專利名稱：鼠肝炎冠狀病毒的gfp示蹤系統及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鼠肝炎冠狀病毒的GFP示蹤系統及其應用，特別涉及一種在野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株基因組中插入GFP后得到的重組鼠肝炎冠狀病毒。
背景技術：
冠狀病毒是目前已知的基因組最大的單股正鏈RNA病毒，主要引起呼吸道和消化道的疾病，是多種經濟動物傳染性疾病的病原體，常常導致巨大的社會經濟損失。自2003年一種新的SARS-CoV被確定為烈性傳染病SARS的病原體以來，冠狀病毒(Coronavirus)便成為全球生命科學研究的熱點之一。綠色突光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)是來源于發光水母(aequoreavictoria)的一種功能獨特的蛋白質，分子量為27kD，由238個氨基酸組成。自1992年Prasher等克隆到GFP的cDNA以來,GFP示蹤技術已廣泛應用于分子生物學研究領域。結合GFP熒光示蹤的技術手段，可分別在細胞和動物水平，對標記分子或物質進行熒光示蹤監測和定量檢測。目前尚未有對鼠肝炎冠狀病毒進行GFP示蹤的相關報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種鼠肝炎冠狀病毒的GFP示蹤系統及其應用。所述鼠肝炎冠狀病毒的GFP示蹤系統即為一種表達綠色熒光蛋白的重組鼠肝炎冠狀病毒。
本發明所提供的重組鼠肝炎冠狀病毒，是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進行替換或插入得到的重組病毒；所述替換為:將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的片段a中的任一片段(可由I個、2個或更多個核糖核苷酸組成)替換為片段b ；所述插入為:在所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的所述片段a中的任一位點處插入所述片段b;所述片段a為序列表中序列I編碼的RNA ;所述片段b為含有綠色熒光蛋白編碼基因的DNA片段編碼的RNA。所述綠色熒光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。在本發明中，所述綠色熒光蛋白的編碼基因的序列為序列表中序列3的第142-861 位。進一步，所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3。在本發明的一個實施例中，所述野生型鼠肝炎冠狀病毒具體為鼠肝炎冠狀病毒A59 株。在本發明的一個實施例中，所述重組鼠肝炎冠狀病毒是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進行替換得到的重組病毒；具體的，所述替換中，所述“片段a中的任一片段”為所述片段a中的序列I的第468-765位核苷酸對應的RNA片段。由于所述野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組RNA經反轉錄后得到的cDNA序列為GenBank號為NC_001846.1的序列(Up date:2012_8_23)，相應的，所述重組鼠肝炎冠狀病毒的基因組RNA經反轉錄后得到的cDNA序列為GenBank號為NC_001846.1的序列(Update:2012-8-23)的第27967-28264位(對應序列I的第468-765位)替換為序列表中序列3，得到的核苷酸序列。本發明的另一個目的是提供一種制備所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法。本發明所提供的制備所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法具體可包括如下步驟:(a)將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉錄得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別克隆至質粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質粒甲；所述待取代核苷酸序列或待插入位點位于序列I中；(b)用含所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉錄得到的cDNA序列的痘苗病毒載體甲感染CV-1細胞后，用步驟(a)獲得的重組質粒甲轉染所述CV-1細胞，所述痘苗病毒載體甲與所述重組質粒甲通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒載體甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒載體甲中的所述待插入位點處插入所述gpt基因的重組痘苗病毒載體乙；(c)將步驟(b)中的所述重組痘苗病毒載體乙中的所述gpt基因替換為所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段，得到重組質粒乙；(d)用步驟(b)得到的重組痘苗病毒載體乙感染新的CV-1細胞后，用步驟(C)獲得的重組質粒乙轉染所述新的CV-1細胞，所述重組痘苗病毒載體乙與所述重組質粒乙通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段替代所述重組痘苗病毒載體乙中所述gpt基因的重組痘苗病毒載體丙；(e)提取步驟(d)得到的重組痘苗病毒載體丙的基因組DNA，通過體外轉錄，獲得所述重組痘苗病毒載體丙的基因組的全長RNA ;將所述全長RNA轉染BHK-21細胞，培養轉染后的細胞，獲得所述重組鼠肝炎冠狀病毒。在上述方法中，步驟(a)中所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別為 GenBank 號為 NC_001846.1 的序列(Up date:2012-8-23)的第 27500-27966位(對應序列I的第1-467位)和第28265-28700位(對應序列I的第766-1201位)。在本發明的一個實施例中，制備所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法具體包括如下步驟:(a)將GenBank號為NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(Up date:2012-8-23)的第27500-27966位(對應序列I的第1-467位，命名為上游同源臂)和第28265-28700位(對應序列I的第766-1201位，命名為下游同源臂)分別克隆至質粒pSV2-gpt的gpt基因的上游(如酶切位點Not I和Sal I之間)和下游(如酶切位點Pst I和BamH I之間)，得到重組質粒，將其命名為pGPT-1N_0RF4 ；(b) 用含鼠肝炎冠狀病毒(MHV)A59株基因組cDNA的痘苗病毒載體vacciniavirus inf-1 (v.v.-1nf-1)感染CV-1細胞后,用步驟(a)獲得的重組質粒pGPT_IN_0RF4轉染所述CV-1細胞，所述痘苗病毒載體甲與所述重組質粒PGPT-1N-0RF4通過所述上游同源臂和所述下游同源臂發生同源重組，以所述gpt基因作為陽性篩選標記，獲得以所述gpt基因替代所述V.V.-1nf-Ι中的位于GenBank號為NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(Up date:2012_8_23)的第27967-28264位核苷酸序列的重組痘苗病毒載體，將其命名為V.V-1nf-gpt-1n ；(c)將步驟(a)中的所述重組質粒pGPT-1N-0RF4中的所述gpt基因替換為所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段(序列3)，得到重組質粒，將其命名為pGPT-OUT-GFP ；(d)用步驟(b)得到的重組痘苗病毒載體乙V.V-1nf-gpt-1n感染新的CV-1細胞后，用步驟(c)獲得的重組質粒pGPT-OUT-GFP轉染所述新的CV-1細胞，所述重組痘苗病毒載體V.V-1nf-gpt-1n與所述重組質粒pGPT-OUT-GFP通過所述上游同源臂和所述下游同源臂發生同源重組，以所述gpt基因作為陰性篩選標記，獲得以所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段(序列3)替代所述重組痘苗病毒載體V.V-1nf-gpt-1n中所述gpt基因的重組豆苗病毒載體，將其命名為V.V.-1nf-GFP-GPT-OUT ；(e )提取步驟(d)得到的重組痘苗病毒載體V.V.-1nf-GFP-GPT-OUT的基因組DNA,通過體外轉錄，獲得所述重組痘苗病毒載體V.V.-1nf-GFP-GPT-OUT的基因組的全長RNA ;將所述全長RNA轉染BHK-21細胞，培養轉染后的細胞，獲得所述重組鼠肝炎冠狀病毒(MHV-GFP)0在上述方法的步驟(e)中，所述培養轉染后的細胞，具體為將所述轉染后的細胞(BHK-21)與17CL-1細胞按照1:4的比例混合培養。之后，待細胞出現病變后，收集細胞培養物，感染新的17CL-1細胞，進而獲得所述重組鼠肝炎冠狀病毒(MHV-GFP)。所述重組鼠肝炎冠狀病毒在如下(al)或(a2)中的應用也屬于本發明的保護范圍:(al)制備研究鼠肝炎冠狀病毒感染機制的產品；(a2)制備篩選抗鼠肝炎冠狀病毒藥物的細胞模型。本發明的又一個目的是提供如下(bl)或(b2)的生物材料:(bl)含有所述重組鼠肝炎冠狀病毒的離體動物細胞或重組菌；(b2)含有所述重組鼠肝炎冠狀病毒的基因組RNA或cDNA的載體。在本發明的一個實施例中，所述動物細胞具體為BHK-21細胞。本發明選擇綠色熒光蛋白(GFP)作為示蹤蛋白具有以下優點:1、對細胞既無毒性，也無種屬、組織和位置特異性；2、不需要任何反應底物及其他輔助因子，只需要激發光源的激發即可發光；3、熒光品質穩定，能夠克服穿透、毒素、光漂白，高溫等不利因素。本發明選擇基于痘苗病毒為載體的冠狀病毒反向遺傳學系統，與其他反向遺傳學系統相比，痘苗病毒載體具有其他載體所沒有的優勢。首先，痘苗病毒載體的載容量比較大， 可容納至少26Kb外源序列。其次，插入片段在痘苗病毒中比較穩定，隨著重組痘苗病毒的增殖，可以獲得高拷貝的外源基因。
