專利名稱：編碼源于肝炎病毒orf2n端區域的加工組分以及抗原性多肽的核酸構建體的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及增強對核酸疫苗免疫應答的策略。本發明尤其涉及表達包含目的抗原性多肽和加工肽、可增強對該目的抗原性多肽的抗體和/或細胞免疫應答的融合蛋白質的核酸構建體。本發明用于設計和開發可調節對抗原免疫應答的各類方法、構建體和載體，并用于診斷、治療和/或預防病變、感染或疾病，例如而不限于癌癥、自身免疫疾病或動物中(包括人及其它哺乳動物、魚和鳥)細菌、病毒或寄生蟲感染。
概述本領域技術人員應當了解，此處所述本發明除明確描述的以外，可以變更和修改。應當理解，此處所述本發明包括所有這類變更和修改。本發明也包括本說明書單獨或一起涉及或指明的所有這類方法、特征、組合物和化合物，以及任何和所有兩個或更多所述方法或特性的組合。
貫穿本說明書，除非上下文需要，否則單詞“包含”及其變化形式應當理解為，暗指包含所述整體或方法，或者一群整體或方法，但不排除其它任何整體或方法，或者整體或方法群。此處所述特定實施方案只是為了用來說明的目的，本發明不受其范圍限制。如此處所述，功能等價的產物、組合物和方法顯然都在本發明范疇之內。
本說明書中作者涉及的出版物的文獻目錄細節匯總于說明書結尾處。此處參考的現有技術，包括任何一個或多個現有技術文件，不作為致謝或建議，所述現有技術是普通常識或組成普通常識的一部分。
此處所用術語“源于”，將用來表明來源于指定物種的特定整體或整體群，而不一定直接從指定來源獲得。
本說明書包含核苷酸和氨基酸序列信息，使用程序PatentIn版本3.0制作，此處在權利要求書之后給出。依據數字指示<210>(其后為序列標識符[例如<210>1、<210>2等等])確定序列表中各個序列。數字指示區<211>、<212>和<213>分別提供的信息指明每個序列的長度、序列類型[DNA、蛋白質(PRT)等等]以及來源生物。說明書中涉及的核苷酸或氨基酸序列用術語“SEQ ID NO”來確定，其后是序列標識符[例如SEQ ID NO1是指序列表中指定為<400>1的序列]。
依據IUPAC-IUB生物化學命名委員會的推薦，命名此處涉及的核苷酸殘基，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，T代表胸苷，Y代表嘧啶殘基，R代表嘌呤殘基，M代表腺嘌呤或胞嘧啶，K代表鳥嘌呤或胸苷，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，W代表腺嘌呤或胸苷，H代表除鳥嘌呤以外的核苷酸，B代表除腺嘌呤以外的核苷酸，V代表除胸苷以外的核苷酸，D代表除胞嘧啶以外的核苷酸，以及N代表任意核苷酸殘基。
背景技術：
“核酸疫苗”是反映通過給予或者DNA(質粒)或者自我復制的亞基因組病毒核酸(病毒復制子)而指導受體細胞中靶(疫苗)蛋白質合成的技術的上位術語。
由于觀測到裸DNA可以在體內誘導抗原合成，以致誘導免疫應答(Woff等，1990)，因此，核酸疫苗，特別是DNA疫苗(其中給予的是編碼蛋白質抗原的質粒DNA，而非蛋白質本身)，已經成為全世界范圍內研究的焦點。利用核酸疫苗的兩個主要潛在優勢為(a)蛋白質在受體細胞中表達后，以天然表位呈遞給免疫系統，以及(b)核酸的化學均一性、易于制備和穩定性，使其特別適合用于聯合疫苗以及用于缺少常規疫苗所需冷藏環節的情況。
大多數有效的“轉統”疫苗針對急性、自限感染，并激發酷似與相應感染的恢復和免疫力相關的免疫應答。即它們依賴針對來自感染物的、以其天然形式呈遞的抗原的正常免疫應答。在這種系統中核酸疫苗具有重要的優勢。過去，為達此目的，一般利用或者(i)活的減毒疫苗生物體(例如薩賓脊髓灰質炎(Sabin polio)疫苗)；(ii)隨后是滅活的野生型生物體(或細菌毒素)(例如索爾克(Salk polio)脊髓灰質炎疫苗)，或者(iii)使用重組DNA技術制造天然抗原(例如乙型肝炎疫苗亞基)。在本發明中，DNA疫苗具有巨大優勢，其靶抗原是在受體細胞內以天然形式合成的。這也適用于基于病毒復制子的投遞系統(例如，Kunjin復制子系統(Khromykh等人，1997；Varnavski等人，1999；Varnavski等人，2000)。但是，針對DNA疫苗所編碼抗原的抗體反應常常很低或者檢測不到。
在針對正常免疫應答所不能清除的感染的預防和治療性疫苗的開發中取得的進展非常少。對于常規無法清除的感染因子，例如HCV和人類免疫缺陷性病毒(HIV)，那些能夠針對相應抗原誘導正常免疫應答的疫苗，幾乎沒有用處。對于通常被視為“自我”的腫瘤特異性抗原也如此，其正常免疫應答就是一種耐受。盡管標準DNA或者復制子疫苗具有許多潛在的優勢，但恰恰因為它們編碼其天然形式的抗原，在所以這些情況下可能是無效的。
