多價淋巴毒素β受體激動劑及其治療用途的制作方法

專利名稱：多價淋巴毒素β受體激動劑及其治療用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫學和癌癥診斷與治療領域。更特別地，它涉及多價淋巴毒素β受體(LT-β-R)激動劑抗體構建體的制備以及在治療方法中與化療劑相組合的用途。
背景淋巴毒素β受體(LT-β-R)是腫瘤壞死因子家族的成員，它在免疫系統的發展以及免疫系統內很多細胞(包括濾泡樹突細胞和很多基質細胞類型)的功能性維持中都具有公認的作用(Matsumoto等，1996Immunol.Rev.156137)。LT-β-R的已知配體包括LTα1/β2和被稱作LIGHT的第二配體(Mauri等，1998 Immunity 821)。已經發現可溶配體或激動性抗受體單克隆抗體對LT-β-R的活化會誘導某些癌的死亡(Browning，J.L.等(1996)J.Exp.Med.183867-878和美國專利6,312,691)。
本發明提供了多價LT-β-R激動劑及其治療用途。
發明概述在一個方面，本發明提供了作為人淋巴毒素β受體(LT-β-R)激動劑的多價抗體構建體。在一個實施方案中，多價抗體構建體包含LT-β-R表位特異性的至少一個抗原識別位點。在某些實施方案中，至少一個抗原識別位點位于scFv結構域，而在其它實施方案中，所有抗原識別位點都位于scFv結構域。
本發明提供了包含淋巴毒素β受體(LT-β-R)表位特異性的至少一個抗原識別位點的多價抗體。在一個實施方案中，至少一個抗原識別位點位于scFv結構域內。在另一個實施方案中，所有抗原識別位點都位于scFv結構域內。在又一個實施方案中，該抗體構建體是單特異性的，包括例如CBE11結合的表位。在又一個實施方案中，本發明的多價抗體是四價的。仍在另一個實施方案中，該抗體構建體是BHA10表位特異性的。仍在另一個實施方案中，該抗體構建體是雙特異性的。在一個實施方案中，該抗體構建體具有兩個CBE11特異性抗原識別位點和兩個BHA10特異性識別位點。
抗體構建體可以是二價的、三價的、四價的或五價的。在某些實施方案中，該抗體構建體是單特異性的。在一個實施方案中，該抗體構建體是CBE11結合的表位特異性的，并且在一些實施方案中，它是四價的。在另一個實施方案中，該抗體構建體是BHA10結合的表位特異性的，并且在一些實施方案中，它是四價的。在某些實施方案中，至少一個抗原識別位點位于scFv結構域內。在某些實施方案中，所有抗原識別位點都位于scFv結構域內。其它抗體構建體可以是人LT-β受體上不同表位多特異性的。在某些實施方案中，該抗體構建體是雙特異性的。在其它實施方案中，該抗體構建體對BKA11、CDH10、BCG6、AGH1、BDA8、CBE11和BHA10組成的淋巴毒素β受體(LT-β-R)表位組中的至少兩個成員是特異性的。在一個實施方案中，該抗體構建體是CBE11和BHA10結合的表位特異性的，并且在某些實施方案中，它是四價的。在一個實施方案中，該抗體構建體具有兩個CBE11特異性抗原識別位點和兩個BHA10特異性識別位點。在任何多特異性抗體構建體中，至少一個抗原識別位點可以位于scFv結構域，并且在某些實施方案中，所有抗原識別位點都位于scFv結構域。
本發明進一步提供了包含SEQ ID NOs1-10的抗體構建體，以及編碼它們的核酸和載體，包含該核酸和載體的宿主細胞。
在另一個方面，本發明提供了包含該主題抗體構建體和藥物可接受載體的藥物組合物。在某些實施方案中，該藥物組合物可以進一步包含有效量的化療劑，其中所述組合物給受試者的施用導致腫瘤的超累加抑制。在另一個方面，本發明提供了含有或能夠裝載有效量的主題多價抗體構建體和藥物可接受載體的藥物遞送裝置。在某些實施方案中，該藥物遞送裝置進一步含有或能夠裝載有效量的化療劑，其中用所述裝置施用該構建體和該試劑會導致腫瘤的超累加抑制。
