專利名稱：小鼠抗人egfr單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株的制作方法
技術領域：
本發明涉及以原核表達的EGFR蛋白免疫小鼠獲得的分泌EGFR單克隆抗體的雜交瘤細胞株11B2，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
EGFR(表皮生長因子受體)也稱作erbBl/HERl是由1186個氨基酸殘基構成，分子量約為170kDa的一種跨膜糖蛋白。EGFR是原癌基因c_erbBl的表達產物，該基因定位于人7pl2.1 13.2。EGFR屬于表皮生長因子受體(HER)家族成員，目前已知該家族包括四個相關的蛋白酪氨酸激酶受體:HER1 (erbBl/EGFR)、HER2 (erbB2/NEU)、HER3 (erbB3)及HER4(erbB4)，這些蛋白酪氨酸激酶受體在細胞表面與特異的天然受體或生長因子相互作用。EGFR廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞中。在包括非小細胞肺癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤、結腸癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌等多種上皮來源的腫瘤中，EGFR存在高表達或變異。EGFR高表達水平與腫瘤的惡化、易侵襲性、對放化療的抵抗程度密切相關，在很多惡性腫瘤中也與不良預后相關。EGFR在調節腫瘤細胞的增殖、存活、損傷修復、粘附、轉移及新血管生成中具有重要的作用，其致瘤效應包括DNA合成啟動和促進細胞生長、侵襲及轉移等。EGFR由胞外配體結合區、疏水性跨膜區和胞內酪氨酸激酶區三部分組成，以無活性的單體形式存在，其特異性配體有EGF、轉化生長因子α (TGF-α)、雙向調節因子以及肝素結合EGF樣生長因子。當EGFR胞外區與配 體結合后，其胞內區發生自身磷酸化，導致EGFR 二聚化，激活胞內酪氨酸酶活性，使下游一系列胞內信號分子發生磷酸化，從而啟動Shc，Ras/MARK，PI3K及JAKs/STATs等多條通路。EGFR信號通路的活化可以增加腫瘤細胞的侵襲力、使腫瘤細胞增值、促進血管生成、抑制腫瘤細胞凋亡。EGFR在腫瘤細胞中的高度表達以及在腫瘤細胞生長、分化等生理過程中發揮的重要作用使EGFR成為具有良好前景的腫瘤診斷及治療的靶點。目前，國內外已經獲得了多種EGFR的單克隆抗體，但一直以來都需要表達量更多，親和性更好，稀釋度更高，具有更多優良特性的單克隆抗體。獲得活性高的EGFR的單克隆抗體對于臨床診斷和科學研究具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種高親和性的、可用于科研或臨床免疫組化檢測EGFR表達的小鼠抗人EGFR單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案:(I)根據EGFR的基因序列(ΝΜ_005228.3)的編碼框，設計一對特異引物，TrizolReagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增EGFR基因，構建重組表達載體PET28a-EGFR，轉化大腸桿菌BL21感受態，IPTG誘導蛋白表達并親和純化蛋白作為抗原。(2)采用經典的細胞融合技術制備EGFR單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測定抗體純度，直接ELISA法測定純化抗體的滴度。(3)采用免疫印跡法(Western blot)檢測EGFR單抗的效價及特異性，通過免疫組織化學分析EGFR單克隆抗體染色人乳腺癌石蠟切片。(4)根據抗體基因的恒定區序列合成特異性引物，PCR擴增單克隆抗體EGFR重鏈可變區和輕鏈可變區，回收目的片段，克隆到PGEM-T載體中，轉化大腸桿菌TGl細胞后篩選陽性克隆，抽提質粒后測序確定了單克隆抗體EGFR的重鏈和輕鏈可變區序列。本發明提供的以原核表達的EGFR蛋白為抗原、免疫小鼠獲得的分泌EGFR單克隆抗體的雜交瘤細胞株，名稱為11B2，分類命名為小鼠抗人EGFR雜交瘤細胞系，該細胞株11B2已于2012年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCN0.6912。