從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄pcr方法
【專利摘要】本發明涉及一種從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，用PCR檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測；步驟一：提取臨床標本中的總RNA；步驟二：以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA；步驟三：針對結核菌小RNA檢測引物和步驟二中合成的cDNA進行PCR檢測。
【專利說明】從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法。
【背景技術】
[0002]現有技術中，常用的結核菌感染檢測方法包括CSF抗酸桿菌涂片法和結核分枝桿菌培養檢測法。CSF抗酸桿菌涂片法存在的不足之處在于陽性率低，約10%，且需要檢材中的細菌> IOVmi才能找到，特異性差。結核分枝桿菌培養檢測法存在的不足之處在于操作復雜，培養時間較長，需4~8周，且陽性率低，多在20~30%。
【發明內容】
[0003]本發明的發明目的在于提供一種從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，操作簡單，耗時短，陽性率高。
[0004]實現本發明目的的技術方案:
[0005]一種從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于:用PCR檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測。
[0006]步驟一:提取臨床標本中的總RNA ；
[0007]步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA ；
[0008]步驟三:針對結核菌小RNA檢測引物和步驟二中合成的cDNA進行PCR檢測。
[0009]優選地，步驟三中PCR反應體系包括2倍濃縮PCR反應緩沖液、dNTP、結核菌小RNA檢測引物、步驟二中合成的cDNA模板和DNA聚合酶。
[0010]優選地，步驟三中PCR反應條件為，98°C 10秒，68°C 30秒，重復45個循環；PCR結果經過瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色后，在紫外燈下顯色拍照，有陽性條帶的標本為結核感染患者。
[0011]優選地，步驟三中PCR反應體系為:2倍濃縮PCR反應緩沖液25微升、dNTP0.4mM、結核菌小RNA檢測引物I微升、步驟二中合成的cDNA模板I微升、DNA聚合酶1.25單位，加去離子水補充體積至50微升。
[0012]結核菌小RNA檢測引物可以為以下各組引物其中的一組:[0013]第一組:正向引物 SEQ ID N0.1:5'-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3'[0014]反向引物SEQ ID N0.2:5'-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3[0015]第二組:正向引物 SEQ ID N0.3:5'-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3'[0016]反向引物SEQ ID N0.4:5'-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3[0017]第三組:正向引物 SEQ ID N0.5:5'-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3'[0018]反向引物SEQ ID N0.6:5'-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3[0019]第四組:正向引物 SEQ ID N0.7:5'-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3'[0020]反向引物SEQ ID N0.8:5'-CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3[0021]第五組:正向引物 SEQ ID N0.9:5'-ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3'[0022]反向引物 SEQ ID N0.10:5'-AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-3'[0023]第六組:正向引物 SEQ ID N0.11:5'-CCACGTACTCGATCCCGTTG-3'[0024]反向引物 SEQ ID N0.12:5'-ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-3'[0025]第七組:正向引物 SEQ ID N0.13:5'-AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3'[0026]反向引物 SEQ ID N0.14:5'-CGTGGGTATACCGAGGTCCA-3'[0027]第八組:正向引物 SEQ ID N0.15:5'-CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3'[0028]反向引物 SEQ ID N0.16:5'-AGGGACGACCCCCGCCAGGG-3'[0029]第九組:正向引物 SEQ ID N0.17:5'-CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3'[0030]反向引物 SEQ ID N0.18:5'-CGCACGTCAGCCCCACCCGT-3'[0031]本發明具有的有益效果:[0032]本發明用PCR檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測，并對PCR反應體系和反應條件、結核菌小RNA檢測引物進行特有設計，檢測操作簡單、耗時短、陽性率高(可達60%-70%)，便于大規模篩查檢測。結核菌的小RNA游離存在于細菌外，標本容易獲得，
無需結核菌培養，更安全、快速，大大縮短檢測時間；結核菌的小RNA可以抵抗RNA酶的降解作用，可穩定存在，有效提高了檢測的敏感性。本發明對PCR反應體系和反應條件的特有設計，可以高靈敏度的檢測標本中低水平的結核菌小RNA。本發明根據結核菌的小RNA特點，對結核菌小RNA檢測引物進行設計，序列更加優化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1為各組引物對結核桿菌感染患者血漿標本檢測結果圖；
[0034]圖2為不同來源的血漿使用同一組引物的檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0035]獲取臨床標本:采集患者外周血3-5毫升，1000-1500轉/分，水平離心10分鐘。小心吸取上層血漿200微升至無菌1.5毫升離心管中。其他液體樣本經13000轉/分’離心10分鐘，小心吸取上層液體200微升至無菌1.5毫升離心管中。
[0036]步驟一:提取臨床標本的總RNA。
[0037]200微升臨床標本中，加入500微升酚胍RNA提取液，充分混勻，室溫靜置5分鐘。加入300微升氯仿，混勻后12000轉/分離心10分鐘。小心吸取上層澄清液體至一無菌2毫升離心管中。加入900微升丙酮，混勻后用硅膠膜吸附。蛋白洗液沖洗一次，100%乙醇和80 %乙醇依次沖洗一次，待乙醇揮發后，用TE或去離子水洗脫RNA，收集與無菌1.5毫升離心管中，即為臨床標本中的總RNA。
[0038]步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA。
[0039]反應體系:總RNA取10微升，9堿基隨即引物I微升，dNTPl微升，逆轉錄酶100單位，5倍濃縮反應緩沖液4微升，0.1M 二硫蘇糖醇I微升，去離子水補充體積到20微升。
[0040]反應條件:50°C—小時，75°C 15分鐘后，低溫保存，即為cDNA。
[0041]步驟三:針對結核菌小RNA檢測引物和步驟二中合成的cDNA進行PCR檢測。
