三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法及基因工程菌株的制作方法

專利名稱：三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法及基因工程菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及乙醇的生物制備領域，具體地涉及三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法及基因工程菌株。
背景技術：
隨著人類文明的不斷進步，全球能源問題彰顯，現已成為制約全球經濟持續穩定發展的重要因素。燃料乙醇是一種清潔、可再生的生物質能源，纖維素燃料乙醇技術原料來源廣泛，是一項可持續發展的環境友好型技術，其核心技術體系的建設已成為一個全球能源戰略必爭之地。木質纖維素分解之后主要轉化為葡萄糖和木糖，葡萄糖和木糖在厭氧條件下經釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)發酵生成乙醇。本發明旨在以木質纖維生物質為原料，對經過多重基因改良獲得釀酒酵母工程菌株進行發酵獲得的纖維素乙醇關鍵技術進行系統地研究，通過篩選并獲得一系列優化的高產和高效率的纖維素乙醇目標菌株，為纖維素乙醇商業化生產奠定技術基礎。木糖發酵時先經木糖還原酶基因XR,木糖醇脫氫酶基因XDH，木酮糖激酶基因XK連續催化生成5-磷酸-木酮糖，然后在磷酸戊糖途徑主要基因RPE1，RKII, TALI, TKLl催化作用下進入糖酵解途徑，最后轉化為乙醇。在上述發酵過程中，目前許多研究者對XR進行蛋白工程，例如單突變體XR (K270R)和四突變體XR (K270S/N272P/S271G/R276F)，希望通過調節XR的氧化還原水平來提高木糖的消耗速率。有一些研究者對木糖利用代謝途徑關鍵基因XR/XDH/XK/TAL1中的一個或者兩個進行不同拷貝的探索，期望更有效的提高木糖和葡萄糖的利用率。現有技術研究表明木糖乙醇發酵過程中大部分基因的轉錄水平發生了顯著改變，因此轉錄調控是進一步提高乙醇產量的有效途徑。現有基因轉錄調控技術主要是通過經典的組成型強啟動子PGKl和ADHl來介導上述重要的七基因轉錄，期望提高七基因的表達水平，從而實現纖維素乙醇產量的提高。但上述現有技術改造的釀酒酵母工程菌株發酵木糖時生長速率緩慢，乙醇產量及轉化率偏低，乙醇的產量水平在0.36-0.42g/g總糖。然而，基因轉錄調控技術帶來的基因工程發酵代謝過程中的質粒負擔，代謝負擔，各種環境壓力響應都有可能影響最終的乙醇產量和產率，這是該研究技術的不確定性。同時木糖利用的低消耗速率，低轉化速率，盡管研究者嘗試了不同的啟動子，不同的拷貝數目，不同的微生物菌株背景來源，不同的基因蛋白工程，都沒有改變纖維素乙醇技術目前面臨的瓶頸和難點。

發明內容
因此為了解決上述問題提出并完成了本發明。本發明的首要目的是提供三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法。本發明的另一目的是提供三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的基因工程菌株。根據本發明的三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法包括通過構建基因XR、XDH、XK、RPEl、RKIl和TALl的表達質粒，在釀酒酵母中表達上述基因的步驟，其中，用KGDl啟動子介導限速基因XK，用HSP26啟動子介導關鍵限速基因TALl。根據本發明具體實施方式
，所述三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法包括步驟:(1)將質粒p61轉入釀酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有兩基因pADHl-RPEl和pPGKl-XDH,質粒p61的構建過程:721bp的啟動子克隆進入pbluescript,接下來71bp7的ADHl 啟動子，434bp 的 PGKl 終止子，410bp 的 RPEl 啟動子，629bp (自 ATG 起 629bp)的 RPEl結構基因一部分，XDH結構基因，選擇標記RKUR，依次克隆進來，形成質粒p61 ；(2)將質粒p62轉入WXYl，得到WXY2，該菌株額外含有pADHl_XR和pPGKl_XK，質粒P62的構建過程:在上述p61質粒的基礎上，500bp的XK啟動子替換RPEl啟動子，419bp(自ATG起419bp)的XK結構基因一部分替換RPEl結構基因一部分(自ATG)，含有四個突變的 