已經利用多種方法調節對DNA疫苗的免疫應答，包括(i)與細胞因子或編碼細胞因子的質粒共投遞；(ii)在細菌(和質粒)DNA中普遍發現的CpG二核苷酸免疫刺激作用(Hemmi等人，2000)；以及(iii)利用DNA疫苗連同痘病毒載體的引發-加強(Prime-Boost)方案。
現有的抗原靶向策略包括利用(a)泛素融合體(泛素-A76或-G76-K)以靶向蛋白質進行多聚泛素化、在蛋白酶體內快速胞內降解及有效的MHC-I呈遞；(b)與溶酶體相關膜蛋白1(LAMP-1)融合，以靶向MHC-II途徑；(c)與腺病毒E3前導序列融合，以靶向表位到內質網(ER)；以及(d)與CTLA4融合，以靶向表位進行分泌，并由專職抗原呈遞細胞(APCs)攝取。
然而，許多DNA疫苗的效果較弱(Gurunathan S等人，2000)，需要開發改進的技術和分子，以調節對引起恢復或保護的DNA疫苗所表達蛋白質的免疫應答。
發明概述在本發明的前序工作中，發明人已經證明，當在哺乳動物細胞中表達戊型肝炎病毒(HEV)的全長衣殼蛋白質PORF2時，大約80％新合成的蛋白質轉運到內質網并快速降解，而20％蛋白質以完整形式蓄積存在于胞質溶膠中(4)。
根據本發明，發明人已經鑒定了HEV PORF2的N端肽序列，其允許不均一多肽加工(“加工肽”或“加工組分”)，并且已經利用這種加工肽序列開發了增強對目的抗原性多肽的免疫應答的策略。
發明人使用一系列表達載體(其編碼無融合蛋白質的ORF2.1片段(ORF2.1)或者融合HEV PORF2 N端序列的蛋白質)，在動物細胞中表達了HEV PORF2.1抗原性多肽片段；Sig1-ORF2.1具有PORF2的1-20位氨基酸，Sig2-ORF2.1具有PORF2的1-36位氨基酸，或者Sig3-ORF2.1具有PORF2的1-50位氨基酸。發明人確定，盡管發現ORF2.1蛋白質幾乎專門存在于可溶性胞質溶膠級分中，但Sig1肽幾乎專門被導向膜級分，而Sig2和Sig3肽引起不均一性定位。此外，就Sig2-ORF2.1和Sig3-ORF2.1多肽而言，發現胞質溶膠相關蛋白質穩定，而膜相關蛋白質則降解，與產生混合型免疫應答相符(分別為抗體和CTL反應)。
將ORF2的N端序列(Sig1、Sig2和Sig3)與谷胱甘肽S轉移酶融合時，顯示其以同樣方式被不均一性加工(即，定位和加工)，從而證實此發現具有廣泛的共性。
在對PORF2.1的抗體反應為可測定的大鼠模型中，測定較之未修飾蛋白質，加工肽增強對抗原性多肽的免疫應答的能力。Sig1-ORF2.1和Sig3-ORF-2.1誘導了增強的抗體反應，就Sig3-ORF2.1而言，大部分轉運的級分被快速降解，這有助于MHC-1途徑呈遞并誘導細胞免疫應答。
因此，本發明一方面提供在動物中增強對目的抗原性多肽免疫應答的方法，所述方法包含給予該動物有效量的包含編碼融合蛋白質的核酸構建體的組合物，該融合蛋白質包含加工組分和所述抗原性多肽，其中當在宿主細胞中表達該核酸構建體時，所述加工組分提供對抗原性多肽的不均一性加工，并導致對抗原性多肽的免疫應答增強。
本發明另一方面提供分離的核酸分子，其包含編碼加工肽的核苷酸序列，當所述核酸分子在宿主細胞中表達為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質時，所述加工肽能調節宿主對抗原性多肽的免疫應答。
再一方面，本發明提供分離的核酸分子，其包含編碼加工肽(其當所述核酸分子在宿主細胞中表達為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質時，所述加工肽能為目的抗原性多肽提供不均一性加工)的核苷酸序列。
本發明另一方面提供編碼加工肽的分離的核酸分子，當所述核酸分子在宿主細胞中表達為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質時，該加工肽能夠增強宿主對抗原性多肽的免疫應答，其中所述加工肽由戊型肝炎病毒ORF2核苷酸序列N端區域的毗鄰核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼。
本發明另一方面還提供編碼加工肽的分離的核酸分子，當所述核酸分子在宿主細胞中表達為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質時，該加工肽能夠調節宿主對抗原性多肽的免疫應答，其中所述加工肽包含選自戊型肝炎病毒PORF2蛋白質N端區域的大約5-100個毗鄰氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