本發明還提供了所述雜交瘤細胞株11B2，CGMCC N0.6912產生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區，重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO =IO0本發明還提供了一種DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7編碼重鏈可變區氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID NO:8編碼輕鏈可變區氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本發明的優點和有益效果:本發明應用重組人的EGFR蛋白為免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用經典的細胞融合技術，通過ELISA篩選，獲得一株能穩定分泌抗EGFR的雜交瘤細胞株，命名為11B2，亞型鑒定為IgGl，將雜交瘤細胞株擴大培養后收集上清，采用Protein A親和層析法對EGFR單抗進行純化。SDS-PAGE結果顯示，純化后抗體純度在95%以上；ELISA滴度測定結果顯示，單抗的滴度均在1: 10000以上。免疫印跡法(Western blot)檢測EGFR單抗的效價及特異性，結果顯示在分子量170kDa處有一條明顯的區帶，證明是抗EGFR小鼠單克隆抗體，梯度稀釋顯示抗體1: 2000稀釋后條帶依然清晰，證明本單抗效價穩定；人乳腺癌石蠟切片經抗EGFR抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞膜或胞漿中有明顯黃色到棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色。從實驗結果上來看，本發明制備了高效價，高特異性的EGFR單克隆抗體，用該抗體檢測證實，其對細胞中的EGFR蛋白具有高識別能力，可用于科研或臨床免疫組化檢測EGFR表達。
圖1SDS-PAGE分析純化后的EGFR單克隆抗體。圖2ELISA法測定EGFR單克隆抗體滴度。圖3是免疫印跡法(Western blot)檢測EGFR單抗的純度及特異性。Lanel =EGFR單抗工作濃度1: 1000。Lane2:EGFR單抗工作濃度1: 2000。
圖4是免疫組織化學檢測分析EGFR單克隆抗體染色人乳腺癌石蠟切片。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。實施例1:雜交瘤細胞株11B2及其產生的單克隆抗體的獲得1、抗原制備(I)獲得目的基因在該實施例中，根據EGFR的基因序列(NM_005228.3)的編碼框，設計I對特異引物:引物1:5' -ATTGGATCCATGCGACCCTCCGGGACG-3' (SEQIDN0:1)引物2:5' -CCCTCGAGTCATGCTCCAATAAAT-3' ; (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增EGFR基因。(2)構建重組表達載體將步驟(I)獲得的PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達載體PET28a，構建重組質粒PET28a-EGFR。(3)獲得含重組表達質粒的表達菌種將步驟(2)獲得的連接產物轉化大腸桿菌BL21感受態，用含有硫酸卡那霉素的固體培養基篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進`入下步操作。以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。(4)誘導表達和蛋白純化將步驟(2)提取的質粒轉化BL21感受態，用含有硫酸卡那霉素的固體培養基篩選，挑選單克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液體培養基中培養，370C，220rpm培養10h，取5ml液體培養基轉移至250ml的大瓶中繼續培養，培養至OD值為0.8，加入0.2mMIPTG誘導表達，16°C誘導過夜，收集菌液超聲，取上清用N1-NTA瓊脂糖親和層析法純化EGFR蛋白。2、單抗的制備和純化(I)、免疫動物—般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行三次免疫注射。首次免疫。純化的重組蛋白EGFR (用適量生理鹽水稀釋)+完全弗氏佐劑，100 μ g/只，頸背部皮下多點注射；二次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白EGFR(用適量生理鹽水稀釋)+不完全弗氏佐劑，IOOyg/只，頸背部皮下多點注射；三次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白EGFR(用適量生理鹽水稀釋)，不完全弗氏佐劑，IOOyg/只，頸背部皮下多點注射；三次免疫后7 10天采血，用建立的ELISA法檢測效價，選擇效價最高者用于細胞融合。加強免疫(融合前3天)，用純化的重組蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾臟融
口 ο(2)、細胞融合
