專利名稱：利用高通量組織芯片檢測golph3在腦膠質瘤中的表達的方法
技術領域：
本發明屬于檢測 G0LPH3在腦膠質瘤中的表達領域，特別涉及一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達的方法。
背景技術：
多形性膠質母細胞瘤(GBM)是人類星形膠質細胞瘤中惡性程度最高、最頑固的腫瘤，大多數病人的生存期低于2年。其快速浸潤性生長使得大多數腫瘤在診斷時已無法完全切除。治療方案包括外科手術、放射治療和輔助性化療。手術切除是治療過程中非常重要的一個部分，可以達到明確診斷、縮小腫瘤體積、減少細胞數目并提高患者生存期的目的。然而，盡管經過目前最有效的治療，GBM患者在明確診斷后的預后生存期仍只有14個月。為了達到早期診斷和更好的療效，已經付出了許多努力來尋找新的分子標記物和靶向療法。在GBM基因和分子異常方面的最新發現使得治療方向分子靶向藥物和更多合理的靶向分子治療轉移。幾個新的基因，如EGFR、RDA51、S0X2和VEGF，被發現參與了 GBM的腫瘤形成和進展過程。新的抗上述靶點的治療藥物(如貝伐單抗)已在臨床試驗中深度研究。最近FDA已批準了貝伐單抗用于復發膠質瘤的治療。高爾基磷酸化蛋白3 (G0LPH3),也稱為GPP34/GMx33/MIDAS，是一種具有34kDa分子重量的高度保守的蛋白質。它被發現橫穿在從酵母菌到人類的全部真核生物系中。這個蛋白質位于反面高爾基網，由人類染色體5pl3的一個基因編碼。G0LPH3參與了蛋白質的運輸、受體的循環和從高爾基體到質粒膜的糖基化過程。最新的研究發現G0LPH3可以促進細胞性狀轉化和腫瘤生長。尤其是，G0LPH3在多種實體腫瘤中都高表達，包括黑色素瘤、結腸腺癌和非小細胞肺癌。G0LPH3提高了人類癌細胞中雷帕霉素(mTOR)信號對哺乳動物的靶向性，并調節了分子對mTOR抑制劑的反應。mTOR，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是雷帕霉素的靶向，作為蛋白質合成和細胞生長的初級調控者，是受體酪氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶通路(RTK-P13K)的關鍵整合分子，而RTK-PI3K通路則是GBM超激活通路中最常見的一條。在一項對76例膠質瘤患者的研究中，Li等人發現在高級別膠質瘤中G0LPH3表達更高。理解G0LPH3是如何失調的以及異常表達的G0LPH3對GBM的腫瘤發生和藥物反應有何作用可有助于發現新的預后標記物和新的介入治療途徑。組織芯片(TMA)技術的發展，得益于生物芯片技術等的延伸。TMA具有高通量、快速、低誤差、用途廣泛等特點，目前主要應用在腫瘤病理學、實驗室檢測、藥物研究等。利用組織芯片技術可以在細胞水平定位和蛋白水平檢測相應靶標，從而實現基因及其表達產物與組織形態學研究以及臨床數據相結合，同時還可以與原位雜交技術等相結合，因此TMA被廣泛應用在腫瘤病理研究中，例如EMSY通路在乳癌及卵巢癌中的關系，AlphaB-Crystallin與乳癌的關系，TMPRSS2和ETS轉移因子在前列腺癌的重要作用等。TMA常見類型有演化TM、預后TMA等。演化TMA指將某一腫瘤疾病發展的各個階段的標本(諸如原發間變和繼發膠母、原發膠母和復發膠母等)集中在一塊TMA中，能在一張切片上同時看到腫瘤組織在原位、轉移、復發等不同進展階段的變化情況，可用以檢測特定腫瘤在不同發展階段的分子病理改變，有助于對腫瘤發生、發展及浸潤轉移等過程的研究。預后TMA是將帶有可利用的臨床隨訪數據的腫瘤標本集中在一張TMA中。使用預后TMA可以研究已知的分子靶標的改變或信號傳導通路的變化對腫瘤患者預后的影響[2]。TMA陣列中每個組織片段都對應于相應患者，因此利用TMA，結合臨床數據和隨訪資料，可以對腫瘤患者進行大規模的回顧性數據分析，為疾病的早期診斷、早期治療等提供指導。文獻報道利用預后TMA發現Cyclooxygenase-2對鼻咽癌患者放療預后有預測價值。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達的方法，該方法使得檢測G0LPH3的表達的靈敏性大大提高，能保證在極少的標本中獲得足夠的信息；檢測G0LPH3的表達具有重要的醫學價值。本發明的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達的方法，包括:(I)首先構建人膠質瘤細胞的組織芯片，然后進行免疫組化染色；(2)培養人膠質瘤細胞； (3)在G0LPH3的cDNA序列中采用下列兩條候選序列對G0LPH3進行siRNA的敲減:5， -CAGCGCCTCATCAAGAAA-3，和 5， -GCCAACACCAATGAGGTT-3，；(4)使用Trizol試劑進行總細胞RNA的分離，采用工具箱合成第一股cDNA鏈，進行實時PCR擴增；(5)檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達并分析數據。