在本發明的一個實施方案中，該分離的核酸分子包含基本上如SEQID NO4或SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所述的的核苷酸序列或其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發明另一方面還提供分離的多肽，其包含選自戊型肝炎病毒PORF2蛋白質N端區域的大約5-100個毗鄰氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
優選地，上述分離的多肽具有基本上如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發明再一方面提供包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述融合蛋白質包含加工組分和至少一個抗原性組分，其中當在宿主細胞中表達該核酸構建體時，所述加工組分為抗原性組分提供不均一性加工，并導致宿主中針對該抗原性組分的免疫應答增強。
本發明另一相關方面提供包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述融合蛋白質包含加工組分以及至少一個宿主中的抗原性組分，所述加工組分能夠增強對所述抗原性組分的免疫應答，并包含信號序列以及任選的中間肽，該中間肽包含基本上對應于能夠不均一性胞內加工的蛋白質的N端區域的氨基酸序列。
優選地，上述加工組分包含信號序列和中間肽，該中間肽包含基本上對應于能夠不均一性胞內加工的蛋白質的N端區域的氨基酸序列。
本發明另一方面還提供包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，所述融合蛋白質包含加工組分以及至少一個抗原性組分，所述加工組分能夠增強對所述抗原性組分的免疫應答，所述加工組分包含信號序列以及任選的中間肽，該中間肽包含基本上對應于戊型肝炎病毒主要結構蛋白質(PORF2)的N端區域的氨基酸序列，或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
優選地，上述加工組分包含信號序列和來自戊型肝炎病毒主要結構蛋白質(PORF2)的N端區域的中間肽序列，或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發明再一方面還提供包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述融合蛋白質包含加工組分以及至少一個抗原性組分，所述加工組分能夠調節宿主中對所述抗原性組分的免疫應答，并包含選自戊型肝炎病毒主要結構蛋白質(PORF2)的N端區域大約5-100個毗鄰氨基酸的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
在本發明特別優選的一個方面，該融合蛋白質的加工組分包含基本上如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列，其分別對應于PORF2的N端區域的1-22、1-36或1-50位氨基酸或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發明另一方面提供了分離的包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述融合蛋白質包含由戊型肝炎病毒ORF2基因5’區編碼的加工組分以及抗原性組分，其中當在宿主細胞中表達該核酸構建體時，所述的加工組分可調節宿主中針對抗原性組分的免疫應答。
本發明再一方面還提供包含上述核酸構建體的疫苗，例如病毒復制子或DNA分子。
本發明的一個相關方面提供了用上述核酸構建體轉染的細胞，例如抗原呈遞細胞。
本發明又一方面還提供了用于增強動物中免疫應答的組合物，其包含上述核酸構建體以及一種或多種藥物學上可接受的載體和/或稀釋劑。
本發明再一方面提供了調節動物中針對目的抗原的免疫應答的方法，所述方法包含，在足以調節對所述抗原的免疫應答的時間和條件下，給予動物有效量的上述核酸構建體、或者編碼或包含上述核酸構建體的疫苗或細胞。
本發明也涉及上述核酸分子或構建體在制備治療或預防疾病或感染(包括而不限于癌癥或癌前病變、自身免疫疾病、動物包括人及其它哺乳動物、魚或鳥中病毒、細菌或寄生蟲感染)的藥物中的應用。
附圖簡述
圖1提供了相對于戊型肝炎病毒PORF2全長蛋白質的sig1、sig2和sig3肽的圖譜，以及各個蛋白質的氨基酸序列。顯然可以預見到介于這些例子之間的中間大小蛋白質具有類似用途。
圖2為放射性標記的ORF2.1和sig1-2.1、sig2-2.1和sig3-2.1的免疫沉淀和PAGE示意圖，顯示編碼的蛋白質在細胞的胞質溶膠(c)或膜結合(m)部分的不同定位。注意ORF2.1和sig1-2.1具有均一性定位，而sig2-2.1和sig3-2.1具有不均一性定位。還應注意不同遷移率的多個條帶，是由于轉運到膜部分的蛋白質的部分糖基化造成的。
