專利名稱：一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量pcr方法
技術領域：
本發明涉及一種甘蔗病原菌的檢測方法，具體涉及一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
甘鹿褐銹病(Sugarcane brown rust disease)是由屬于黑頂柄銹菌的甘鹿褐銹病菌iPuccinia引起的一種真菌性病害。該病主要由夏孢子傳播,借風力附著在蔗葉表面，經氣孔侵入，從而危害甘蔗葉片，造成蔗莖產量損失和蔗糖分的降低。初次侵染源主要來自甘蔗本身或其他中間寄主。栽種抗褐銹病甘蔗品種，是控制甘蔗褐銹病的最為經濟有效的措施。甘蔗褐銹病菌的檢測及其效率和準確性直接影響甘蔗抗褐銹病育種的進程和效果。迄今，已經有三種方法被證明可用于檢測待檢測甘蔗品種中是否含有褐銹病菌第一種是分離培養技術，在建立純培養物的基礎上，根據培養物所產生孢子的形態特征進行鑒定；第二種是根據田間種植后病害表型癥狀鑒定；第三種是常規PCR檢測技術。以上三種方法中，分離培養技術耗時長，容易受雜菌污染，檢出效率不高；田間種植鑒定方法受甘蔗、病原菌和環境條件互作的影響，不僅耗時長，還存在鑒定結果不夠穩定，波動較大的問題；常規PCR檢測技術靈敏度不夠高，且無法實時監測PCR過程。實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過樣品到達域值水平所經歷的循環數(Ct值)對未知模板進行定量分析的方法。與常規PCR檢測技術相比，實時熒光定量PCR檢測技術，靈敏度高，特異性好，樣品消耗少，僅需1-10 ng的總RNA或基因組DNA，還能實時直觀地監測P CR擴增過程。綜上，目前已有的三種甘蔗褐銹病菌檢測技術，均有待進一步改進和完善，急需建立一種簡便、快速、準確和靈敏度高的檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測。本發明的一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括基因組DNA的提取、實時熒光定量PCR檢測體系建立、實驗有效性判定以及實時熒光定量PCR檢測，其特征在于1、實時熒光定量PCR檢測體系的建立實時熒光定量PCR擴增體系為總體積25 μ 1，內含 12. 5 μ L 2 X TaqMan Universal Master Mix, 10 μ mol/L 的檢測引物 qPCR-F和 qPCR-R各 O. 75 μ L,0. 4 μ L 10 μ mol/L 探針，5-10 ng基因組 DNA，ddH20補足到 25 μ I ； PCR擴增程序如下50 V 2 min,94 V 10 min ；90 V 15 s，60 V I min，40個循環，在60 °〇進行單點熒光檢測；所述檢測引物和探針如下qPCR-F :5’- TAACAATGGATCTCTAGGC _3’，qPCR-R :5’- GCCACTTATACCTGATTAC -3/，
探針5’_ FAM-CCCCATTTTAAACA-TAMRA -3/。2、實驗有效性判定
同時具備a、b、c三個條件的實驗為有效實驗，否則為無效實驗；所述a、b、c三個條件如下a、空白對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；b、陰性對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；c、陽性對照的Ct值<30.0，并出現典型的擴增曲線；所述典型的擴增曲線如圖1所示，為S型動力學曲線；閾值線為以陰性對照樣品擴增曲線的最高點為基準，與橫坐標平行的一條直線；閾值線和典型的擴增曲線的交點所對應的定量PCR擴增循環數為Ct值；陽性對照為已知含甘蔗褐銹病菌的樣品；陰性對照為已知不含甘蔗褐銹病菌的樣品；空白對照指用等體積的無菌ddH20代替模板DNA ；
3、實時熒光定量PCR檢測
實時熒光定量PCR檢測中，樣品檢測結果如下
A、無Ct值且無典型的擴增曲線，表示樣品中不含甘蔗褐銹病菌；
B、Ct值<35.0，且出現典型的擴增曲線，表示樣品中含甘蔗褐銹病菌；
C、當Ct值>35. O,則該樣品做重復實驗；重復實驗結果無Ct值，則該樣品中不含甘蔗褐銹病菌；若重復實驗結果有Ct值且有典型的擴增曲線，則該樣品中含甘蔗褐銹病菌。本發明的應用效果
本發明的一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，具有靈敏度高，特異性好，所需要的DNA用量少的特點；與常規的根據病菌培養后的孢子形態特征鑒定、根據田間種植后病害表型癥狀鑒定以 及常規PCR檢測技術相比，具有靈敏度高，特異性好，樣品消耗少，還能實時直觀地監測P CR擴增過程等優點。本發明為甘蔗褐銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度、特異性強的快速檢測體系，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測，對我國抗褐銹病甘蔗育種和抗褐銹病甘蔗種質資源的保護具有重要的意義。
圖1為甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR檢測示意圖。其中，I代表直角坐標系，
2代表閾值線，3代表閾值線2與典型的擴增曲線4的交點所對應的定量PCR擴增循環數，即Ct值，4代表典型的擴增曲線，5代表陰性對照樣品擴增曲線，K代表陰性對照樣品擴增曲線的最高點，橫坐標X值代表定量PCR擴增循環數，縱坐標Y值代表定量PCR擴增過程中所檢測到的熒光值。
具體實施例方式為了進一步闡明本發明而不是限制本發明，以下結合實施例加以說明。實施例1 一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法 一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括以下步驟1、基因組DNA的提取
(I)在待檢測的甘蔗品種E、F、M、N中各取5g葉片組織，置研缽，加入液氮磨碎成粉末，并在解凍前轉入50 ml的離心管中；(2)加入15ml,65 °C預熱的SDS提取液，混勻后在65 1水浴保溫40 min ；
(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混勻后，冰浴 30 min ；
(4)25000 g，4 °C離心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1預冷的異丙醇；
(5)-20°C放置30 min后，鉤出漂浮在液面的DNA，置于一干凈的1. 5 ml離心管中，晾干后加入750 μ I TE溶液；加等體積的平衡飽和酚，搖勻，12000 g，4 °C離心，10 min ；
(6)轉移上清至另一干凈的1.5 ml離心管中，加等體積的氯仿，12000 g，4 °C，離心10min后移出上層水相；
(7)在水相中加2倍體積的無水乙醇，12000g，4 °C離心10 min，留沉淀，用體積濃度為70 %的乙醇清洗2次，并晾干；
(8)加滅菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 °C冰箱中保存備用。2、實時熒光定量PCR檢測體系的建立
實時熒光定量PCR擴增體系為總體積25 μ I,內含12. 5 μ L 2XTaqMan UniversalMaster Mix, 10 μ mol/L 的檢測引物 qPCR-F 和 qPCR-R 各 0· 75 μ L,0. 4 μ L 10 μ mol/L探針，5-10 ng待檢測甘蔗品種基因組DNA, ddH20補足到25 μ L·`
PCR 擴增程序如下50 0C 2 min, 94 °C 10 min ；90 °C 15 s，60 °C I min，40 個
循環，在60 °C進行單點熒光檢測。
所述檢測引物qPCR-F和qPCR-R，是采用ITS-PCR技術，經過大量的篩選試驗，獲得了甘蔗褐銹病菌的特異DNA片段，以此片段的DNA序列為基礎，設計甘蔗褐銹病菌的檢測引物。所述檢測引物和探針如下 qPCR-F :5’- TAACAATGGATCTCTAGGC _3’， qPCR-R :5’- GCCACTTATACCTGATTAC -3'，
探針5’_ FAM-CCCCATTTTAAACA-TAMRA -3/。3、實驗有效性的判定