在另一個方面，本發明提供了治療受試者癌癥的方法，包括給該受試者施用有效量的主題抗體構建體。在某些實施方案中，該受試者是人。本發明還提供了抑制受試者的腫瘤體積的方法，包括給該受試者施用有效量的主題抗體構建體的步驟。在某些實施方案中，抑制腫瘤體積的方法包括給該受試者施用有效量的主題抗體構建體和化療劑，其中所述構建體和所述試劑的施用會導致腫瘤的超累加抑制。
本發明進一步提供了包括主題藥物組合物或藥物遞送裝置，和任選它們的使用說明書的試劑盒。這種試劑盒的用途包括例如治療應用。在某些實施方案中，任何試劑盒中含有的主題組合物已經被凍干并且使用前需要再水化。
在一個實施方案中，包含本發明多價抗體的藥物組合物進一步包含有效量的化療劑，其中所述組合物的施用導致腫瘤的超累加抑制。本發明還描述了包含有效量的本發明多價抗體構建體和藥物可接受載體的藥物組合物。在一個實施方案中，該藥物組合物進一步包含有效量的化療劑，其中所述組合物的施用導致腫瘤的超累加抑制。
本發明包括含有或能夠裝載有效量的本發明多價抗體構建體以及藥物可接受載體的藥物遞送裝置。在一個實施方案中，該藥物遞送裝置進一步含有或能夠裝載有效量的化療劑，其中用所述裝置施用所述構建體和所述試劑會導致腫瘤的超累加抑制。
本發明還包括治療受試者癌癥的試劑盒，其中含有包含本發明多價抗體的組合物。在一個實施方案中，該試劑盒還包括說明書。在另一個實施方案中，該試劑盒包含化療劑。
本發明還描述了抑制受試者的腫瘤體積的方法，包括給所述受試者施用有效量的本發明多價抗體構建體的步驟。
由下列詳細說明書和權利要求，本發明的其它特征和優點將很明顯。
附圖簡述

圖1A和1B分別顯示了huCBE11/huBHA10雙特異性-1抗體構建體的成熟重鏈的多核苷酸(SEQ ID NO1)和推導的多肽序列(SEQ IDNO2)。
圖2顯示了huCBE11/huBHA10雙特異性-1抗體構建體的成熟輕鏈的多核苷酸(SEQ ID NO3)和推導的多肽序列(SEQ ID NO4)。
圖3A和3B分別顯示了成熟huCBE11/huBHA10雙特異性-2抗體構建體的多核苷酸(SEQ ID NO5)和推導的多肽序列(SEQ ID NO6)。
圖4A和4B分別顯示了huCBE11單特異性-1抗體構建體的成熟重鏈的多核苷酸(SEQ ID NO7)和推導的多肽序列(SEQ ID NO8)。
圖5A和5B分別顯示了成熟huCBE11單特異性-2抗體構建體的多核苷酸(SEQ ID NO9)和推導的多肽序列(SEQ ID NO10)。
圖6A和6B顯示了雙特異性抗體構建體的三級結構示意圖，可變區用適當陰影區表示。圖6A顯示了雙特異性-1和雙特異性-2抗體的結構，其包含CBE11和BHA10抗原識別位點。圖6B顯示了包含CBE11抗原識別位點的單特異性-1和單特異性-2四價抗體的結構。
圖7描繪了可以使用本發明方法制備的其它抗體構建體的三級結構示意圖。
圖8描繪了圖，該圖顯示了HT29細胞的增殖作用對八種激動劑抗LT-β-R抗體的抗體濃度的函數，所述抗體包括huCBE11/huBHA10雙特異性-1和雙特異性-2抗體構建體(分別為實心圓形和實心正方形)、單特異性-1和單特異性-2抗體構建體(分別為實心三角形和實心菱形)、人源化抗體huCBE11(開放三角形)、人源化抗體huBHA10(開放正方形)、聯合施用的人源化抗體huCBE11和huBHA10(開放菱形)和五聚化chuCBE11抗體(開放圓形)。
圖9描繪了圖，該圖顯示了WiDr人結腸腺癌腫瘤對雙特異性-1的反應，通過測定在雙特異性-1(三角形、開放正方形、開放和閉合的圓形)、載體(PBS對照、十字形)和紫杉酚(閉合正方形)以所示劑量植入后不同天數觀察的腫瘤重量進行評估。箭頭示出了每種劑量的第一次和最后一次給藥。