圖3為放射性標記的ORF2.1和sig1-2.1、sig2-2.1和sig3-2.1的免疫沉淀和PAGE分析示意圖，顯示編碼的蛋白質在細胞的胞質溶膠(cyto)或膜結合(memb)部分的不同定位(如圖2)，以及每一蛋白質種類在標記后0、1或4小時的不同穩定性。注意ORF2.1和sig1-2.1具有均一性加工(分別在4小時后降解或保持穩定)，而sig2-2.1和sig3-2.1具有與其不均一性定位(分別是cyto和memb)一致的不均一性加工(穩定和降解的)。
圖4為放射性標記的sig1-GST、sig2-GST和sig3-GST的免疫沉淀和PAGE分析示意圖，顯示編碼蛋白質在細胞的胞質溶膠(cyto)或膜結合(memb)部分的不同定位，以及每一蛋白質種類在標記后0或3小時的不同穩定性。注意sig1-GST具有不均一性定位(cyto加memb)但均一性加工(穩定的)，而sig2-GST和sig3-GST具有不均一性定位(cyto加memb)并且不均一性加工(穩定和降解的)。
圖5為動物或人中針對基于核酸或病毒載體的疫苗的免疫應答示意圖。(A).針對抗原蛋白質的免疫應答的一般模式，取決于其胞內加工和定位。注意大多數單一的蛋白質種類可能只遵循所示四個途徑之一。(B)利用融合目的抗原的sig肽預測的調節免疫應答的模式。在使用的實施例中，HEV的ORF2.1抗原是靶抗原，包含線性和構象性兩種B細胞表位，并可能包含T細胞表位，疫苗是基于質粒的DNA疫苗，其編碼ORF2.1、sig1-2.1或sig3-2.1、或泛素-2.1，產生快速降解的產物(參考文獻8和9)。給出了對接受不同疫苗的動物所預測的免疫應答途徑。注意在體液(抗體)和細胞兩種免疫應答的活化中，sig3-2.1不均一性定位和加工是獨特的，其兩種免疫應答之間正反饋的可能性增加。
縮寫Ab，線性線性肽表位的抗體。Ab，構象構象性肽表位的抗體。CTL細胞免疫應答。
圖6為表示用各種DNA疫苗構建體免疫的大鼠中針對HEV ORF2.1的抗體的產生示意圖(vec；單獨載體；單獨ORF2.1，Ub.2.1；泛素-A76-ORF2.1，sig1.2.1；Sig1-ORF2.1，sig3.2.1；Sig3-ORF2.1)。每組兩只大鼠，在0、4和8周通過肌肉內注射溶于鹽水的100μg DNA進行免疫，并在指定時間利用ORF2.1 ELISA測定抗體反應(安德森等人，1999)。
圖7為Western印跡示意圖，顯示在用DNA疫苗構建體免疫的大鼠中HEV ORF2.1的抗體的產生。利用Riddel等人(2000)所述方法，通過針對全長ORF2蛋白質的各種片段的Western免疫印跡，測試來自經Sig1-ORF2.1或Sig3-ORF2.1免疫的大鼠的抗體。注意Sig1-ORF2.1DNA疫苗誘導針對構象性ORF2.1表位的抗體，而Sig3-ORF2.1 DNA疫苗誘導針對構象性ORF2.1表位和線性表位兩種表位的高水平抗體，這與通過MHC-II途徑呈遞完整和降解的抗原相符。
表1SEQ ID NOS概述
優選實施方案詳述本發明部分依據對戊型肝炎病毒PORF2衣殼蛋白質N端肽的鑒定，這些肽賦予包含與異源蛋白質融合的這些肽之一的融合蛋白質以獨特的細胞內蛋白質加工模式。產生合適的表達載體以及克隆策略的方法為本領域公知。這樣，可以同時加工DNA疫苗編碼的抗原，以達到細胞和體液兩種免疫應答的最佳刺激。
可以預想到編碼與任何目的抗原性肽或多肽融合的本發明加工肽序列的核酸構建體，當其在宿主細胞中表達時，將會調節對目的多肽的免疫應答。
近來對核酸疫苗的研究表明，通過融合泛素，經由蛋白酶體途徑快速降解蛋白質，可以增強細胞免疫應答，但此種降解大大消除對同一蛋白質的抗體(體液)免疫應答(8和9)。類似地，通過以保持與細胞相結合的或者由細胞中分泌出來的形式表達相同抗原蛋白質，可激發不同的免疫應答(3)。因此，針對核酸疫苗的細胞和體液免疫應答對抗原的胞內蛋白質加工模式敏感。很多情況下，兩條免疫途徑均可能為疫苗的防護效力所必需，均衡的反應可能需要特定抗原蛋白質的不同加工。
在細胞內表達蛋白質抗原時，其胞內加工一般是均一性的。也就是說，蛋白質的每個拷貝基本上按相同方式加工，例如通過轉運到內質網，并隨后于細胞表面表達或分泌而被加工，或者通過滯留在胞質溶膠中或靶向蛋白酶體或其它降解途徑進行降解而被加工。結果，在給予核酸疫苗之后，其蛋白質表達將導致該編碼的蛋白質以均一模式加工，依特定蛋白質的加工途徑不同而偏向細胞或體液途徑的免疫應答。
對許多疾病而言，并不了解是體液還是細胞免疫力更可能提供對疾病防護或治療效果，可能兩種免疫應答通常均為最佳防護或治療效果所必需。另外，有許多疾病，其特征在于受侵襲個體中缺少防護或治療性免疫應答，例如癌癥和慢性病毒感染，如丙型肝炎、乙型肝炎和人類免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)感染。對于這些疾病，顯然疾病相關蛋白質抗原的常規蛋白質加工模式不能激發可導致復原或保護的免疫應答。