第三，痘苗病毒載體可介導高頻率的同源重組，便于對基因進行修飾改造。實驗證明，對本發明建立的MHV綠色熒光示蹤系統一重組鼠肝炎冠狀病毒(MHV-GFP)感染小鼠肝臟后進行病毒滴度的測定以及肝損傷的分析(谷丙轉氨酶氨酶(ALT)的測定和肝臟病理切片的觀察)結果顯示，MHV-WT和MHV-GFP病毒感染小鼠后復制能力和致病力均無顯著差異，說明重組病毒MHV-GFP可與野生型病毒平行應用于MHV的相關研究。另外，本發明所提供的重組病毒MHV-GFP由于綠色熒光蛋白的信號放大效應，可以極大的提高病毒監測的靈敏度，能夠對病毒在小鼠臟器中的存在與否和病毒的增值情況進行直觀初步的觀測，設備要求簡單。因此，利用動物模型開展MHV的感染和抗病毒治療研究時，MHV示蹤系統可以對傳統的病毒學研究方法起到很好的輔助和補充作用，不僅極大地擴展了經典模型系統在細胞水平和動物水平的應用，同時，也為建立新型低劑量病毒亞臨床感染動物模型提供了一個新思路。再則，本發明為抗冠狀病毒藥物的篩選等應用研究也提供新的技術平臺。
圖1為重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n的PCR鑒定結果。其中，泳道Ml為DNA分子量標準Markerl5000 ;泳道M2為DNA分子量標準Marker2000 ;泳道I和4為用引物對PSC40/PSC 55進行擴增的結果；泳道2和5為用引物對GPT L-F/PSC 55進行擴增的結果；泳道3和6為用引物對GPTR-F/PSC 55進行擴增的結果。圖2為重組痘苗病毒V.V.-1nf-GFP-GPT-OUT的PCR鑒定結果。其中，泳道Ml為DNA分子量標準Marker2000 ;泳道M2為DNA分子量標準Markerl5000 ;泳道I和5為用引物對GPT L-F/PSC54進行擴增的結果；泳道2和6為用引物對GPT R-F/PSC54進行擴增的結果；泳道3和7為用引物對GFP UP L/PSC 54進行擴增的結果；泳道4和8為用引物對GFP UP R/PSC 54進行擴增的結果。圖3為重組病 毒MHV-GFP測序鑒定結果示意圖。圖4為重組病毒MHV-GFP的一步生長曲線。其中，WT表示野生型MHV A59株；GFP表示重組病毒MHV-GFP。圖5為重組病毒MHV-GFP感染細胞后的綠色熒光圖。圖6為腹腔感染病毒后小鼠體重變化情況，劑量為3 X IO6PFU/只。圖7為各組小鼠血清ALT濃度測定結果，劑量為3 X IO6PFU/只。其中，WT表示野生型MHV A59株；GFP表示重組病毒MHV-GFP。圖8為各組小鼠肝臟病毒滴度測定結果，劑量為3 X IO5PFU/只。其中，*表示未檢測到病毒；WT表示野生型MHV A59株；GFP表示重組病毒MHV-GFP。圖9為各組小鼠肝臟病理切片(200X)，劑量為3X IO5PFU/只，感染時間為5天。其中，A為PBS組小鼠；B為MHV-WT感染小鼠；C為MHV - GFP感染小鼠。圖10為重組病毒MHV-GFP感染小鼠肝臟的綠色熒光圖，劑量為3X105PFU/只。其中，A為PBS組小鼠肝臟；B為MHV-GFP感染小鼠Ilh肝臟熒光；C為MHV-GFP感染小鼠16h肝臟熒光；D為MHV-GFP感染小鼠24h肝臟熒光。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。毒株、細胞與小鼠:含鼠肝炎冠狀病毒(mouse hepatitis virus, MHV) A59株基因組全長cDNA的痘苗病毒載體(vaccinia virus inf-1,簡稱v.v.-1nf_l)由英國布里斯托大學StuartG.Siddell教授惠贈，記載在“林磊，吳曉燕，常國輝，祝慶余.鼠肝炎冠狀病毒非結構蛋白I內保守序列LLRKxGxKG的功能研究.解放軍醫學雜志.2010，35 (5):508-512.”一文中，公眾可從中國人民解放軍疾病預防控制所獲得。質粒pSV2-gpt (購自ATCC公司，產品目錄號=37145 ),質粒phMGFP (購自Promega公司，產品目錄號:E6421)、CV-1細胞(購自ATCC，產品目錄號:CCL_70)和BHK-21細胞(購自ATCC公司，產品目錄號:CCL-10) ；17Clone-l (17CL-1)細胞(參見文獻:Sturman，L S.