圖10用來自多個腫瘤抑制實驗的數據描述了huCBE11和雙特異性-1活性的回顧性比較。數據是基于腫瘤生長的抑制百分比而計算的，該百分比是在每一實驗的第34或35天，使用下式(100-(100x(測試組平均數/安慰劑對照組平均數)))計算的。圖上的每一數據點代表來自研究的一個實驗測試組。
圖11A和11B顯示了包含五聚形式CBE11抗體的序列。圖11A描述了成熟五聚嵌合CBE11重鏈的多核苷酸(SEQ ID NO17)和推導的多肽序列(SEQ ID NO18)。圖11B描述了成熟嵌合CBE11輕鏈的多核苷酸(SEQ ID NO19)和推導的多肽序列(SEQ ID NO20)。
發明詳述1.定義為了方便，在進一步描述本發明之前，在這里定義說明書、實施例和所附權利要求書中使用的某些術語。
單數形式包括所指項目的復數形式，上下文清楚地指出者除外。
術語“施用”包括將本發明化合物，包括但不限于藥物組合物或治療劑遞送給受試者的系統或者受試者內或受試者上的特定部位的任何方法。這里使用的短語“全身施用”、“外周施用”意思是化合物、藥物或其它物質不是直接施用到中樞神經系統，這樣使得它進入患者的系統，從而經受新陳代謝及其它類似過程，例如皮下施用。“腸胃外施用”是指除了腸內和局部施用的施用方式，通常通過注射，包括但不限于靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、被膜下、蛛網腹下、脊柱內和胸骨內注射和輸注。
這里使用的術語“抗體”意思是指完全的、完整的抗體，和Fab、Fab’、F(ab)2、Fv及其其它片段。完全的、完整的抗體包括例如單克隆抗體，如鼠單克隆抗體、嵌合抗體、抗個體基因型抗體、抗抗個體基因型抗體、和人源化抗體，以及其多價形式。術語“免疫球蛋白”或“抗體”(這里可互換使用)是指具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四條多肽鏈基礎結構的抗原結合蛋白，所述鏈例如通過鏈間二硫鍵穩定，該抗原結合蛋白具有特異性結合抗原的能力。重鏈和輕鏈都折疊成結構域。術語“結構域”是指包含例如通過β-折疊片和/或鏈內二硫鍵穩定的肽環(如包含3至4個肽環)的重鏈或輕鏈多肽的球形區。基于在“恒定區”結構域的情況下各種類型成員結構域內相對缺少序列變異，或在“可變區”結構域的情況下各種類型成員結構域內的顯著變異，結構域這里進一步稱作“恒定區”或“可變區”。輕鏈上的“恒定區”結構域可互換地稱作“輕鏈恒定區”、“輕鏈恒定結構域”，“CL”區或“CL”結構域。重鏈上的“可變區”結構域可互換地稱作“重鏈恒定區”、“重鏈恒定結構域”，“CH”區或“CH”結構域。輕鏈上的“可變區”結構域可互換地稱作“輕鏈可變區”、“輕鏈可變結構域”，“VL”區或“VL”結構域。重鏈上的“可變區”結構域可互換地稱作“重鏈恒定區”、“重鏈恒定結構域”，“CH”區或“CH”結構域。
術語“區”是指抗體鏈的一部分，包括如這里定義的恒定或可變區，以及所述結構域的更離散部分。例如，輕鏈可變結構域或區包括散布于“構架區”或“FRs”之間的“互補決定區”或“CDRs”，如這里定義。
免疫球蛋白或抗體可以以單體或多聚形式存在。術語“抗原結合片段”是指免疫球蛋白或抗體的多肽片段結合抗原或與完整抗體(即與它們所來源的完整抗體)競爭抗原結合(即特異性結合)。術語“構象”是指蛋白或多肽(如抗體、抗體鏈、或其結構域或區)的三級結構。例如，短語“輕(或重)鏈構象”是指輕(或重)鏈可變區的三級結構，短語“抗體構象”或“抗體片段構象”是指抗體或其片段的三級結構。