因此，本發明一方面提供增強動物對目的抗原性多肽的免疫應答的方法，所述方法包含給予所述動物有效量的其中包含編碼融合蛋白質的核酸構建體的組合物，該融合蛋白質包含加工組分和所述抗原性多肽，其中當宿主細胞表達該核酸構建體時，所述加工組分提供對該抗原性多肽的不均一性加工，并導致對該抗原性多肽的免疫應答增強。
在一個實施方案中，所述編碼加工組分的核酸構建體編碼包含如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物的加工組分。
此處涉及的“增強免疫應答”或“調節免疫應答”應當理解為，包含涉及上調和下調一種或多種免疫應答，并包含細胞和/或體液(抗體)免疫應答的最佳刺激，也可能包含兩種免疫應答之間有利的反饋機制。除細胞免疫應答之外還活化體液免疫應答也可能具有可調節炎癥反應和特別是TH1型免疫細胞的額外優勢。根據一個優選的實施方案，抗原性多肽的不均一性加工，可增強混合的免疫應答，即抗體和細胞兩種反應。
此處涉及融合蛋白質“加工組分”或“加工肽”時，應當理解為包含涉及特別影響融合蛋白質的胞內定位和/或蛋白酶解加工的肽或多肽。優選地，該加工組分能使抗原性組分在胞內不均一性定位。加工組分可來自HEV或者其它任何來源。加工肽可定位在抗原性多肽的5’處。可選地，加工多肽可在相對于抗原性多肽的3’位置起作用。再可選地，加工組分可從融合蛋白質內的嵌套位置起作用。很明顯，本發明人設想的融合蛋白質不包括天然存在的分子。本領域技術人員應當理解，此處所述方法可用來鑒定另外的允許對包含它們的融合蛋白質進行不均一性加工的加工肽。
本發明另一方面提供包含編碼加工肽的核苷酸序列的分離的核酸分子，當所述核酸分子在宿主細胞中表達為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質時，該加工肽能夠調節宿主針對該抗原性多肽的免疫應答。
本發明另一方面還提供上述分離的核酸分子，其包含基本上對應于戊型肝炎病毒ORF2基因N端區域的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發明另一方面更提供上述分離的編碼加工肽的核酸分子，該加工肽包含選自戊型肝炎病毒PORF2蛋白質N端區域的大約5-100個毗鄰氨基酸的序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
根據本發明的這個特定方面，氨基酸1是最N端的氨基酸。N端區域可包含多達約100個氨基酸。
優選地，被試肽包含PORF2 N端區域1-22或1-36位氨基酸，更優選地，被試肽包含PORF2的N端區域1-50位氨基酸，或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
根據本發明的這個方面，涉及“功能性”時，均包含多肽及其編碼多核苷酸，在宿主細胞表達該多核苷酸時，其能夠調節免疫應答。
本發明一方面提供包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述融合蛋白質包含加工組分和至少一個抗原性組分，所述加工組分位于抗原性組分的5’端，在宿主細胞中表達所述核酸構建體時，所述加工組分能夠增強宿主對該抗原性組分的免疫應答。
適用于本發明的核酸分子可能是任何形式的核酸分子，例如DNA或者RNA。
在本發明這方面的一個特定實施方案中，該加工組分包含能在宿主細胞中指導融合蛋白質定位到膜和胞質溶膠的信號序列，該融合蛋白質在幾小時內穩定，并可有效增強對抗所述原組分的抗體反應。
本發明的一個優選方面中，該加工組分提供不均一性胞內定位(即胞質溶膠和膜區室)和/或混合型胞內蛋白酶解加工(穩定和降解的)的特征。本發明不受任何一種作用模式或理論的限制，據認為本發明的加工組分同時靶向融合蛋白質，以達到細胞和體液免疫應答的最佳刺激。
因此，本發明另一方面提供包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述融合蛋白質包含加工組分以及至少一個抗原性組分，所述加工組分位于抗原性組分的5’端，并能夠調節宿主中對所述抗原性組分的免疫應答，所述加工組分包含信號序列以及任選的中間肽，其包含基本上對應于能夠進行細胞內不均一性翻譯后加工的蛋白質N端區域的氨基酸序列。
優選地，上述加工組分包含信號序列和中間肽，其包含基本上對應于能夠進行細胞內不均一性翻譯后加工的蛋白質N端區域的氨基酸序列。