xRk27cis/n272P/S271G/R276F 替換 XDH 結構基因，形成質粒 P62 ；(3)將質粒p64轉入WXY2，得到WXY3，該菌株額外含有多拷貝的pPGKl-RKIl和pADHl-TALl，并且該菌株能初步利用木糖產生乙醇，質粒p64的構建過程:用717的ADHl啟動子替換PESC-LEU中的反向啟動子PGAL10/PGAL1，接下來72Ibp的PGKl啟動子，選擇標記Zeocin, 1723bp的r DNA，TALl和RKIl結構基因依次克隆進來，形成質粒p64 ；(4)將質粒pUC-3XK270R轉入釀酒酵母WT，得到WXY4，該菌株含有三基因pADH1-XR/pPGK1-XDH/pPGK1-XK,能初步利用木糖產生乙醇；將質粒pUC_3XK270R轉入WXY3，得到WXY5，該菌株能很好地利用木糖，產生更多的乙醇；(5) pv3質粒的構建過程如下:首先將TALl結構基因連接在pBluscript原始質粒上，接下來依次將啟動子CRE1，啟動子KGDlr，XK-ORFr，選擇標記基因RUR結構，啟動子HSP26r，終止子CREl克隆進來，形成pv3質粒，其表型見表I，整合插入位點為CREl結構基因，被分別轉進WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7 ；(6)將pUC_3X(野生型XR)分別轉入酵母菌株釀酒酵母WT，WXY3，WXY6，分別得到工程菌株 WXY8，WXY9, WXYlO。根據本發明的具體實施方式
，以安琪酵母公司的工業釀酒酵母YC-DM拆分孢子獲得的單倍體菌株為出發菌株WT，首先構建了一個能夠有效利用木糖的工程菌株即WXY3，含有 XRK27as/N272P/s27iG/R276F/XDH/XK/RpE1/RKn/TAL1。在此基礎上，進一步轉入了一個已驗證過
的質粒PUC-3XK270R含有木糖利用三基因XRK27°7XDH/XK，得到了工程菌株WXY5，此即第一階段葡萄糖階段。接下來以WXY5為研究對象，委托深圳華大基因對其在高濃度混合糖發酵過程中的4小時，24小時和48小時進行了 RNA-Seq分析。根據發表的DNA芯片數據，獲得RNA-seq的絕對表達量RPKM，我們自己驗證的RT-qPCR數據，篩選獲得了好氧狀態下的啟動子K⑶I和發酵后期的熱休克啟動子HSP26。用KGDl啟動子介導限速基因)(K，HSP26啟動子介導關鍵限速基因TAL1，構建了質粒pv3，含有木糖階段和熱休克階段。將pv3轉入WXY5，得到了一個有良好發酵特征的WXY7。用PUC-3X替換WXY7中的pUC_3XK270R，得到了階段性的高產乙醇工程菌株WXY10，該菌株在5% (木糖+葡萄糖)厭氧發酵過程中，6小時消耗完了葡萄糖，大概60小時左右消耗完了木糖，乙醇轉化率達到了 0.48g乙醇/g總糖。根據本發明的三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的基因工程菌株其保藏編號為 CGMCC N0.7191。根據本發明的技術方案，其中所用木糖還原酶基因XR的序列如SEQ ID N0.1所示:atgccttctattaagttgaa ctctggttacgacatgccagccgtcggtttcggctgttggaaagtcgacgtcgacacctgttctgaacagatctaccgtgctatcaagaccggttacagattgttcgacggtgccgaagattacgccaacgaaaagttagttggtgccggtgtcaagaaggccattgacgaaggtatcgtcaagcgtgaagacttgttccttacctccaagttgtggaacaactaccaccacccagacaacgtcgaaaaggccttgaacagaaccctttctgacttgcaagttgactacgttgacttgttcttgatccacttcccagtcaccttcaagttcgttccattagaagaaaagtacccaccaggattctactgtggtaagggtgacaacttcgactacgaagatgttccaattttagagacctggaaggctcttgaaaagttggtcaaggccggtaagatcagatctatcggtgtttctaacttcccaggtgctttgctcttggacttgttgagaggtgctaccatcaagccatctgtcttgcaagttgaacaccacccatacttgcaacaaccaagattgatcgaattcgctcaatcccgtggtattgctgtcaccgcttactcttcgttcggtcctcaatctttcgttgaattgaaccaaggtagagctttgaacacttctccattgttcgagaacgaaactatcaaggctatcgctgctaagcacggtaagtctccagctcaagtcttgttgagatggtcttcccaaagaggcattgccatcattccaaagtccaacactgtcccaagattgttggaaaacaaggacgtcaacagcttcgacttggacgaacaagatttcgctgacattgccaagttggacatcaacttgagattcaacgacccatgggactgggacaagattcctatcttcgtctaa木糖醇脫氫酶基因XDH的序列如SEQ ID N0.2所示:atgactgctaacccttccttggtgttgaacaagatcgacgacatttcgttcgaaacttacgatgccccagaaatctctgaacctaccgatgtcctcgtccaggtcaagaaaaccggtatctgtggttccgacatccacttctacgcccatggtagaatcggtaacttcgttttgaccaagccaatggtcttgggtcacgaatccgccggtactgttgtccaggttggtaagggtgtcacctctcttaaggttggtgacaacgtcgctatcgaaccaggtattccatccagattctccgacgaatacaagagcggtcactacaacttgtgtcctcacatggccttcgccgctactcctaactccaaggaaggcgaaccaaacccaccaggtaccttatgtaagtacttcaagtcgccagaagacttcttggtcaagttgccagaccacgtcagcttggaactcggtgctcttgttgagccattgtctgttggtgtccacgcctctaagttgggttccgttgctttcggcgactacgttgccgtctttggtgctggtcctgttggtcttttggctgctgctgtcgccaagaccttcggtgctaagggtgtcatcgtcgttgacattttcgacaacaagttgaagatggccaaggacattggtgctgctactcacaccttcaactccaagaccggtggttctgaagaattgatcaaggctttcggtggtaacgtgccaaacgtcgttttggaatgtactggtgctgaaccttgtatcaagttgggtgttgacgccattgccccaggtggtcgtttcgttcaagtcggtaacgctgctggtccagtcagcttcccaatcaccgttttcgccatgaaggaattgactttgttcggttctttcagatacggattcaacgactacaagactgctgttggaatctttgacactaactaccaaaacggtagagaaaatgctccaattgactttgaacaattgatcacccacagatacaagttcaaggacgctattgaagcctacgacttggtcagagccggtaagggtgctgtcaagtgtctcattgacggccctgagtaa介導限速基因XK的序列如SEQ ID N0.3所示:atgttgtgttcagtaattcagagacagacaagagaggtttccaacacaatgtctttagactcatactatcttgggtttgatctttcgacccaacaactgaaatgtctcgccattaaccaggacctaaaaattgtccattcagaaacagtggaatttgaaaaggatcttccgcattatcacacaaagaagggtgtctatatacacggcgacactatcgaatgtcccgtagccatgtggttagaggctctagatctggttctctcgaaatatcgcgaggctaaatttccattgaacaaagttatggccgtctcagggtcctgccagcagcacgggtctgtctactggtcctcccaagccgaatctctgttagagcaattgaataagaaaccggaaaaagatttattgcactacgtgagctctgtagcatttgcaaggcaaaccgcccccaattggcaagaccacagtactgcaaagcaatgtcaagagtttgaagagtgcataggtgggcctgaaaaaatggctcaattaacagggtccagagcccattttagatttactggtcctcaaattctgaaaattgcacaattagaaccagaagcttacgaaaaaacaaagaccatttctttagtgtctaattttttgacttctatcttagtgggccatcttgttgaattagaggaggcagatgcctgtggtatgaacctttatgatatacgtgaaagaaaattcagtgatgagctactacatctaattgatagttcttctaaggataaaactatcagacaaaaattaatgagagcacccatgaaaaatttgatagcgggtaccatctgtaaatattttattgagaagtacggtttcaatacaaactgcaaggtctctcccatgactggggataatttagccactatatgttctttacccctgcggaagaatgacgttctcgtttccctaggaacaagtactacagttcttctggtcaccgataagtatcacccctctccgaactatcatcttttcattcatccaactctgccaaaccattatatgggtatgatttgttattgtaatggttctttggcaagggagaggataagagacgagttaaacaaagaacgggaaaataattatgagaagactaacgattggactctttttaatcaagctgtgctagatgactcagaaagtagtgaaaatgaattaggtgtatattttcctctgggggagatcgttcctagcgtaaaagccataaacaaaagggttatcttcaatccaaaaacgggtatgattgaaagagaggtggccaagttcaaagacaagaggcacgatgccaaaaatattgtagaatcacaggctttaagttgcagggtaagaatatctcccctgctttcggattcaaacgcaagctcacaacagagactgaacgaagatacaatcgtgaagtttgattacgatgaatctccgctgcgggactacctaaataaaaggccagaaaggactttttttgtaggtggggcttctaaaaacgatgctattgtgaagaagtttgctcaagtcattggtgctacaaagggtaattttaggctagaaacaccaaactcatgtgcccttggtggttgttataaggccatgtggtcattgttatatgactctaataaaattgcagttccttttgataaatttctgaatgacaattttccatggcatgtaatggaaagcatatccgatgtggataatgaaaattgggatcgctataattccaagattgtccccttaagcgaactggaaaagactctcatctaa基因R削I的序列如SEQ ID N0.4所示:atggctgccggtgtcccaaaaattgatgcgttagaatctttgggcaatcctttggaggatgccaagagagctgcagcatacagagcagttgatgaaaatttaaaatttgatgatcacaaaattattggaattggtagtggtagcacagtggtttatgttgccgaaagaattggacaatatttgcatgaccctaaattttatgaagtagcgtctaaattcatttgcattccaacaggattccaatcaagaaacttgattttggataacaagttgcaattaggctccattgaacagtatcctcgcattgatatagcgtttgacggtgctgatgaagtggatgagaatttacaattaattaaaggtggtggtgcttgtctatttcaagaaaaattggttagtactagtgctaaaaccttcattgtcgttgctgattcaagaaaaaagtcaccaaaacatttaggtaagaactggaggcaaggtgttcccattgaaattgtaccttcctcatacgtgagggtcaagaatgatctattagaacaattgcatgctgaaaaagttgacatcagacaaggaggttctgctaaagcaggtcctgttgtaactgacaataataactteattatcgatgcggatttcggtgaaatttccgatccaagaaaattgcatagagaaatcaaactgttagtgggcgtggtggaaacaggtttattcatcgacaacgcttcaaaagcctacttcggtaattctgacggtagtgttgaagttaccgaaaagtga`