本實驗中，用已知含甘蔗褐銹病菌的樣品作陽性對照，已知不含甘蔗褐銹病菌的樣品作陰性對照，同時以等體積的無菌ddH20代替模板DNA作空白對照。對照實驗結果中，空白對照無Ct值且無典型的擴增曲線、陰性對照無Ct值且無典型的擴增曲線，而陽性對照的Ct值為28，小于30.0，并出現典型的擴增曲線，因此，本次實驗的結果符合實驗有效性的三個條件，實驗是有效的。4、實時熒光定量PCR檢測
如圖1所示，實時熒光定量PCR檢測中設定的閾值線以陰性對照樣品擴增曲線的最高點K為基準，與橫坐標X平行。針對甘蔗品種E、F、M、N制作的樣品，根據擴增曲線和Ct值判定實時熒光定量PCR檢測結果如表I所示
表I實時熒光定量PCR檢測結果
權利要求
1. 一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括基因組DNA提取、實時熒光定量PCR檢測體系建立、實驗有效性判定，以及實時熒光定量PCR檢測，其特征在于 (1)實時熒光定量PCR檢測體系的建立實時熒光定量PCR擴增體系總體積為25μ 1，內含 12. 5 μ L 2 X TaqMan Universal Master Mix, 10 μ mol/L 的檢測引物 qPCR-F 和qPCR-1^0.75 μ L,0. 4 μ L 10 μ mol/L探針，5-10 ng 基因組 DNA，ddH20補足到 25 μ I ；PCR 擴增程序如下50 °C 2 min，94 °C 10 min ；90 °C 15 s，`60 °C I min，40 個循環，在`60 °C進行單點熒光檢測；所述檢測引物和探針如下qPCR-F :5’- TAACAATGGATCTCTAGGC _3’，qPCR-R :5’- GCCACTTATACCTGATTAC -3'； 探針5’_ FAM-CCCCATTTTAAACA-TAMRA -3'； (2)實驗有效性判定 同時具備a、b、c三個條件的實驗為有效實驗，否則為無效實驗；所述a、b、c三個條件如下a、空白對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；b、陰性對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；c、陽性對照的Ct值< 30.0，并出現典型的擴增曲線；所述典型的擴增曲線為S型動力學曲線；閾值線為以陰性對照樣品擴增曲線的最高點為基準，與橫坐標平行的一條直線；閾值線和典型的擴增曲線的交點所對應的定量PCR擴增循環數為Ct值；陽性對照為已知含甘蔗褐銹病菌的樣品；陰性對照為已知不含甘蔗褐銹病菌的樣品；空白對照指用等體積的無菌ddH20代替模板DNA ； (3)實時熒光定量PCR檢測 實時熒光定量PCR檢測中，樣品檢測結果如下 A、無Ct值且無典型的擴增曲線，表示樣品中不含甘蔗褐銹病菌； B、Ct值<35.0，且出現典型的擴增曲線，表示樣品中含甘蔗褐銹病菌； C、當Ct值>35. 0，則該樣品做重復實驗；重復實驗結果無Ct值則該樣品中不含甘蔗褐銹病菌；若重復實驗結果有Ct值且有典型的擴增曲線，則該樣品中含甘蔗褐銹病菌。
全文摘要
本發明涉及一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括基因組DNA的提取、實時熒光定量PCR檢測體系建立、實驗有效性判定，以及實時熒光定量PCR檢測。本發明的一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，具有靈敏度高，特異性好，所需要的DNA用量少的特點；與常規的根據病菌培養后的孢子形態特征鑒定、根據田間種植后病害表型癥狀鑒定，以及常規PCR檢測技術相比，具有靈敏度高，特異性好，樣品消耗少，還能實時直觀地監測PCR擴增過程等優點。為甘蔗褐銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度、特異性強的快速檢測體系，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測，對抗褐銹病甘蔗育種和抗褐銹病甘蔗種質資源的保護具有重要的意義。
文檔編號C12R1/645GK103060457SQ201310015760
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月16日 優先權日2013年1月16日
發明者闕友雄, 郭晉隆, 許莉萍, 張玉葉, 羅俊, 徐景升, 黃寧, 陳如凱 申請人:福建農林大學