此處涉及“信號序列”時，應當理解為包含涉及通常、但不一定必須位于新合成多肽的N端的肽。信號序列可指導細胞器的翻譯后攝取，并于蛋白質成熟時被切掉。它包含任何真核或原核的信號序列，可以是天然存在形式時與目的抗原蛋白質相關聯或來自任何其它有用來源。根據本發明，信號序列可能是全功能的并完全斷裂的，或者其斷裂和/或信號序列功能可能無效。本領域技術人員公知，可以利用各種已知算法預測多肽的信號序列(G.von Heijne等人，1989)。
本發明另一方面還提供包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述融合蛋白質包含加工組分以及至少一個宿主中的抗原性組分，所述加工組分位于抗原性組分的5’端，能夠調節對所述抗原性組分的免疫應答，所述加工組分包含信號序列以及任選的中間肽，其包含基本上對應于戊型肝炎病毒主要結構蛋白質(PORF2)的N端區域的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
優選地，上述加工組分包含信號序列和中間肽，其肽包含基本上對應于戊型肝炎病毒主要結構蛋白質(PORF2)的N端區域的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
此處涉及的“中間肽序列”應當理解為包含涉及位于信號序列3’端的序列，該3’序列可改變通過融合蛋白質上的加工組分賦于的加工特性。如同信號序列一樣，中間肽序列可以來自任何來源，包括戊型肝炎病毒PORF2 N端區域的。
本發明又一方面還提供了包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述融合蛋白質包含加工組分以及至少一個抗原性組分，所述加工組分位于抗原性組分的5’端，能夠調節對所述抗原性組分的免疫應答，所述加工組分包含信號序列以及中間肽，其中所述加工組分包含基本上對應于選自戊型肝炎病毒主要結構蛋白質(PORF2)N端區域的5-100個毗鄰氨基酸的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
在一個實施方案中，加工組分包含選自PORF2 N端區域的大約5-100個氨基酸，更優選30-90個，再優選20-60個氨基酸，或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
優選地，加工組分包含基本上如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述、分別相當于PORF2蛋白質N端區域的1-22、1-36或1-50位氨基酸的的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
根據本發明的這一方面涉及的“衍生物”，包含片段、部分、部分、等價物、類似物、突變體、模擬物或者同系物。多肽衍生物可能來自氨基酸插入、缺失或者置換。多核苷酸衍生物可以來源于單個或者多個核酸置換、缺失、和/或添加，包含與其它核酸分子融合。等價物應當理解為包含可作為功能類似物或激動劑的分子。例如可通過天然產物篩選檢測到等價物。涉及的“變體”包含與多肽或多核苷酸序列具有至少50％，或優選60％或65-80％，并最優選至少90％相似性的分子。可以通過誘突研究或合理設計，建立功能性變體。此外，多核苷酸變體也可能包含在中等嚴謹條件下能夠與本發明多核苷酸雜交的多核苷酸。
在本發明的一個相關方面，融合蛋白質的加工組分包含由基本上對應于HEV ORF2基因N端區域毗鄰核苷酸的1-300個核苷酸的序列編碼的肽。
優選地，該加工組分包含由基本上如SEQ ID NO4或SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所述的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼的肽。
本發明另一方面提供了包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列的核酸構建體，其中所述融合蛋白質包含由戊型肝炎病毒ORF2 5’區編碼的加工組分以及抗原性組分，其中當在宿主細胞中表達該核酸構建體時，所述加工組分可調節宿主中針對該抗原性組分的免疫應答。
本發明再一方面還提供了包含上述核酸構建體的疫苗。
本發明另一相關方面提供了用上述核酸構建體轉染的細胞。本發明適用的細胞可以是免疫細胞和/或呈遞細胞(其能夠在宿主生物內呈遞或靶向或引導融合蛋白質，以優化對抗原性組分的免疫應答)。根據這個方面，細胞可以在體外或體內轉染。特別優選的細胞類型是樹突狀細胞。
本發明又一方面還提供了用于調節動物中免疫應答的組合物，其包含上述核酸構建體以及一種或多種藥物可接受的載體和/或稀釋劑。