基因RPEl的序列如SEQ ID N0.5所示:atggtcaaaccaattatagctcccaggtatccttgcttctgacttcgccaacttgggttgcgaatgtcataaggtcatcaacgccggcgcagattggttacatatcgatgtcatggacggccattttgttccaaacattactctgggccaaccaattgttacctccctacgtcgttctgtgccacgccctggcgatgctagcaacacagaaaagaagcccactgcgttcttcgattgtcacatgatggttgaaaatcctgaaaaatgggtcgacgattttgctaaatgtggtgctgaccaatttacgttccactacgaggccacacaagaccctttgcatttagttaagttgattaagtctaagggcatcaaagctgcatgcgccatcaaacctggtacttctgttgacgttttatttgaactagctcctcatttggatatggctcttgttatg
actgtggaacctgggtttggaggccaaaaattcatggaagacatgatgccaaaagtggaaactttgagagccaagtt
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ttattgtcgctggtaccagtgttttcactgcagctgacccgcacgatgttatctccttcatgaaagaagaagtctcg
aaggaattgcgttctagagatttgctagattag:基因TALl的序列如SEQID N0.6所示:atgtctgaaccagctcaaaagaaacaaaaggttgctaacaactctctagaacaattgaaagcctccggcactgtcgttgttgccgacactggtg atttcggctctattgccaagtttcaacctcaagactccacaactaacccatcattgatcttggctgctgccaagcaaccaacttacgccaagttgatcgatgttgccgtggaatacggtaagaagcatggtaagaccaccgaagaacaagtcgaaaatgctgtggacagattgttagtcgaattcggtaaggagatcttaaagattgttccaggcagagtctccaccgaagttgatgctagattgtcttttgacactcaagctaccattgaaaaggctagacatatcattaaattgtttgaacaagaaggtgtctccaaggaaagagtccttattaaaattgcttccacttgggaaggtattcaagctgccaaagaattggaagaaaaggacggtatccactgtaatttgactctattattctccttcgttcaagcagttgcctgtgccgaggcccaagttactttgatttccccatttgttggtagaattctagactggtacaaatccagcactggtaaagattacaagggtgaagccgacccaggtgttatttccgtcaagaaaatctacaactactacaagaagtacggttacaagactattgttatgggtgcttctttcagaagcactgacgaaatcaaaaacttggctggtgttgactatctaacaatttctccagctttattggacaagttgatgaacagtactgaacctttcccaagagttttggaccctgtctccgctaagaaggaagccggcgacaagatttcttacatcagcgacgaatctaaattcagattcgacttgaatgaagacgctatggccactgaaaaattgtccgaaggtatcagaaaattctctgccgatattgttactctattcgacttgattgaaaagaaagttaccgcttaa本發明擬采用DNA芯片及qRT-PCR方法對酵母細胞在葡萄糖發酵階段，木糖發酵階段包括發酵后期等不同階段的轉錄組表達譜進行構建。針對不同代謝階段發現的轉錄水平大幅上調的特征基因，擬利用其啟動子驅動木糖代謝中相關目標基因XR，XDH，XKS1，TAL1在相應階段繼續進行高水平表達，以使目標基因在發酵的各階段都能持續高效表達。酵母在混合糖發酵的前期及對數生長期優先利用葡萄糖，本發明根據RT-PCR篩選并確認了厭氧狀態下強啟動子pPGKl，pADHl。