結合片段通過重組DNA技術，或通過酶促或化學切割完整免疫球蛋白而產生。結合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv、單鏈，和單鏈抗體。不同于“雙特異性”或“雙功能”免疫球蛋白或抗體，免疫球蛋白或抗體被理解為它們的每個結合位點是相同的。“雙特異性”或“雙功能抗體”是具有兩條不同重/輕鏈對和兩個不同結合位點的人工雜合抗體。可以用各種方法制備雙特異性抗體，包括雜交瘤的融合或Fab′片段的連接。參見如Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)；Kostelny等J.Immunol.148，1547-1553(1992)。
術語“抗體構建體”是指一種重組分子，其中包含來自抗體的重鏈和輕鏈可變結構域的兩個或更多抗原結合片段，并可以包含來自五類Ig(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)中任何一種抗體的恒定區的全部或部分。例如，抗體構建體可以由重鏈C末端包含單鏈可變片段的抗體制成。在另一個實例中，抗體構建體可以由抗體兩條重鏈的恒定區的全部或部分組成，該重鏈的羧基和氨基末端包含單鏈可變片段。圖6用示意圖描述了這些構建體中每一個的實例。在又一個實例中，抗體構建體可以包含具有兩個或更多可變區的兩條重鏈和具有一個或多個可變區的兩條輕鏈，其中兩條重鏈通過二硫鍵或其它共價鍵連接。在另一個實例中，抗體構建體可以包含含有兩個或更多可變區的兩條重鏈，其中兩條重鏈通過二硫鍵或其它共價鍵連接。圖7用示意圖描述了這些構建體中每一個的實例。本發明的詳細說明書和實施例中描述了本發明抗體構建體的其它實例。
這里使用的術語“抗原”意思是與特異性抗體有反應性的分子。
術語“抗原結合位點”或“抗原識別位點”是指特異性結合抗原上表位的抗體區域。
術語“癌癥”或“瘤”通常是指任何惡性瘤或者自發的細胞生長或增生。本文中該術語包括充分發育的惡性瘤，以及惡變前損害。具有“癌癥”的受試者例如可以具有腫瘤或白細胞增生如白血病。在某些實施方案中，具有癌癥的受試者是具有腫瘤如實體瘤的受試者。癌癥包括實體瘤，包括但不限于非小細胞肺癌(NSCLC)、睪丸癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、胰腺癌、結腸直腸癌(CRC)、乳腺癌，以及前列腺、胃、皮膚、胃、食管和膀胱癌。
術語“化療劑”是指用于治療由外來細胞或惡性細胞(如腫瘤細胞)引起的疾病的任何小分子或組合物。化療劑的非限制性實例包括破壞DNA合成的藥劑、作為拓撲異構酶I抑制劑的藥劑、烷化劑或植物堿。術語“破壞DNA合成的藥劑”是指能夠減少或抑制DNA合成過程的任何分子或化合物。破壞DNA合成的藥劑實例包括但不限于核苷類似物如嘧啶或嘌呤類似物，包括例如但不限于吉西他濱或蒽環霉素化合物，包括例如但不限于阿霉素、daunombicin、羥基柔紅霉素和idambicin和表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷。術語“拓撲異構酶I抑制劑”是指抑制或降低拓撲異構酶I的生物活性的分子或化合物。包括例如但不限于camptosar。術語“烷化劑”是指能夠與(例如胺、醇類、酚、有機和無機酸類)的親核基團反應并由此給另一分子如蛋白或核酸添加烷基(例如乙基或甲基)的任何分子或化合物。用作化療劑的烷化劑實例包括白消安(bisulfan)、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、異環磷酰胺、氮芥、苯丙氨酸氮芥、噻替派、各種亞硝基脲化合物和鉑化合物如順鉑和卡鉑。術語“植物堿”是指屬于生物學上有活性和細胞毒性的、來源于植物的堿性含氮分子家族的化合物。植物堿的實例包括但不限于紫杉烷類(taxanes)如紫杉酚、多西他賽(docetaxel)和紫杉醇以及長春藥類如長春堿、長春新堿和長春瑞賓。