此處涉及的“動物”廣義地包含哺乳動物、鳥、魚和爬行動物，并擴展到例如而不限于人類、靈長類、家畜動物(例如羊、豬、牛、馬)相伴動物(例如狗、貓)、實驗室試驗動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉鼠)、捕獲的野生動物(例如狐貍、鹿)、籠養鳥類(例如鸚鵡)以及家禽鳥類(例如雞、鴨)動物。優選的被試動物是人或靈長類。最優選的被試者是人。
適于注射使用的藥物形式包括無菌水溶液(當水溶性時)，以及可即時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。在任何情況下，該形式必須是無菌的，并必須是易于注射的流體。它必須在生產和貯存條件下穩定，并必須防止微生物例如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇、等等)、其適當的混合物、以及植物油。可以通過例如利用卵磷脂包被、保持分散劑所需的顆粒大小以及利用表面活性劑維持適當的流動性。可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞(thirmerosal)等防止微生物作用。在很多情況下，其優選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。可以在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如一硬脂酸鋁和明膠，來延長該注射組合物的吸收。
如能適當地保護其活性成分，可以經口服給藥，例如與惰性稀釋劑或可吸收的食用載體一起，或者裝入硬殼或軟殼膠囊中，或者壓成片劑，或者直接混入膳食中。對于口服治療給藥，該活性化合物可以與賦形劑混合，并以可食入的片劑、頰含片、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮液、糖漿劑、干膠片等形式應用。這種組合物和制劑應當包含至少1％(重量)的活性化合物。當然可以改變該組合物和制劑的百分比，可以方便地介于單位重量的大約5-80％。活性化合物在這種治療用組合物中的數量，應使能夠獲得適當的劑量。根據本發明制備優選的組合物或者制劑，使得其口服單位劑型包含大約0.1μg-2000mg的活性化合物。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等也可以包含粘合劑例如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑例如磷酸氫鈣；崩解劑例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑例如硬脂酸鎂；以及甜味劑例如蔗糖、乳糖或可以添加糖精，或者調味劑例如薄荷油、冬青油、或櫻桃香精。如果單位劑型是膠囊劑，則除上述類型材料之外，還可以包含液體載體。其它多種材料可以用作包衣，或用于修飾劑量單位的外觀。例如，片劑、丸劑、或膠囊劑可以用蟲膠、糖或其兩者包被。糖漿劑或酏劑可包含活性化合物、甜味劑蔗糖、防腐劑對羥基苯甲酸甲酯和丙酯、染料以及香料，例如櫻桃或柑桔香料。當然，用于制備任何單位劑型的任何材料應該是藥物學純的，并在應用劑量內基本上沒有毒性。此外，活性化合物可以摻入緩釋制劑。
藥物可接受的載體和/或稀釋劑包含任意及所有溶劑、分散劑、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑或促進劑等等。為藥學活性物質應用此類介質和試劑為本領域所公知。除去與該活性成分或細胞不相容的任何常規介質或試劑之外，其均可考慮用于該治療組合物。補充的活性成分也可以摻入組合物中。
按照便于給藥和統一劑量的單位劑型配制非腸道組合物，特別有利。此處使用的單位劑型是指對于要被治療的哺乳動物受試者適合作為單元劑量的物理上的離散單元；每個單元包含經計算可產生目的治療效果的預定量的活性物質和所需藥物載體。對本發明新穎的單位劑型的說明取決并直接依賴于(a)活性物質的獨特特征和欲達到的特定治療效果，以及(b)本領域對混合此類活性物質用于治療活的受試者中的疾病所固有的限制，該活的受試者處于如此處詳述的身體健康失調的病態。
按照上文公開，將主要活性成分按有效量與藥學上可接受的合適載體混合，制成單位劑型，以方便和有效給藥。例如，每單位劑型可以包含總計0.5μg-約2000mg的主要活性化合物。按比例表示，通常每m1載體含活性化合物大約0.5μg-2000mg。就包含補充活性成分的組合物而言，參照所述成分的常用量和給藥方式，確定其劑量。
組合物形式的核酸構建體或疫苗可以通過任何方便方式給藥，例如而不限于，基因槍直接給藥、脂質體或聚合微球體傳送或者通過基于病毒的載體傳送。按特定情況的用量，藥用組合物制劑可預期展現其治療或預防活性。其變動取決于例如動物、給藥方法和治療需要。適用的劑量范圍很寬。例如，對于病人，每公斤體重可給予大約0.1μg-1mg的核酸構建體。可以調整劑量方案，以產生最佳的治療反應。可按照任何方便的方式給藥，例如通過口服、靜脈內(當水溶性時)、鼻內、腹膜內、肌內、皮下、皮內或栓劑途徑或者植入(例如利用緩釋分子)。
