專利名稱：一種提高小球藻光合作用效率的化學復合誘變方法
技術領域：
本發明涉及一種對生活用水、有機物及N、P、K所污染水凈化的小球藻進行化學復合誘變方法，具體地說是一種通過化學復合誘變提高小球藻光合作用效率的方法。
背景技術：
小球藻(Chlorellaspp)為綠藻門(Chlorophyceae)小球藻屬(chlorella)單細胞藻，含有蛋白質、小球藻多糖、脂肪酸等多種營養成分，具有多種保健和藥理作用，如小球藻多糖具有抗腫瘤，抗病毒，抗血栓及增強機體的免疫作用。經熱處理或破壁處理的小球藻，可直接制成小球藻片，小球藻顆粒制劑及小球藻膠囊，適用于預防和輔助治療高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化、冠心病、消化性潰瘍、免疫功能低下等疾病，還可以適用于腫瘤放療和化療副反應。在化工上還可應用于污水處理；由于小球藻是光能自養型生物，可和人形成循環系統，即人和動物呼出的CO2可供小球藻增長，而小球藻產生的O2可供任何動物呼吸作用，從而使小球藻在航天方面開發利用提供了依據；由于小球藻結構的特殊性能，在光合作用機理、跨膜轉運機理等研究方面成為良好的模式生物。因此小球藻不僅具有優越的營養保健作用，成為人們的食品、制藥和生物燃料的開發資源，而且成為植物學家們研究光合作用機理、跨膜運輸等重大理論課題的寶貴材料。發明內容
本發明的目的是提供一種提高小球藻光合作用效率的方法，用于對生活用水、有機物及N、P、K所污染水進行高效凈化治理。
本發明實現發明目的采用如下方案:
一種對生活用水、有機物及N、P、K所污染水凈化的小球藻進行化學復合誘變方法，其特點在于包括如下步驟:
(I)將從自然水源中分離出的出發小球藻株，采用無菌光照培養箱，在250C 土 1°C，光照強度3000LUX條件下，于液體培 養基A2中活化培養1214h ;選取生長相對較好，呈墨綠色的藻株作為誘變藻株，挑選后于液體培養基A中純培養，并作誘變原藻液；所述的液體培養基A2為每升水中含(NH4)2SO4或NH4Cl或(NH4) 2C03500mg，MgSO4.7H20或MgCl220mg, CaCl2 或 CaCO3IOmg, K2HPO4L 44g, KH2P03720mg, FeSO4.7H205mg, CoCl2.6H202mg,(NH4)6MoO2.4H202mg, H3PO3IOOOmg ；pH 為 6.57.2 ；
(2)按長春花堿:秋水仙堿=1: 4質量比混合作為誘導劑，加入到步驟(I)的原藻液中，誘導劑的加入量為終濃度0.0lwt0.05wt%，加入后將原藻液于3000Lux、27°C ±1°C下培養12120h ;誘導結束后，將原藻液離心去上清液后取沉淀，并立即加入無菌液體培養基進行自我修復，先避光5h，然后于25°C ± I°C,3000Lux下無菌培養4d至穩定期，經固體培養基純化培養后得到遺傳穩定性好的小球藻突變型穩定的純種系；所述固體培養基由液體培養基A2+l.0wt%瓊脂得到。
作為優選，所述步驟(2)誘導劑的加入量為終濃度0.03wt% ;誘導培養時間為48h。
本發明采用內地淡水小球藻為出發藻株，長春花堿和秋水仙素或以甲基硫酸乙酯為誘變劑，培養出比原藻株蛋白含量高出20% 56.1 %和氧釋放量高75% 80%，并顯著改善自然水系中水華現象。
本發明有益效果體現在:
1、本發明用顯微多維分光光度法在BDFACSCalibur流式細胞儀或顯微多道分光光度系統裝置上，再用細胞周期試劑盒做DNA含量測定，測定核DNA含量為對照組2倍，豐度提高1.82倍，葉綠體DNA含量同為對照組2倍，豐度1.7倍，誘導突變最佳時間48h ;誘變株蛋白質含量采用考馬斯亮藍G250分光光度法檢測，結果表明，試驗組比對照組升高27 % ；葉綠素含量采用Lichtenaler等人改良法測定表明，除葉綠素b有降低外，實驗組也比對照組葉綠素a，類胡蘿卜素分別提高70 %和3.4倍，但葉綠素b的降低可通過培養基中添加(NH4) 2C03200mg 而補償。
2、本項發明為保證突變藻株DNA不發生回復突變及葉綠體不再聚合；連續高效率促進CO2的還原而釋放氧氣，在誘變停止后，除撤去原誘變液，加入新a2’培養液，在無光照條件下保存5h再光照培養予以解決。