，and K.K.Takemot0.1972.Enhanced growth of a murine coronavirus intransformed mouse cells.1nfect.1mmun.6:501 - 507.)、D980R 細胞(參見文獻:Kerr, S.M., and G.L.Smith.1991.Vaccinia virus DNA ligase is nonessential for virusrepIication:recovery of plasmids from virus-1nfected cells.Virology,180:625 -632.)015-18g，6_8周齡的雌性Balb/c小鼠購自維通利華實驗動物技術有限公司。主要試劑和材料:DMEM 培養基，胎牛血清，Platinum Pfx DNA Polymerase, Suoerscript III 反轉錄酶，脂質體(Lipofectamine 2000)轉染試劑等均購自Invitrogen公司；RiboMAX LargeScale RNA Production System T7, Ribo m7G Cap Analog購自 Promega公司；Mycophenolicacid (MPA), Hypoxanthine, Xanthine, 6-Thioguanine (6-TG), Gelrite Gellan Gum 等均購自sigma公司；Doxycycline hyclate購自BioChemika ；Eag I限制性內切酶購自NEB公司；RNeasy Mini Kit 購自 QIAGEN。實施例1、GFP標記的重組鼠肝炎冠狀病毒的構建一、同源重組質粒的構建1、重組質粒pGPT-1N-0RF4的構建及鑒定將野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(GenBank號:NC_001846.1，Up date:2012-8-23)的第27500-27966位(對應序列I的第1-467位，命名為上游同源臂)和第28265-28700位(對應序列I的第766-1201位，命名為下游同源臂)分別克隆至質粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質粒pGPT-1N-0RF4。具體操作如下:(I)痘苗病毒載體vaccinia virus inf_l基因組DNA的提取由于痘苗病毒載體vaccinia virus inf-1 (簡稱v.v.-1nf_l)含野生型鼠肝炎冠狀病毒(mouse hepatitis virus，MHV) A59株基因組全長cDNA，所以提取其基因組DNA作為模板，用于擴增所述上游同源臂和所述下游同源臂。具體操作如下:
將痘苗病毒載體vaccinia virus inf_l用DMEM完全培養基進行適當的稀釋后，加入到培養至單層的BHK-21細胞中(M0I=1)，于37°C培養，每日觀察細胞病變。待細胞病變達到+++ (約3d)時，用細胞刮刮取病變細胞，2000rpm離心8min后，取細胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或_70°C凍存備用。
病毒DNA提取步驟如下:I)取細胞沉淀，加入一定體積的 Buffer A (IOmM Tris-Cl pH9.0, ImM EDTA)充分懸浮，凍融3次，并超聲波處理3分鐘，充分裂解細胞釋放病毒。2)加 1/10 體積 0.5% (0.5g/100ml)的胰蛋白酶，37°C水浴，消化 20min。3)將上述反應液加入到含有蔗糖墊(用ImM的pH9.0的Tris配制)的超速離心管中，16000rpm,4°C,90min離心。棄上清,用400μ1 Buffer A重懸沉淀,儲存于4°C冰箱。4)加適量RNase-free DNase (具體用量參照產品說明書)到病毒重懸液，37°C，20min,以消化病毒外的細胞DNA。然后加入終濃度IOmM的EDTA，65 V，IOmin終止消化。5)向上述反應液中加入I倍體積的2XProteinase K Digestion Buffer和適量Proteinase K (終濃度 50 μ g/ml), 50°C溫育 2h。6)加I倍體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合液(25:24:1)，輕輕顛倒混合均勻，13，OOOrpm離心5min。將上層水相轉入新管(注意不要吸到中間蛋白質層)。7)向新管中加I倍體積的氯仿/異戊醇(體積比24:1)，輕輕顛倒混合均勻，14, OOOrpm離心5min。將上層水相轉入新管。8)加2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA,輕輕顛倒混合均勻，14, OOOrpm離心15min。