當葡萄糖耗盡后，本發明篩選了 TCA中代謝轉錄水平發生較大改變的基因的啟動子，用來調控具有呼吸特征的木糖基因轉錄，確定了木糖發酵狀態下強啟動子有PKGD1。發酵后期也稱應激階段，其中環境溫度上升5°C引起的熱休克效應對乙醇產量變化非常明顯。將篩選獲得的熱休克蛋白強啟動子pHSP26，pHSP70整合到目標基因上，以增強酵母細胞對發酵后期不利環境的抗性和適應性，提前到達發酵終點。總之，本發明通在葡萄糖階段，木糖階段及發酵后期階段引入強啟動子來優化乙醇的生物合成途徑中目標基因的轉錄調控，并通過調控靶點基因mRNA轉錄水平這一核心思路解決發酵中后期的代謝瓶頸。因此，本發明相對于現有技術的改進和優點如下:本發明將纖維素酒精發酵過程分為厭氧的葡萄糖發酵階段，好氧的木糖呼吸代謝階段，具有熱休克特征的高溫抑制為主的發酵后期階段，共三個階段。針對現有基因工程菌株的具體問題，本發明提出在三個階段用上述各階段篩選出的目標基因轉錄上調的特征啟動子全面啟動木糖利用的七基因或者主要基因的轉錄調控，讓目標基因在三個階段的每一個階段都能得到高效的表達，從而讓纖維素底物更加高效地轉化為纖維素乙醇。綜上所述，我們提出了這樣的三階段轉錄調控理論(three stage transcription regulations,簡稱為 TSTR)。本理論的創新點及改進之處:1第一次優化總結并提出了三階段轉錄調控關鍵基因提高纖維素乙醇產量的理論體系；2第一次將熱休克啟動子HSP26和TCA循環啟動子KGDl等相關啟動子用于介導木糖利用的關鍵基因XR/XDH/XK/TAL1提高乙醇的產量；3本發明實現了通過快速耗盡葡萄糖來降低葡萄糖在乙醇發酵過程中對木糖的代謝抑制；4我們構建的工程菌株WXYlO在各5%左右的混合糖發酵過程中，60小時左右實現了 0.48g乙醇/g總糖的糖醇轉化率，達到了理論最大值的94%，具有一定的工業化潛力，處于國內外前沿水平。
附圖 說明

圖1顯示了在45g/L (葡萄糖+木糖)厭氧發酵各時間段各酵母菌株WT⑷，WXY3⑶，WXY4 (C)，WXY5⑶的乙醇代謝圖譜。圖2顯示對TCA循環基因和HSP家族基因考察的結果，在50g/L (葡萄糖+木糖)厭氧發酵各時間段各酵母菌株的乙醇代謝圖譜。圖3顯示為菌株發酵結果，在45g/L和50g/L (葡萄糖+木糖)厭氧發酵各時間段各酵母菌株的乙醇代謝圖譜。圖4為WXY7和WXYlO在50g/L葡萄糖和50g/L木糖的培養基下進行發酵的結果。圖5顯示各菌株在￥^)培養基中發酵12小時，菌株訂1乂￥(3-54)和1乂￥(6，7，10, B)的基因XR/XDH/XK/TAL1的相對轉錄水平。釀酒酵母WXYlO (Saccharomyces cerevisiae),于 2013 年 I 月 23 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏編號是:CGMCC N0.7191。
具體實施例方式實施例11、混合糖共發酵菌株的構建出發菌株WT來自安琪酵母公司的釀酒酵母工業菌株，經過從工業二倍體拆分孢子轉化為單倍體，經過發酵篩選具有更好發酵特性的優勢菌株，作為我們試驗的原始工業出發菌株。將質粒p61轉入WT，得到WXY1，其菌株含有兩基因pADHl-RPEl和pPGKl_XDH ；將質粒P62轉入WXY1，得到WXY2，該菌株額外含有pADHl_XR4m和pPGKl_XK ;將質粒p64轉入WXY2，得到WXY3，該菌株額外含有多拷貝的pPGKl-RKIl和pADHl_TALl，并且該菌株能初步利用木糖產生乙醇；將質粒PUC-3XK270R轉入WT，得到WXY4，該菌株含有三基因pADHl-XR(K270R)/pPGKl-XDH/pPGKl-XK,能初步利用木糖產生乙醇；將質粒 pUC_3XK270R轉入WXY3，得到WXY5，該菌株能很好地利用木糖，產生更多的乙醇。圖1顯示了工程菌株WT和WXY (3-5)在約45克/升葡萄糖和45g/L的木糖培養基的發酵結果。WT菌株在24小時后，消耗完了 43.5g/L的葡萄糖，在發酵結束后利用了約8g/L (17.8%)木糖，產生了約21.4g/L的乙醇和2.7g/L的木糖醇(圖1A)。WXY4在24小時內完全消耗43.5g/L的葡萄糖，在發酵結束時利用了約16g/L (35.7%)的木糖，產生了 26.4g/L的乙醇和1.7g/L木糖醇(圖1C)。發酵結束后，菌株WXY3和WXY5消耗了 16.2(36%)和31.4 (70.l%)g/L的木糖，產生了 3.0和1.5g/L木糖醇，并產生較高的25.1和34.2g/L的乙醇，分別為(圖1B和D)。與WT和WXY3菌株相比，WXY4和WXY5擁有更多的細胞數量(圖1E)。相關的菌株基因型和發酵數據也參見表I和表2。與發表的工業菌株基因修飾策略相比，本發明在整體水平上，特別是關鍵基因拷貝數量進行了優化通過RT-PCR證實了基因拷貝數目的增加及相關基因得到了相對高的表達量:WXY5有兩拷貝突變體XR(K270R)和 XR (K270S/N272P/S271G/R276F)，兩拷貝野生型 XDH，兩拷貝 XK，多拷貝 TALl 及其他相關基因。厭氧批發酵結果顯示，混合糖到乙醇的轉化率為0.39g/g總糖。