[0042]PCR反應體系:2倍濃縮PCR反應緩沖液25微升，dNTP0.4mM,結核菌小RNA檢測引物I微升，cDNA模板I微升，DNA聚合酶1.25單位，加去離子水補充體積至50微升。[0043]PCR反應條件:98°C 10秒，68°C 30秒，重復45個循環。
[0044]結果判定:PCR結果經過瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色后，在紫外燈下顯色拍照，有陽性條帶的標本為結核感染患者。圖1中，M泳道為分子量標準，1-9泳道為對應第一組-第九組引物組的檢測結果。圖2中，M泳道為分子量標準，1-11泳道為臨床結核患者，12泳道為正常人標本。
[0045]結核菌小RNA檢測引物可以為以下各組引物其中的一組:
[0046]第一組:正向引物SEQIDN0.1:5'-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3'[0047]反向引物SEQIDN0.2:5/-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3'[0048]第二組:正向引物SEQIDN0.3:5/-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3'[0049]反向引物SEQIDN0.4:5,-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3'[0050]第三組:正向引物SEQIDN0.5:5/-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3'[0051]反向引物SEQIDN0.6:5/-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3'[0052]第四組:正向引物SEQIDN0.7:5'-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3'[0053]反向引物SEQIDN0.8:5/-CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3'[0054]第五組:正向引物SEQIDN0.9:5/-ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3'[0055]反向引物SEQIDN0.10:5-AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-3[0056]第六組:正向引物SEQIDN0.11:5/-CCACGTACTCGATCCCGTTG-3'[0057]反向引物SEQIDNO? 12:5-ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-3[0058]第七組:正向引物SEQIDN0.13:5/-AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3'[0059]反向引物SEQIDN0.14:5-CGTGGGTATACCGAGGTCCA-3[0060]第八組:正向引物SEQIDN0.15:5/-CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3'[0061]反向引物SEQIDN0.16:5-AGGGACGACCCCCGCCAGGG-3[0062]第九組:正向引物SEQIDN0.17:5/-CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3'[0063]反向 引物SEQIDN0.18:5-CGCACGTCAGCCCCACCCGT-3
【權利要求】
1.一種從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于:用PCR檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測。
2.根據權利要求1所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于:步驟一:提取臨床標本中的總RNA ；步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA ；步驟三:針對結核菌小RNA檢測引物和步驟二中合成的cDNA進行PCR檢測。
3. 根據權利要求2所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于:步驟三中PCR反應體系包括2倍濃縮PCR反應緩沖液、dNTP、結核菌小RNA檢測引物、步驟二中合成的cDNA模板和DNA聚合酶。
4.根據權利要求3所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于:步驟三中PCR反應條件為，98°C 10秒，68°C 30秒，重復45個循環；PCR結果經過瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色后，在紫外燈下顯色拍照，有陽性條帶的標本為結核感染患者。
5.根據權利要求所述4的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于:步驟三中PCR反應體系為'2倍濃縮PCR反應緩沖液25微升、dNTP0.4mM、結核菌小RNA檢測引物I微升、步驟二中合成的cDNA模板I微升、DNA聚合酶1.25單位，加去離子水補充體積至50微升。
6.根據權利要求1至5任何一項所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于:結核菌小RNA檢測引物可以為以下各組引物其中的一組:第一組第二組第三組第四組第五組第六組第七組第八組第九組正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQID N0.1:5/ -TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3'ID N0.2:5/ -TGGGTTGGACGACTCGACGT-3'ID N0.3:5/ -ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3'ID N0.4:5/ -AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3'ID N0.5:5/ -CGGCCTGCGTATGACCCATA-3'ID N0.6:5/ -AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3'ID N0.7:5/ -CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3'ID N0.8:5/ -CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3'ID N0.9:5/ -ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3'ID N0.10:5/ -AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-31ID N0.11:5/ -CCACGTACTCGATCCCGTTG-3'ID N0.12:5/ -ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-31IDN0.13:5/ -AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3'ID N0.14:5/ -CGTGGGTATACCGAGGTCCA-31ID N0.15:5/ -CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3;ID N0.16:5/ -AGGGACGACCCCCGCCAGGG-31ID N0.17:5/ -CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3'ID N0.18:5/ -CGCACGTCAGCCCCACCCGT-31
【文檔編號】C12Q1/04GK103571938SQ201310068037
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年2月25日 優先權日:2013年2月25日
【發明者】張鳳民, 付英梅, 宋武琦, 錢均, 李玉軍, 李文靜 申請人:哈爾濱醫科大學