術語“嵌合抗體”是指這樣一種抗體，其輕鏈和重鏈基因典型地通過遺傳工程由屬于不同種類的免疫球蛋白基因片段構建而成。例如，來自小鼠單克隆抗體的基因的可變(V)區片段可以與人恒定(C)區片段連接，如IgG1和IgG4。優選人同種型IgG1。因此典型的嵌合抗體是由來自小鼠抗體的V或抗原結合結構域和來自人抗體的C或效應結構域組成的雜合蛋白。
術語“有效量”是指足以引起期望結果(包括但不限于例如在體外或體內減小腫瘤體積)的化合物、物質或包含本發明化合物的組合物的量。本發明藥物組合物的有效量是足以引起期望臨床結果(包括但不限于改善、穩定、預防或延遲患者的癌癥發展)的藥物組合物的量。在兩種情況下，本發明化合物的有效量都可以以一次或多次給藥而施用。這些上述指標的檢測和測定是本領域技術人員已知的，包括但不限于例如腫瘤負荷的減少、腫瘤大小的抑制、繼發性腫瘤增生減少、基因在腫瘤組織中表達、生物標記的存在、淋巴結的參與、組織學分級和核分級。
術語“表位”是指抗體或抗體構建體優先和特異性結合的抗原區域。單克隆抗體優先結合分子中的單一特異性表位，所述表位可以在分子學上確定。在本發明中，多特異性抗體可以識別多個表位。
術語“腫瘤體積的抑制”是指腫瘤體積的任何減小或降低。
術語“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗體”是指包括至少一條人源化免疫球蛋白或抗體鏈(即至少一條人源化輕或重鏈)的免疫球蛋白或抗體。術語“人源化免疫球蛋白鏈”或“人源化抗體鏈”(即“人源化免疫球蛋白輕鏈”或“人源化免疫球蛋白重鏈”)是指具有可變區的免疫球蛋白或抗體鏈(即分別指輕或重鏈)，其中包括基本上來自人免疫球蛋白或抗體的可變構架區和基本上來自非人免疫球蛋白或抗體的互補決定區(CDRs)(如至少一個CDR，優選兩個CDRs，更優選三個CDRs)，并進一步包括恒定區(例如在輕鏈的情況下，包括至少一個恒定區或其部分，在重鏈的情況下，優選包括三個恒定區)。術語“人源化可變區”(如“人源化輕鏈可變區”或“人源化重鏈可變區”)是指包括基本上來自人免疫球蛋白抗體的可變構架區和基本上來自非人免疫球蛋白或抗體的互補決定區(CDRs)的可變區。
術語“淋巴毒素β受體(LT-β-R)激動劑”是指可以加強配體與LT-β-R結合、細胞表面LT-β-R聚集和/或LT-β-R信號傳導的任何試劑。
短語“多價抗體”或“多價抗體構建體”是指包含一個以上抗原識別位點的抗體或抗體構建體。例如，“二價”抗體構建體具有兩個抗原識別位點，“四價”抗體構建體具有四個抗原識別位點。術語“單特異性”、“雙特異性”、“三特異性”、“四特異性”等是指本發明的多價抗體構建體中存在的不同抗原識別位點特異性的數目(與抗原識別位點數不同)。例如，“單特異性”抗體構建體的抗原識別位點全部結合同一表位。“雙特異性”抗體構建體具有至少一個結合第一表位的抗原識別位點和至少一個結合不同于第一表位的第二表位的抗原識別位點。“多價單特異性”抗體構建體具有全部結合同一表位的多個抗原識別位點。“多價雙特異性”抗體構建體具有多個抗原識別位點，其中一些結合第一表位，另一些結合不同于第一表位的第二表位。術語“雙特異性-1”(也稱為“BS-1”)、″雙特異性-2″(也稱為“BS-2”)、“單特異性-1”(也稱為“MS-1”)和“單特異性-2”(也稱為“MS-2”)是指這里進一步描述的特定抗體構建體。在本發明的一個實施方案中，抗體是單特異性四價抗體，其中該抗體包含四個CBE11抗原識別位點，如圖6B所示。
“患者”或“受試者”或“宿主”是指人或非人動物。