步驟(3)中設計了一個shRNA序列，同時包含siRNA序列的正鏈和反鏈，采用一個環形序列來分離互補域。步驟(4)中所述的工具箱為ReverTra Ace qPCR RT工具箱。步驟(4)中所述的擴增為在ABI PRISM7900HT序列監測系統中進行。步驟(4)中所述的擴增條件為先在95°下進行3分鐘，隨后95°下10秒、55°下45秒重復循環40次。在本發明中，我們使用免疫組化方案和組織芯片分析檢測了 97例原發GBM患者腫瘤中G0LPH3的表達量，并研究了 G0LPH3表達量對腫瘤預后的預測價值。G0LPH3對腫瘤生長的潛在作用則通過體外分離群進行siRNA實驗來檢測。最近的研究顯示G0LPH3在多種類型的腫瘤中有致癌基因的作用。另外，還發現人膠質瘤中G0LPH3基因的表達水平與膠質瘤的病理級別密切相關，如膠質母細胞瘤中G0LPH3的表達水平最高。本發明最近利用基因芯片在8個高級別膠質瘤，12個低級別膠質瘤及一個正常腦組織樣本中做了一些初步試驗，結果顯示高級別膠質瘤中更高水平的G0LPH3表達。這項結果的發現提示我們推測可以用G0LPH3作為GBM預后標志物的可能。目前的研究中41.2%的病人G0LPH3表達水平較高，58.8%的病人表達水平相對較低。G0LPH3的表達與病人總生存期及無進展生存期相關聯，低水平表達G0LPH3的病人具有更長的總生存期或無進展生存期。Cox回歸分析指出G0LPH3對于總生存期及無進展生存期是作為一個獨立的影響因子。目前的相關結果提示高水平表達的G0LPH3是較差預后的一個預測標
O新的研究證據顯示蛋白質的糖基化在癌癥中起到重要作用，蛋白質糖基化的改變是許多癌癥的一個重要特征。G0LPH3是在細胞內的反面高爾基網和內涵體結構之間運動，參與了許多細胞重要的生理過程，如物質運輸，受體循環及蛋白糖基化。G0LPH3的過表達可以改變生長因子受體的內化及翻轉，可以改變蛋白的糖基化。同樣值得注意的是糖基化也介導了受體分選，配體結合及細胞內吞。因此，有理由推測G0LPH3過表達可以調節多個細胞信號通路，尤其是蛋白糖基化通路，最后導致腫瘤的發展。根據這個理論，我們的研究表明高水平G0LPH3表達與GBM病人較差的預后相關。在體外培養的GBM細胞實驗顯示RNA干擾技術下調G0LPH3的表達可以抑制腫瘤的增殖及克隆性生長。在人癌細胞中通過增強mTOR信號可以使G0LPH3產生致瘤作用；G0LPH3的過表達也提高了兩種通過糖基化的mTOR相關復合物的蛋白水平。mTOR即作為一個下游啟動子，也作為RTK-PI3K途徑的上游調節子。據報道88%GBM的RTK-PI3K途徑具有實質性改變，突出了其在GBM中的重要性。G0LPH3還與VPS35相互作用，VPS35是一種retromer復合物，可以管控蛋白質的逆向運輸，可以改變作用在mTOR信號通路上雷帕霉素的敏感性。G0LPH3的表達水平及基因的復制數量可以作為mTOR信號通路敏感性的指示劑。G0LPH3高水平的表達相關于此通路對雷帕霉素的高度敏感。這種G0LPH3與VPS35的相互作用可能還可以管控fct信號通路，Wnt通路在腫瘤的發展中起到關鍵作用。幾種mTOR通路的抑制劑如西羅莫司、替西羅莫司和依維莫司等，正在進行GBM病人的臨床評估。盡管目前有關的機理尚 未闡明，實驗數據同樣缺乏，考慮到G0LPH3在蛋白糖基化通路及mTOR通路中的重要作用，我們可以假設G0LPH3很有可能通過mTOR途徑促進GBM的瘤形成，我們有理由推測藥物特異性靶向G0LPH3，尤其是GBM中過表達的G0LPH3，可以在GBM病人中取得良好效益。總的來說，我們證明了 G0LPH3高水平表達與GBM病人不好的預后相關。這些實驗發現同樣提示了 G0LPH3可以作為GBM病人預后的一個分子標志物。且在體外培養的GBM細胞實驗顯示RNA干擾技術下調G0LPH3的表達可以抑制腫瘤的增殖及克隆性生長。有益.效果(I)本發明通過小干擾RNA下調G0LPH3后在體外抑制了膠質母細胞的生長，通過RNAi下調G0LPH3后導致細胞周期停滯于Gl期；(2)本發明通過RNA干擾技術下調G0LPH3的表達可以抑制腫瘤的增殖及克隆性生長，為抗多形性膠質母細胞瘤藥物的研究開拓了新途徑；(3)本發明使得檢測G0LPH3的表達的靈敏性大大提高，能保證在極少的標本中獲得足夠的信息；檢測G0LPH3的表達具有重要的醫學價值。