3、本發明采用質量長春花堿(vinblastine, VLB)和秋水仙堿(colchicine, CCC.)為誘變劑，協同誘導小球藻突變，使小球藻產生的突變能保持葉綠體穩定遺傳性，不致因世代傳遞而產生葉綠體重聚和的回復突變而退化。經15代接種無光培育并野外放養，再取樣觀察和對水質分析，結果表明，其形態未發生明顯改變，水質數據原試驗藻株35代接近。
4、本項發明為了保證所獲誘變小球藻的質量，進行了推廣應用并檢測，采用常規化學分析方法和碘量法對水中N、P、K及含溶氧量進行測定，結果發現該藻株對所測定項目(氮磷鉀等)污染水的治理效果不但比對照組提高1-1.3.4倍，而且還能消除惡臭及化學農藥污染的整治也有顯著效果。
5、本發明誘變的小球藻，其小球藻核和葉綠體封閉式DNA加倍，提高其自主釋放負氧，達到凈化水質和大氣生態環境效果，避免或減少生活工業排泄物對水、大氣的污染和太陽紫外輻射，凈化生態環境，增進人體健康。
圖1是本發明采用顯微多維快速圖像分析法測定的DNA含量。
圖2a、2b是本發明采用顯微多維快速圖像分析法測定的葉綠體的DNA含量。
以下通過具體實施方式
對本發明技術方案做進一步說明。
具體實施方式
一、最佳培養基確定
如表I所示，設常規HB4培養基為對照(Ck)，A2, A3、為試驗組培養所篩選培養基。Ck中的土壤水所用土壤為沒有施過化肥、農藥的土壤在三角燒瓶(1.0L)底部鋪上Icm厚的土層，隨后加入IL蒸餾水高壓滅菌30min后，靜置24h傾倒出清液即可使用。
表I小球藻培養基
權利要求
1.一種提高小球藻光合作用效率的化學復合誘變方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將從自然水源中分離出的出發小球藻株，米用無菌光照培養箱，在25V土1°C,光照強度3000LUX條件下，于液體培養基A2中活化培養12-14h ;選取生長相對較好，呈墨綠色的藻株作為誘變藻株，挑選后于液體培養基A中純培養，并作誘變原藻液；所述的液體培養基 A2 為每升水中含(NH4)2SO4 或 NH4Cl 或(NH4)2CO3 500mg, MgSO4.7H20 或 MgCl2 20mg，CaCl2 或 CaCO3 IOmg, K2HPO4 1.44g, KH2P03720mg, FeSO4.7H20 5mg, CoCl2.6H20 2mg,(NH4)6MoO2.4H20 2mg, H3PO3 IOOOmg ；pH 為 6.5-7.2 ； (2)按長春花堿:秋水仙堿=1:4質量比混合作為誘導劑，加入到步驟(I)的原藻液中，誘導劑的加入量為終濃度0.0lwt-0.05wt%，加入后將原藻液于3000Lux、27°C 土 1°C下培養12-120h ;誘導結束后，將原藻液離心去上清液后取沉淀，并立即加入無菌液體培養基進行自我修復，先避光5h，然后于25°C 土 rC、3000Lux下無菌培養4d至穩定期，經固體培養基純化培養后得到遺傳穩定性好的小球藻突變型穩定的純種系；所述固體培養基由液體培養基A2+1.0wt%瓊脂得到。
2.根據權利要求1所述的一種提高小球藻光合作用效率的化學復合誘變方法，其特征在于，所述步驟(2)誘導劑的加入量為終濃度0.03wt% ;誘導培養時間為48h。
全文摘要
本發明公開了一種提高小球藻光合作用效率的化學復合誘變方法，將從自然水源中分離出的出發小球藻株，采用無菌光照培養箱，在25℃±1℃，光照強度3000Lux條件下，于液體培養基A中活化培養12-14h；選取生長相對較好，呈墨綠色的藻株作為誘變藻株，挑選后于液體培養基A2中純培養，作誘變原藻液，然后采用長春花堿與秋水仙堿(1:4)協同誘導，使自然界淡水普生性單細胞類小球藻(Chlorella Vulgaris Beijerinck)核和葉綠體DNA均加倍，提高光合作用效率，使受有機物源污染的水質凈化，又可顯著改善高含N、P、K水質的狀態；通過化學復合誘變獲得一種既能應用改善淡水水源品質，又可培育為魚飼料的藻株。
文檔編號C12N15/01GK103160494SQ201310041518
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月1日 優先權日2013年2月1日
發明者蔣立科, 程備久, 劉朝良, 魏練平, 陶芳, 陳祎凡, 鮑文英, 田勝尼 申請人:安徽農業大學