術語“藥物遞送裝置”是指可以用來給受試者施用治療劑或試劑的任何裝置。藥物遞送裝置的非限制性實例包括皮下注射器、多室注射器、支架、導管、經皮貼片、顯微針、微型研磨器和可植入型控釋裝置。在一個實施方案中，術語“藥物遞送裝置”是指能夠在注射前混合兩種化合物的雙室注射器。
這里使用短語“藥物可接受的”指在合理醫學判斷范圍內適合用于接觸人和動物組織，而無過多毒性、刺激、變態反應或者其它問題或并發癥，與合理的益處/風險比率相稱的那些化合物、物質、組合物，和/或劑型。
這里使用的短語“藥物可接受載體”意思是參與將主題化合物從一個器官或身體部分運載或輸送至另一個器官或身體部分的藥物可接受的物質、組合物或載體，如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包封材料。每種載體在與該制劑的其它成分相容和對患者無害的意義上必須是“可接受的”。可以用作藥物可接受載體的物質的一些實例包括(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉化黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，如可可油和栓劑蠟；(9)油類，如花生油、棉子油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH緩沖液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和(22)藥物制劑中使用的其它無毒相容物質。
“藥物可接受鹽”是指化合物的相對無毒的無機和有機酸加成鹽。
術語“Fv片段”是指包含重鏈和輕鏈可變結構域的抗體片段。術語“Fc片段”是指包含重鏈恒定結構域的抗體片段。
術語“單鏈可變片段或scFv”是指重鏈結構域和輕鏈結構域相連接的Fv片段。一個或多個scFv片段可以與其它抗體片段(如重鏈或輕鏈的恒定結構域)連接形成具有一個或多個抗原識別位點的抗體構建體。
術語“腫瘤的超累加抑制”是指腫瘤體積總的減小大于由于每一單獨試劑造成的試劑組合的作用總和。在一個實施方案中，超累加抑制包括施用LT-β-R激動劑和不是LT-β-R激動劑的化療劑組合所產生的平均腫瘤抑制，該抑制在統計學上顯著高于單獨施用LT-β-R激動劑或單獨施用化療劑產生的腫瘤抑制的總和。可以用如本發明詳述部分所述的各種統計方法確定LT-β-R激動劑和化療劑組合施用產生的腫瘤抑制是否“在統計學上顯著高于”各化合物預期的累加值。
術語“協同的”是指比任何兩個或更多單一試劑的累加效應更有效的組合。在本發明的一個實施方案中，術語“協同的”包括超累加抑制的組合類型，其中LT-β-R激動劑和化療劑二者單獨都具有抑制腫瘤體積的能力。術語“增強”是指兩種或更多試劑的同時作用大于各試劑單獨作用的總和的情況。在某一實施方案中，增強是指超累加抑制類型，其中LT-β-R激動劑或化療劑中僅有一種單獨具有抑制腫瘤體積的能力。
“治療”受試者的癌癥或“治療”具有癌癥的受試者是指使受試者接受藥物治療，如施用藥物，從而降低或預防癌癥程度。治療包括(但不限于)施用組合物，如藥物組合物，且可以預防性或在病理事件開始之后實施。
術語“腫瘤體積”是指腫瘤總的大小，它包括腫瘤本身加上所波及的淋巴結(如果適用時)。可以用本領域已知的各種方法測定腫瘤體積，例如通過使用測徑器、記算機斷層(CT)或磁共振成象(MRI)掃描測量腫瘤尺寸，并使用基于例如Z軸直徑或者基于標準形狀如球體、橢圓球體或立方體的方程式計算體積。
2.多價LT-β-R激動劑抗體構建體和制備它的方法在一個實施方案中，本發明的多價抗體構建體是淋巴毒素β受體激動劑，并包含至少兩個能夠結合該受體和誘導LT-β-R信號傳導的結構域。這些構建體可以包括含有兩個或更多可變區的重鏈，所述可變區包含結合LT-β受體特異性的抗原識別位點，并且可以包括含有一個或多個可變區的輕鏈，或可以構建為僅包含含有兩個或更多可變區的重鏈或輕鏈，該可變區包含結合LT-β受體特異性的CDRs。