9)棄掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片層，14，OOOrpm離心lOmin。用移液器完全移除液體，加40-100 μ I無RNase水溶解DNA。10)提取完 成后，于260nm處測定其OD值，以判斷DNA濃度和純度，并_70°C凍存備用。(2)引物的設計與合成根據野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(GenBank:NC_001846.1，Up date:2012-8-23)設計并合成如下兩個引物對:擴增上游同源臂的引物對:L-UP:5，-GCGGCCGCCTTCAATACCTAATCCACCCGAC-3，(下劃線部分為酶切位點 Not I的識別序列，其后的序列為GenBank:NC_001846.1的第27500-27522位，即序列I的第1_23位)L-down:5’-GTCGACGGTAGCAATGAGAATGCTATAAATTG_3’(下劃線部分為酶切位點 SalI的識別序列，其后的序列為GenBank:NC_001846.1的第27941-27966位的反向互補序列，即序列I的第442-467位的反向互補序列)擴增下游同源臂的引物對:R-up:5，-CTGCAGAGAGGTTTTGATTATAGTAC-3，(下劃線部分為酶切位點 PstI 的識別序列，其后的序列為GenBank:NC_001846.1的第28265-28284位，序列I的第766-785位)R-down:5’ ~GGATCCTCGAGCTGCGTGGCCCTAAAAAG~3 (下劃線部分為酶切位點 BamHI的識別序列,其后的序列為GenBank:NC_001846.1的第28678-28700位的反向互補序列，序列I的第1179-1201位的反向互補序列)(3)重組質粒pGPT-1N-0RF4的構建及鑒定以步驟(I)獲得的痘苗病毒載體vaccinia virus inf_l基因組DNA為模板，以步驟(2)設計合成的兩個引物對分別進行PCR擴增，得到帶有相應酶切位點的上游同源臂和下游同源臂。首先用限制性內切酶Not I和Sal I雙酶切所述上游同源臂，將其與經過同樣雙酶切的pSV2-gpt質粒大片段相連，獲得中間質粒；接著用限制性內切酶Pst I和BamHI雙酶切所述下游同源臂，將其與經過同樣雙酶切的所述中間質粒大片段相連，獲得重組質粒，經測序鑒定在pSV2-gpt質粒的酶切位點Not I和Sal I之間插入了 GenBank號為NC_001846.1 (Up date:2012-8-23)的序列的第27500-27966位核苷酸，同時在酶切位點Pst I 和 BamH I 之間插入了 GenBank 號為 NC_001846.1 (Update:2012-8-23)的序列的第28265-28700位核苷酸的重組質粒為陽性，將其命名為pGPT-1N_0RF4。2、重組質粒pGPT-OUT-GFP的構建及鑒定(I) GFP基因片段的獲得從質粒phMGFP中獲得本發明所需的綠色熒光蛋白的編碼基因，并在其兩端添加上構建重組質粒所需的酶切位點。具體操作如下:利用GFP特異引物GFP up和GFP down從質粒phMGFP中獲得帶有相應酶切位點的GFP基因片段。GFP up: 5’ -GTCGACATGGACTACCAAGACGATGACG-3，(下劃線部分為酶切位點 Sal I的識別序列，整個序列為序列3的第1-28位的序列)GFP down: 5，-CTGCAGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’(下劃線部分為酶切位點Pst I的識別序列，整個序列為序列3的第843-873位反向互補序列)PCR擴增產物的序列為序列表中的序列3。(2)重組質粒pGPT-OUT-GFP的構建及鑒定用限制性內切酶Sal I和Pst I雙酶切步驟(I)獲得的GFP基因片段，與將其與經過同樣雙酶切的步驟I構建的重組質粒PGPT-1N-0RF4的載體大片段相連，獲得重組質粒，經測序鑒定將重組質粒PGPT-1N-0RF4的酶切位點Sal I和Pst I之間的gpt基因取代為序列表中序列3的第7-867位核苷酸的重組質粒為陽性，將其命名為pGPT-OUT-GFP。序列表中序列3的第142-861位為綠色熒光蛋白的編碼基因。二、重組痘苗病毒的構建1、重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n的構建及鑒定利用冠狀病毒的痘苗病毒載體反向遺傳學系統，通過感染-轉染CV-1細胞，使痘苗病毒載體vaccinia virus inf-1與重組質粒pGPT_IN_0RF4通過上游同源臂和下游同源臂發生同源重組，以E.Coli gpt基因作為陽性篩選標記，利用蝕斑純化，獲得以所述gpt基因替代所述vaccinia virus inf-1中的位于GenBank號為NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(Up date =2012-8-23)的第27968-28264位核苷酸序列的重組痘苗病毒載體V.V-1nf-gpt-1n。