描述從血液分離PBMC和/或CD34+造血細胞。可以使用逆流離心法(淘析)從PBMC中富集T細胞。也可以使用多種技術從其它細胞分離細胞，例如，使用結合于所需的細胞類型的細胞表面上的表位的抗體來分離和/或激活，例如，一些T細胞分離試劑盒使用綴合于珠子的抗體激活細胞，然后使用相同的珠子進行柱分離。可以使用的另一種方法包括:使用針對細胞表面標志物的抗 體進行陰性選擇，以選擇性富集特定細胞類型而不通過受體的介入激活細胞。骨髓細胞可以獲自髂嵴、股骨、脛骨、脊骨、肋骨或其它骨髓腔。可以從患者取出骨髓并通過多種分離和洗滌程序分離。用于分離骨髓細胞的已知程序包括以下步驟:a)將骨髓懸浮液離心分離為3個級份，并收集中間級份，或棕黃層；b)在單獨的液體、通常為Ficoll (Pharmacia Fine Chemicals AB的商標)中再離心來自步驟a)的棕黃層級份I次，收集含有骨髓細胞的中間級份；和c)洗滌來自步驟b)的收集的級份以回收可輸送的骨髓細胞。如果希望使用富含T細胞的細胞群體，則可以通過白細胞去除術和機械血液成分去除法，使用連續流動細胞分離器，從混合的細胞群體獲得此類細胞群體。例如，可以通過任意已知的方法從棕黃層分離T細胞，包括在Ficoll-Hypaque 梯度上分離，在PercolI梯度上分離，或通過淘析。D.T細胞激活在一些方面，T細胞被試劑激活，所述試劑結合T細胞受體以激發用于T細胞激活的信號級聯。例如，可以使用CD3抗體。為了使T細胞擴增為大量的數目和增殖性狀態以用于重編程，也可以使用細胞因子，例如IL-2。幼稚T細胞可以生存很多年而不分裂。這些小的靜止細胞具有致密的染色質和貧乏的細胞質并合成極少的RNA或蛋白質。在激活后，它們必須重新進入細胞周期并迅速分裂以產生大量的子代，所述子代將分化為武裝的效應T細胞。它們的增殖和分化由被稱作白介素-2(IL-2)的細胞因子介導，該細胞因子是由激活的T細胞本身產生的。在存在所需的共刺激信號的情況下，與特定抗原的最初相遇會激發T細胞進入細胞周期的G1期；同時，其還誘導IL-2以及IL-2受體的α鏈的合成。IL-2受體具有3條鏈:α、β和Y。靜止T細胞表達由β和Y鏈組成的該受體，其以中等親和性結合IL-2，允許靜止T細胞對非常高濃度的IL-2作出應答。α鏈與β和Υ鏈的結合會產生具有針對IL-2的高得多的親和性的受體，允許細胞對非常低濃度的IL-2作出應答。然后，IL-2與高親和性受體的結合激發越過細胞周期的靜止期的進程。通過這種方式激活的T細胞能夠在I天內分裂2-3次，持續數天，允許I個細胞產生由數千個子代組成的克隆，所述子代都攜帶相同的針對抗原的受體。IL-2還促進這些細胞分化為武裝的效應T細胞。雖然不同類別的T細胞的具體激活機理稍有差別，但對于多數而言，CD4+T細胞采用“雙信號模式”。⑶4+Τ細胞的激活通過T細胞受體與T細胞上的⑶28的嚙合進行，分別通過APC上的主要組織相容性復合物肽和Β7家族成員進行。二者對于產生有效免疫應答都是必需的；在不存在CD28共刺激的情況下，單獨的T細胞受體信號傳導導致無反應性。CD28和T細胞受體下游的信號傳導途徑涉及很多蛋白。第一信號是通過T細胞受體與另一細胞上的主要組織相容性復合物(MHC)呈遞的短肽的結合而提供的。這確保了只有那些具有特異于該肽的TCR的T細胞被激活。伴侶細胞通常是專職的抗原呈遞細胞(APC)，在原始應答的情況下，通常是樹突細胞，雖然B細胞和巨噬細胞也可以是重要的APC。由I類MHC分子呈遞至⑶8+Τ細胞的肽的長度是8-9個氨基酸；由II類MHC分子呈遞至⑶4+Τ細胞的肽更長，因為II類MHC分子的結合裂口的末端是開放的。第二信號來自共刺激，其中APC上的表面受體是由數量相對少的刺激物誘導的，通常是病原體的產物，但有時 是細胞的分解產物，例如壞死體或熱激蛋白。幼稚T細胞組成型表達的僅有的共刺激受體是⑶28，所以這些細胞的共刺激來自APC上的⑶80和⑶86蛋白。在T細胞激活后也表達其它受體，例如0X40和IC0S，但它們的表達很大程度上依賴于CD28。第二信號許可T細胞對抗原作出應答。如果沒有它，T細胞變得無反應性，并且其將來的激活也變得更難。該機制防止對自身的不適當應答，因為自身肽通常不與適宜的共刺激呈遞。在一些方面，當涉及共刺激時，抗-⑶3和抗-CD28 二者可用于T細胞激活。在備選方面，可以應用抗-CD3的交聯，例如結合于平板的抗-CD3。如果可溶性抗-CD3用于激活PBMC中的T細胞，該可溶性抗-CD3抗體可以與PBMC中的APC結合，然后其將抗體呈遞至T細胞。如果在純化的T細胞的群體中僅使用可溶性抗-CD3抗體，因為上述原因，將導致無反應性。本發明的一些實施方式包括在存在抗_CD3(0KT3)和IL2的情況下培養T細胞，這是有利的和方便的，因為無需使用昂貴和麻煩的珠子或結合于平板的抗體；在加入0KT3和IL2之后，PBMC的細胞環境將輔助激活T細胞。