在一個方面，本發明提供了作為人淋巴毒素β受體(LT-β-R)激動劑的多價抗體構建體。在一個實施方案中，多價抗體構建體包含LT-β-R表位特異性的至少一個抗原識別位點。在某些實施方案中，抗原識別位點中的至少一個位于scFv結構域內，而在其它實施方案中，所有抗原識別位點都位于scFv結構域內。
抗體構建體可以是二價的、三價的、四價的或五價的。在某些實施方案中，該抗體構建體是單特異性的。在一個實施方案中，該抗體構建體是CBE11結合的表位特異性的。在其它實施方案中，本發明的抗體是包含四個CBE11抗原識別位點的單特異性四價LT-β-R激動劑抗體。在另一個實施方案中，該抗體構建體是BHA10表位特異性的，在一些實施方案中，它是四價的。在這些實施方案中的任何一個中，至少一個抗原識別位點可以位于scFv結構域上，在這些實施方案中的某些中，所有抗原識別位點都位于scFv結構域上。抗體可以是多特異性的，其中本發明的抗體結合人LT-β受體上的不同表位。
在某些實施方案中，該抗體構建體是雙特異性的。在其它實施方案中，該抗體構建體對下列抗體BKA11、CDH10、BCG6、AGH1、BDA8、CBE11和BHA10之一結合的表位組成的淋巴毒素β受體(LT-β-R)表位組中的至少兩個成員是特異性的。在一個實施方案中，該抗體構建體是CBE11和BHA10抗體所結合的表位特異性的，在某些實施方案中，它是四價的。在一個實施方案中，該抗體構建體具有兩個CBE11特異性抗原識別位點和兩個BHA10特異性識別位點，其中該抗體是雙特異性四價LT-β-R激動劑抗體。在任何多特異性抗體構建體中，至少一個抗原識別位點可以位于scFv結構域上，在某些實施方案中，所有抗原識別位點都位于scFv結構域上。
在另一些實施方案中，本發明的抗體構建體包含下列多核苷酸序列及其所編碼的多肽序列
實施例1-9提供了獲得上表列出的雙特異性、單特異性和五聚LT-β-R激動劑抗體構建體的詳細說明。圖6A和6B描繪了這些構建體中某些構建體的示意圖。然而可以使用本領域已知方法構建本發明的其它LT-β-R激動劑抗體構建體，如下簡略描述。圖7描繪了這些構建體的幾個實例。
抗原識別位點或完整可變區可以來源于一個或多個親本抗體。親本抗體可以包括天然存在的抗體或抗體片段、由天然存在的抗體改變而來的抗體或抗體片段、使用已知特異于LT-β受體的抗體或抗體片段的序列從頭構建的抗體。可以來源于親本抗體的序列包括重和/或輕鏈可變區和/或CDRs、構架區或其其它部分。
多價、多特異性抗體可以含有包含兩個或更多可變區的重鏈和/或包含一個或多個可變區的輕鏈，其中至少兩個可變區識別LT-β受體上的不同表位。
可以使用來源于親本抗LT-β-R抗體的各種不同序列以各種不同方法構建多價抗LT-β-R抗體，包括小鼠或人源化BHA10(Browning等J.Immunol.15433(1995)；Browning等J.Exp.Med.183867(1996))和/或小鼠或人源化CBE11(美國專利6,312,691)。
下列產生單克隆抗LT-β-R抗體的雜交瘤細胞系可以用來制備從中得到抗體構建體序列的抗LT-β-R抗體，所述雜交瘤細胞系以前已經根據布達佩斯條約規定保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，其ATCC保藏號如下
然而，本領域技術人員使用常規重組DNA技術可以開發各種其它多價抗體構建體，例如如PCT國際申請PCT/US86/02269；歐洲專利申請184,187；歐洲專利申請171,496；歐洲專利申請173,494；PCT國際
發明者E·加伯, V·貝利, J·L·布朗寧 申請人:拜奧根Idec馬薩諸塞公司