具體操作如下:(I) GPT-1N同源重組細胞培養物的獲得將CV-1細胞按照1:2的比例由75cm2培養瓶傳至6孔板內，繼續培養至80_90%，感染痘苗病毒載體vaccinia virus inf-1 (MOI=I )，37 °C吸附lh，然后吸除病毒液，獲得感染后的CV-1細胞；按照脂質體2000轉染試劑的說明書，將步驟一獲得的重組質粒PGPT-1N-0RF4轉染所述感染后的CV-1細胞，繼續培養2_3d，直至細胞病變完全，反復凍融后收集細胞培養物，得到GPT-1N同源重組細胞培養物，于_70°C保存備用。
(2) GPT陽性篩選GPT陽性的DMEM培養基(pH7.0):由霉酚酸、次黃嘌呤、黃嘌呤和DMEM培養基組成；所述霉酚酸在GPT陽性的DMEM培養基中的終濃度為25 μ g/ml，所述次黃嘌呤在GPT陽性的DMEM培養基中的終濃度為15 μ g/ml，所述黃嘌呤在GPT陽性的DMEM培養基中的終濃度為 250 μ g/ml ο2XMEM 培養基(ρΗ7.0):將 100mll0XMEM、10mll00XMEM 非必需氨基酸和 IOOml
胎牛血清混合后，用水定容至500ml。將CV-1細胞按照1:2的比例由75cm2培養瓶傳至6孔板內，于37°C 5%C02的條件下培養，至80%匯合度時，換成GPT陽性的DMEM培養基繼續培養24h。取上述步驟(I)獲得的GPT-1N同源重組細胞培養物，反復凍融3次后，用GPT陽性的DMEM培養基稀釋IO倍，感染上述在GPT陽性的DMEM培養基中培養的CV-1細胞(MOI=I)，37°C吸附lh。其間，將0.25%Gelrite (固化劑，質量百分含量)和2XMEM培養基預熱至56°C，且在2 XMEM培養基中加入GPT陽性篩選藥物(霉酚酸、次黃嘌呤和黃嘌呤，所述霉酚酸在2XMEM培養基中的終濃度為25 μ g/ml，所述次黃嘌呤在2XMEM培養基中的終濃度為15 μ g/ml，所述黃嘌呤在2XMEM培養基中的終濃度為250 μ g/ml)。待病毒吸附完成后，吸除病毒液，將適量0.25%Gelrite和加入了 GPT陽性篩選藥物的2 XMEM培養基等體積混勻，按3ml/孔加入各孔；室溫防治3-5min，待其凝固后，置于37°C繼續培養，直至觀察到明顯的細胞病變，挑取單個蝕斑，獲得已純化的重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n,于_70°C保存備用。(3)重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n的鑒定A.引物設計根據鼠肝炎冠狀病毒A59 株(Mouse Hepatitis Virus strain A59)的 mRNA 序列(GenBank:NC_001846.1)及GPT基因序列設計鑒定引物如表I。弓丨物由Invitrogen公司合成，用無核酸酶水配制成 濃度為10 μ M的工作液，-20°C保存備用。表I重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n PCR鑒定所用弓丨物
權利要求
1.重組鼠肝炎冠狀病毒，是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進行替換或插入得到的重組病毒； 所述替換為:將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的片段a中的任一片段換為片段b; 所述插入為:在所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的所述片段a中的任一位點處插入所述片段b; 所述片段a為序列表中序列I編碼的RNA ;所述片段b為含有綠色熒光蛋白編碼基因的DNA片段編碼的RNA。
2.根據權利要求1所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述綠色熒光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.根據權利要求2所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述綠色熒光蛋白的編碼基因為序列表中序列3的第142-861位。
4.根據權利要求1-3中任一所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述含有綠色熒光蛋白編碼基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3。
5.根據權利要求1-4中任一所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述野生型鼠肝炎冠狀病毒為鼠肝炎冠狀病毒A59株；或 所述替換中，所述片段a中的任一片段為所述片段a中的序列I的第468-765位核苷酸對應的RNA 片段。