圖1為OS (a)和PFS (b)的Kaplan-Meier生存曲線。以腫瘤中G0LPH3表達量分層后的0S(c)和PFS(d)的Kaplan-Meier生存曲線。圖2為將G0LPH3敲減和過表達后在mRNA和蛋白水平上的效果。U87和U251細胞分別被建立在慢病毒基礎上的小干擾RNA(shG0LPH3-l和shG0LPH3_2)或空質粒(作為陰性對照，PSCN為shG0LPH3的對照，FUGW為G0LPH3過表達的對照)或過表達G0LPH3的病毒載體(OE)轉染，48小時后用實時RT-PCR檢測G0LPH3在mRNA轉錄產物的水平(a為U87，c為U251細胞)，并用免疫印跡法檢測蛋白量(b為U87，d為U251細胞)。數據以平均值土標準差的形式顯示。所有實驗均單獨重復3次以上。*相對空質粒P < 0.05。圖3為G0LPH3敲減后對細胞增殖和克隆形成的影響。a, b U251細胞中CCK-8試驗和克隆形成。c，d U87細胞中CCK-8試驗和克隆形成。數據以平均值土標準差的形式顯示。所有實驗均單獨重復3次以上。*相對PSCN P < 0.05 (shG0LPH3的空質粒對照)。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1( 1)組織樣本這項研究的方案和組織樣本的獲取是經過第二軍醫大學生物醫學研究倫理委員會批準的。人體組織的獲取和使用完全遵照中國國家臨床樣本使用規范。GBM組織樣本來源于之前已收集的病人組織樣本，這些樣本是從2000年I月至2010年12月間在上海長征醫院神經外科住院接受外科手術治療的膠質瘤患者身上獲得。術前已接受化療和放療的患者不納入分析。GBM的診斷由兩位富有經驗的病理學家獨立診斷確認。( 2)組織芯片和免疫組化高通量腦膠質瘤組織芯片的制備:一、實驗材料(一 )組織標本實驗所用的組織標本選取上海長征醫院2002-2010年之間手術切除、經病理證實為腦膠質瘤的組織300例，正常腦組織16例(由外傷減壓性手術中獲得)，上述均經過第二軍醫大學倫理委員會許可和患者及其家屬同意。所有病理診斷及分級均由兩位病理醫生按照2007年WHO分級標準獨立閱片確定。( 二)主要儀器設備
權利要求
1.一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達的方法，包括: (O首先構建人膠質瘤細胞的組織芯片，然后進行免疫組化染色； (2)培養人膠質瘤細胞； (3)在G0LPH3的cDNA序列中采用下列兩條候選序列對G0LPH3進行siRNA的敲減:5，-CAGCGCCTCATCAAGAAA-3，和 5，-GCCAACACCAATGAGGTT-3，； (4)使用Trizol試劑進行總細胞RNA的分離，采用工具箱合成第一股cDNA鏈，進行實時PCR擴增； (5)檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達并分析數據。
2.根據權利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達的方法，其特征在于:步驟(3)中設計了一個shRNA序列，同時包含siRNA序列的正鏈和反鏈，采用一個環形序列來分離互補域。
3.根據權利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的工具箱為ReverTra Ace qPCR RT工具箱。
4.根據權利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的擴增為在ABI PRISM7900HT序列監測系統中進行。
5.根據權利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質瘤中的表達的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的擴增條件為先在95°下進行3分鐘，隨后95°下10秒、55°下45秒重復 循 環40次。
全文摘要
本發明涉及一種利用高通量組織芯片檢測GOLPH3在腦膠質瘤中的表達的方法，包括(1)首先構建人膠質瘤細胞的組織芯片，然后進行免疫組化染色；(2)培養人膠質瘤細胞；(3)在GOLPH3的cDNA序列中采用兩條候選序列對GOLPH3進行siRNA的敲減；(4)使用Trizol試劑進行總細胞RNA的分離，采用工具箱合成第一股cDNA鏈，進行實時PCR擴增；(5)檢測GOLPH3在腦膠質瘤中的表達并分析數據。本發明的方法使得檢測GOLPH3的表達的靈敏性大大提高，能保證在極少的標本中獲得足夠的信息；檢測GOLPH3的表達具有重要的醫學價值。
文檔編號C12Q1/68GK103103263SQ20131001330
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月14日 優先權日2013年1月14日
發明者陳菊祥, 周勁旭, 徐濤, 盧亦成, 嚴勇, 秦榮, 王洪祥 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學