表I質粒
權利要求
1.一種三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法，其特征在于，所述方法包括通過構建基因XR、XDH、XK、RPEl、RKIl和TALl的表達質粒，在釀酒酵母中表達上述基因的步驟，其中，用KGDl啟動子介導限速基因》(，用HSP26啟動子介導關鍵限速基因TALl。
2.根據權利要求1所述的三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法，其特征在于，對于基因XDH使用啟動子pPGKl，對于基因RPEl使用啟動子pADHl，對于RKII使用啟動子PGKl，對于基因XR使用啟動子pADHl。
3.根據權利要求1所述的三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法，其特征在于，基因XR的序列如SEQ ID N0.1所示，基因XDH的序列如SEQ ID N0.2所示，基因XK的序列如SEQ ID N0.3所示，基因RKIl的序列如SEQ ID N0.4所示，基因TALl的序列如SEQID N0.6 所示。
4.根據權利要求1所述的三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: Cl)將質粒p61轉入釀酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有兩基因pADHl-RPEl和pPGKl-XDH ； (2)將質粒p62轉入WXYl，得到WXY2，該菌株額外含有pADHl_XR和pPGKl_XK ； (3 )將質粒p64轉入WXY2，得到WXY3，該菌株額外含有多拷貝的pPGKl-RKI I和pADHl-TALl，并且該菌株能初步利用木糖產生乙醇； (4)將質粒pUC-3XK轉入釀酒酵母WT，得到WXY4，該菌株含有三基因pADHl_XR/pPGKl-XDH/pPGKl-XK，能初步利用木糖產生乙醇；將質粒pUC_3XK轉入WXY3，得到WXY5，該菌株能很好地利用木糖，產生更多的乙醇； (5)pv3質粒的構建過程如下:首先將TALl結構基因連接在pBluscript原始質粒上，接下來依次將啟動子CREl，啟動子KGDIr，XK-ORFr，選擇標記基因RUR結構，啟動子HSP26r，終止子CREl克隆進來，形成pv3質粒，其表型見表I，整合插入位點為CREl結構基因，被分別轉進WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7 ； (6)將pUC-3X(野生型XR)分別轉入酵母菌株釀酒酵母WT，WXY3，WXY6，分別得到工程菌株 WXY8，WXY9, WXYlO。
5.三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的基因工程菌株，其保藏編號為:CGMCCN0.7191。
6.一種通過生物發酵制備乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括發酵菌株CGMCCN0.7191的步驟。
全文摘要
本發明涉及乙醇的生物制備領域，具體地涉及三階段基因轉錄調控提高纖維素乙醇產量的方法及基因工程菌株。所述方法包括通過構建基因XR、XDH、XK、RPE1、RKI1和TAL1的表達質粒，在釀酒酵母中表達上述基因的步驟，其中，用KGD1啟動子介導限速基因XK，用HSP26啟動子介導關鍵限速基因TAL1。本發明將纖維素酒精發酵過程分為厭氧的葡萄糖發酵階段，好氧的木糖呼吸代謝階段，具有熱休克特征的高溫抑制為主的發酵后期階段，共三個階段。讓目標基因在三個階段的每一個階段都能得到高效的表達，從而讓纖維素底物更加高效地轉化為纖維素乙醇。
文檔編號C12R1/865GK103146741SQ20131004134
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月1日 優先權日2013年2月1日
發明者蕭偉, 曹利民, 湯興良, 田雪蕾 申請人:首都師范大學