然后，T細胞由于優先擴增而相對于PBMC培養物中的其它細胞類型變得過密。T細胞受體以數個蛋白的復合物存在。實際的T細胞受體由兩個單獨的肽鏈組成，其是由獨立的T細胞受體α和β (TCRa和TCRP )基因產生的。復合物中的其它蛋白是⑶3蛋白:⑶3 ε y和⑶3 ε δ異二聚體，以及，最重要的，⑶3 ζ同二聚體，其具有總共6個ITAM基序。CD3 ζ上的ITAM基序可以被Lck磷酸化，繼而募集ZAP-70。Lck和/或ΖΑΡ-70也可以將很多其它分子(同樣重要的CD28、LAT和SLP-76)上的酪氨酸磷酸化，這允許信號傳導復合物在這些蛋白周圍聚集。磷酸化的LAT募集SLP-76至膜，在那里其可以引來PLC Y、VAVl、Itk和潛在地，PI3K。PLC Y和PI3K 二者都作用于膜的內小葉上的PI (4，5)P2，以產生活性中間體二酰基甘油(DAG)、肌醇-1, 4，5-三磷酸(IP3)和磷脂酰肌醇_3，4，5-三磷酸(PIP3)。DAG結合并激活T細胞上的一些PKC，例如PKC Θ，該過程對于激活轉錄因子NF- K B和AP-1具有重要意義。IP3由PLCy從膜釋放，并迅速擴散以激活ER上的受體，這誘導鈣的釋放。然后，釋放的鈣激活鈣神經素，鈣神經素激活NFAT，然后其轉位至細胞核。NFAT是轉錄因子，其激活多向性的一組基因的轉錄，最特別是IL-2，其是促進激活的T細胞的長期增殖的細胞因子。根據本發明的方法，將核酸分子導入活躍增殖(即擴增)的T細胞。可以通過將T細胞與多種試劑(例如提供原始刺激信號的試劑與針對T細胞的共刺激信號的組合)接觸來刺激T細胞以使其擴增。可用于刺激T細胞以使其擴增的試劑是本領域熟知的，并且在下文中描述。被刺激而增殖的T細胞的特征在于細胞擴大、簇集和培養基的酸化。因此，T細胞增殖可以通過例如檢查T細胞的尺寸或測定其體積(例如使用庫耳特計數器)來證明。靜止T細胞具有大約6.8微米的平均直徑。在最初激活和刺激之后，T細胞的平均直徑將在第4天時增加至超過12微米，并在約第6天時開始降低。此外，可以通過本領域已知的標準技術測定T細胞增殖，例如通過氚標記的胸苷攝取。本發明的方法涉及，在將核酸分子導入增殖中的T細胞之前將增殖中的T細胞與至少一種刺激劑接觸。術語“刺激劑”意在包括向T細胞提供信號的試劑，從而，相對于導入核酸分子之前不將T細胞與刺激劑接觸的情況，當在將核酸分子導入T細胞之前將T細胞與刺激劑接觸時，被轉染進入T細胞的核酸分子中包含的基因的表達水平較高。在本發明的具體實施方式
中，刺激劑是向T細胞提供原始激活信號的試劑。表述“原始激活信號”意在包括通常通過TCR/CD3復合物激活的信號，其誘導T細胞的激活。T細胞的激活意在包括T細胞的修飾，從而T細胞在接收到第二信號、例如共刺激信號之后被誘導以增殖并分化。在具體的實施方式中，原始激活信號由接觸T細胞受體或與T細胞受體相關的CD3復合物的試劑提供。在優選實施方式中，試劑是針對CD3的反應性抗體，例如單克隆抗體0KT3 (可獲自美國典型培養物保藏中心，Rockville, Md.; N0.CRL8001)。在本發明的另一個實施方式中，刺激劑是刺激T細胞上的CD2復合物的試劑，例如抗體的組合，例如Til.3+T11.1，或 Til.3+T11.2(見，例如 Meuer 等人，1984)。在方法的另一個實施方式中，刺激劑是淋巴因子，例如IL-2。淋巴因子特別與另一試劑組合使用，例如向T細胞提供原始激活信號的試劑，用于刺激T細胞。因此，在本發明的優選實施方式中，在以核酸分子轉染T細胞之前，將T細胞與向T細胞提供原始激活信號的試劑(例如，抗-CD3抗體)和有效量的IL-2的組合接觸，從而核酸分子在T細胞中表達。在本發明的優選實施方式中，T細胞被刺激T細胞中的原始激活信號和共刺激信號的試劑組合所激活。術語“共刺激試劑”意在包括向T細胞提供共刺激信號的試劑，從而已經接收到原始激活信號的T細胞(例如激活的T細胞)被刺激而增殖或分泌細胞因子，例如IL-2、IL-4或干擾素- Y。在具體的實施方式中，共刺激試劑與T細胞表面上的⑶28或CTLA4分子相互作用。在更具體的實施方式中，共刺激信號是CD28或CTLA4的配體，例如B-淋巴細胞抗原B7-1或B7-2。詞語“刺激形式的⑶28的天然配體”意在包括B7-1和B7-2分子，其片段或其修飾，它們能夠向T細胞提供共刺激信號。刺激形式的CD28的天然配體可以這樣鑒定:例如，將激活的外周血淋巴細胞與一定形式的CD28的天然配體接觸，并進行標準的T細胞增殖檢驗。因此，刺激形式的CD28的天然配體能夠刺激T細胞的增殖。刺激形式的CD28/CTLA4的天然配體描述于例如PCT
發明者M·布朗, E·R·多明格斯, R·萊亞里什, E·努韋瑟, D·拉杰什, A·麥克 申請人:細胞動力國際有限公司