6.根據權利要求5所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述重組鼠肝炎冠狀病毒的基因組RNA反轉錄的cDNA序列為GenBank號為NC_001846.1的序列的第27967-28264位替換為序列表中序列3，得到的核苷酸序列。
7.制備權利要求1-6中任一所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法，包括如下步驟: (a)將權利要求1-5任一中所述的野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉錄得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別克隆至質粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質粒甲； 所述待取代核苷酸序列或待插入位點位于序列I中； (b)用含權利要求1-5任一中所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉錄得到的cDNA序列的痘苗病毒載體甲感染CV-1細胞后，用步驟(a)獲得的重組質粒甲轉染所述CV-1細胞，所述痘苗病毒載體甲與所述重組質粒甲通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒載體甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒載體甲中的所述待插入位點處插入所述gpt基因的重組痘苗病毒載體乙； (c)將步驟(a)中的所述重組質粒甲中的所述gpt基因替換為權利要求1-4任一中所述的含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段，得到重組質粒乙； Cd)用步驟(b)得到的重組痘苗病毒載體乙感染新的CV-1細胞后，用步驟(c)獲得的重組質粒乙轉染所述新的CV-1細胞，所述重組痘苗病毒載體乙與所述重組質粒乙通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段替代所述重組痘苗病毒載體乙中所述gpt基因的重組痘苗病毒載體丙；(e)提取步驟(d)得到的重組痘苗病毒載體丙的基因組DNA，通過體外轉錄，獲得所述重組痘苗病毒載體丙的基因組的全長RNA ;將所述全長RNA轉染BHK-21細胞，培養轉染后的細胞，獲得所述重組鼠肝炎冠狀病毒。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于:所述方法的步驟(a)中，位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別為GenBank號為NC_001846.1的序列的第27500-27966 位和第 28265-28700 位的序列。
9.權利要求1-6中任一所述重組鼠肝炎冠狀病毒在如下(al)或(a2)中的應用: (al)制備研究鼠肝炎冠狀病毒感染機制的產品； (a2)制備篩選抗鼠肝炎冠狀病毒藥物的細胞模型。
10.如下(bl)或(b2)的生物材料: (bl)含有權利要求1-6中任一所述重組鼠肝炎冠狀病毒的離體動物細胞或重組菌； (b2)含有權利 要求1-6中任一所述重組鼠肝炎冠狀病毒的基因組RNA或cDNA的載體。
全文摘要
本發明公開了一種鼠肝炎冠狀病毒的GFP示蹤系統及其應用。本發明所提供系統為重組鼠肝炎冠狀病毒，是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進行替換或插入得到的重組病毒；所述替換為將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的片段a中的任一片段換為片段b；所述插入為在所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的所述片段a中的任一位點處插入所述片段b；所述片段a為序列表中序列1編碼的RNA；所述片段b為含有綠色熒光蛋白編碼基因的DNA片段編碼的RNA。本發明的MHV-GFP可與野生型病毒平行用于研究。另外，由于GFP的信號放大效應，MHV-GFP可極大提高病毒監測靈敏度，為建立新型低劑量病毒亞臨床感染動物模型提供新思路，為抗冠狀病毒藥物篩選等應用研究也提供新技術平臺。
文檔編號C12N1/21GK103146656SQ20131007239
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優先權日2013年3月7日
發明者劉京梅, 常國輝, 孫走南, 柳洪濤, 戶義, 吳曉燕, 張雨, 楊益, 蘇文莉, 何湘 申請人:中國人民解放軍疾病預防控制所