采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按一定比例混合(I: 5 I: 10)，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。采用HAT選擇性培養基，進行雜交瘤細胞的選擇性培養和篩選。用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清:以純化的EGFR蛋白(10 μ g/ml)包被酶標板，每孔100 μ 1,4°C包板過夜。甩掉包被液,加入200 μ 15%的脫脂奶粉,37°C封閉Ih后，洗滌3次，加雜交瘤細胞培養檢測上清IOOy I (陰性對照為PBSlOOy I)，37°C孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50 μ I，室溫靜置5分鐘，加終止液50 μ I。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。OD值明顯高于陰性對照2倍以上者定為陽性。最后篩選得到一株分泌性能最佳的抗EGFR雜交瘤細胞株，命名為11B2，亞型鑒定為IgGl。將選出的陽性雜交瘤細胞株11B2克隆化培養(有限稀釋法)，獲得能產生高效價單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞株擴大培養，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細胞為抗人EGFR雜交瘤細胞系11B2，該細胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6912。(3)單克隆抗體的大量制備與純化將步驟(2)獲得的細胞株11B2接種至Balb/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中提取抗體。單克隆抗體EGFR的純化:采用Protein A親和層析法。首先制備protein A親和柱，用PBS平衡柱子后，取抗EGFR的腹水過柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl 溶液(PH)洗脫，收集峰值區的洗脫液，經透析濃縮后備用。SDS-PAGE結果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖1)。(4)直接ELISA法測定純化抗體的滴度以純化的EGFR蛋白(10 μ g/ml)包被酶標板，每孔100 μ 1，4°C包板過夜。甩掉包被液，加入200 μ 15%的脫脂奶粉，37°C封閉Ih后，洗滌3次，將純化的抗體按1: 200，I: 400，I: 800，I: 1600，I: 3200，I: 6400，I: 12800 進行稀釋，以每孔 100 μ I 加入酶標板中(陰性對照為PBSlOOy I)，37°C孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37 °C孵育I小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μ 1，室溫靜置5分鐘，加終止液50 μ I。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。ELISA滴度測定結果顯示，單抗的滴度均在1: 10000以上(參見圖2)。實施例2:單克隆抗體鑒定及應用免疫組化應用檢測用EGFR單抗，按常規法作病理切片，對人乳腺癌石蠟切片進行免疫組化染色。具體方法為:(I)脫蠟切片依次置于二甲苯1、I1、III脫蠟每次5分鐘，移至無水乙醇1、II中各浸泡4分鐘，移至95%酒精中浸泡4分鐘，移至85%酒精中浸泡4分鐘，再移至70%酒精中浸泡4分鐘，流水沖洗2分鐘。(2)抗原修復
將已沖洗干凈組織切片放入高壓鍋內，加入約3000ml左右的檸檬酸鹽抗原修復液(pH6.0)，高火加熱煮沸后調至低火保持沸騰噴氣3分鐘，關掉電磁爐開關，兩分鐘后將高壓鍋移至冷水中冷卻，待高壓鍋內抗原修復液完全冷卻后，打開高壓鍋將組織切片用流水沖洗干凈移至蒸餾水中浸泡2分鐘。(3)阻斷 3 % H2O2中浸泡10分鐘，流水沖洗蒸餾水沖洗。取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍畫一圓圈注意圈接頭要接好，防止抗體跑出圈外造成假陰性。PBS緩沖液沖洗。(4)滴加一抗
甩去待測組織切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗為實施例1步驟(3)制備并純化的EGFR單克隆抗體，稀釋度為1: 1000。放置在孵育盒內4°C冰箱中過夜孵育約12小時。(5)滴加二抗將孵育盒從冰箱取出，恢復至室溫后取出切片，用PBS洗3次，每次5分鐘。滴加通用型二抗-HRP聚合物。將切片放入孵育濕盒中，蓋上蓋子，連孵育盒一起放入37°C恒溫箱中孵育30分鐘。(6)顯色、襯染、封片取出切片，擦掉組織周圍的多余的PBS，加入DAB顯色液中顯色3 5分鐘，在顯微鏡下控制染色的強度。待強度適中后將切片置自來水中終止顯色，再用流水沖洗5 10分鐘，蘇木素染液復染I分鐘，0.5%鹽酸酒精分化3秒鐘，流水沖洗5 10分鐘，脫水、透明、封片、鏡檢。結果判定:按照國外學者對組織中EGFR的判定標準，EGFR蛋白陽性反應為出現明顯棕黃色顆粒，定位于胞漿或胞膜。人乳腺癌組織(參見圖4)經抗EGFR抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞漿或胞膜中稱明顯黃色到棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色，說明此EGFR小鼠單克隆抗體可以特異性的應用于免疫組織化學實驗。實施例3:單克隆抗體可變區測序根據抗體基因的恒定區序列合成以下引物:zh085/ -GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3' (SEQID NO:3)zhrl15' -GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3' (SEQID NO:4)zl015/ -GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3(SEQ IDNO:5)zlr055/ -GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQIDNO:6)Trizol Reagent試劑分別提取5X IO6雜交瘤細胞11B2的總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA。用zh08和zhrll為引物進行PCR擴增單克隆抗體EGFR重鏈可變區，用zlOl和zlr05為引物進行PCR擴增單克隆抗體EGFR輕鏈可變區，PCR反應均采用熱啟動，反應條件:94°C 5分鐘；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30個循環；72°C 7分鐘。PCR產物經I %瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化目的片段(輕鏈長度391bp，重鏈長度420bp)。克隆到PGEM-T(Promega)載體中，轉化大腸桿菌TGl細胞后在IPTGIX-gal平板上進行篩選，取白色菌斑接種于含有氨韋青霉素的LB液體培養基中擴增。篩選陽性克隆，用QIAGEN的質粒抽提試劑盒抽提質粒并進行測序，確定了單克隆抗體EGFR的重鏈和輕鏈可變區序列。
單克隆抗體EGFR可變區的DNA序列和氨基酸序列:單克隆抗體EGFR 重鏈可變區 DNA 序列(5' —3'，399bp) (SEQ ID NO:7)；單克隆抗體EGFR的輕鏈可變區DNA序列(5' —3'，391bp)(SEQ ID NO:8)；單克隆抗體EGFR重鏈可變區的推斷氨基酸序列(131氨基酸)(SEQ ID NO:9)；單克隆抗體EGFR輕鏈可變區的推斷氨基酸序列(130氨基酸)(SEQ 10 ID NO:1 0)。
權利要求
1.一種以原核表達的EGFR蛋白免疫小鼠獲得的分泌EGFR單克隆抗體的雜交瘤細胞株11B2，保藏編號為 CGMCC N0.6912。
2.一種由權利要求1所述的雜交瘤細胞株11B2產生的單克隆抗體。
3.根據權利要求2所述的單克隆抗體，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:10o
4.一種DNA分子SEQ ID NO:7，它編碼權利要求3中所述的重鏈可變區氨基酸序列SEQID NO:9。
5.一種DNA分子SEQ ID NO:8，它編碼權利要求3中所述的輕鏈可變區氨基酸序列SEQID NO:10o
全文摘要
一種小鼠抗人EGFR單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。所述的分泌EGFR單克隆抗體的雜交瘤細胞株克隆號為11B2，保藏編號為CGMCC No.6912。本發明還提供了所述雜交瘤細胞株11B2產生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區，重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO9，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO10。本發明還提供了一種DNA分子SEQ ID NO7，它編碼重鏈可變區氨基酸序列SEQ IDNO9；一種DNA分子SEQ ID NO8，它編碼輕鏈可變區氨基酸序列SEQ ID NO10。該抗體可用于科研或臨床免疫組化檢測EGFR表達。
文檔編號C12N15/13GK103173415SQ20131004130
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月4日 優先權日2013年2月4日
發明者張林剛, 郗日沫, 尹芝南 申請人:天津三箭生物技術有限公司