本發明又一方面提供了在動物中調節對目的抗原的免疫應答的方法，所述方法包含在足以調節對所述抗原的免疫應答時間和條件下給予所述動物有效量的上述核酸構建體、或者編碼或包含上述核酸構建體的疫苗或細胞。
上述方法可以提供包括在實驗動物或體外或體內生產抗體、包括單克隆抗體的特別有用的方法。
本發明也提供上述核酸構建體在制造治療或預防疾病或感染(包括而不限于癌癥或癌前病變、自身免疫疾病、病毒、細菌或寄生蟲感染)的藥物中的用途。
以下非限制性實施例更完全地描述了本發明的其它特性。
實施例1HEV融合蛋白質在細胞的胞質溶膠或膜結合部分的不同定位使用一系列表達載體在哺乳動物細胞中表達HEV編碼的抗原蛋白質ORF2.1，該表達載體編碼無融合蛋白質(ORF2.1)、或者具有sig1(sig1-2.1)、sig2(sig2-2.1)或sig3(sig3-2.1)的N端融合蛋白質的ORF2.1(圖1)。細胞在放射性甲硫氨酸和半胱氨酸存在下溫育，以標記新合成的蛋白質，將細胞分成可溶性胞質溶膠(c)和膜部分(m)，利用特異性ORF2.1多克隆抗體，通過免疫沉淀選擇包含ORF2.1序列的蛋白質，經SDS-PAGE和放射自顯影檢測。可以看出，顯然ORF2.1幾乎完全存在于可溶性胞質溶膠部分，sig1-2.1幾乎完全存在于膜部分，而sig2-2.1和sig3-2.1以相近比例存在于兩個部分中。注意多條不同遷移率的條帶，是由于轉運到膜部分的蛋白質的部分糖基化作用引起的，因為當用衣霉素處理細胞以防止N-糖基化時，這些條帶消失了(未顯示)。此圖表明每個sig蛋白質對細胞內蛋白質定位所帶來的獨特效果，特別是sig2和sig3帶來不均一性定位。
實施例2HEV融合蛋白質的不同穩定性如圖2所示，表達每種蛋白質的細胞在放射性氨基酸存在下溫育，然后在過量非放射性氨基酸存在下進一步溫育不同時間，如前所述分級分離并分析。通過比較放射性標記結束(時間0小時)、進一步溫育1或4小時后細胞中每種放射性蛋白質的量，可以確定每種蛋白質的加工模式。可以看出(圖3)，蛋白質ORF2.1主要發現于胞質溶膠中(cyto)，合成之后1小時是穩定的，而蛋白質sig1-2.1主要發現于膜部分(memb)，合成之后4小時是穩定的。相反，sig2-2.1和sig3-2.1于cyto和memb部分中均有發現，cyto-相關蛋白質4小時后是穩定的，而memb-相關蛋白質4小時后幾乎完全降解。因此預計，在這些實施例中，sig2-2.1和sig3-2.1由于其不均一性加工和定位，將引起對ORF2.1蛋白質的混合型免疫應答，而ORF2.1和sig1-2.1由于其均一性加工和定位，每種會引起單一模式的免疫應答。
實施例3SIG.GST融合蛋白質的不同定位和穩定性如實施例2所述，為在哺乳動物細胞中表達，將sig1、sig2或sig3與谷胱甘肽S轉移酶(GST)融合。在這個實施例中可以看出，sig1-GST在cyto和memb部分具有相同比例的不均一性定位，而兩個部分的均一性加工在4小時后是穩定的。相反，sig2-GST和sig3-GST在0小時時cyto和memb部分具有相同比例的不均一性定位，eyto部分的不均一性加工在3小時后是穩定的，而memb部分在3小時后幾乎完全地降解。因此預計通過利用這些sig1、sig2或sig3融合蛋白質，將會調節針對靶抗原例如GST的免疫應答。
實施例4Sig1、Sig2和Sig3的核酸序列利用帶有添加的限制性位點的引物經PCR擴增全長ORF2序列的適當片段得到以下序列。Sig1 SEQ ID NO4ATGCGCCCTCGGCCTATTITGCTGTTGCTCCTCATGTTTCTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCCSig2 SEQ ID NO5ATGCGCCCTCGGCCTATTTTGCTGTTGCTCCTCATGTITCTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCCGGTCAGCCGTCTGGCCGCCGTCGTGGGCGGCGCAGCGGCGGTSig3 SEQ ID NO6ATGCGCCCTCGGCCTATTTTGCTGTTGCTCCTCATGTTTCTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCCGGTCAGCCGTCTGGCCGCGTCGTGGGCGGCGCAGCGGCGGTTCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACCGGTTGATTCTCAGCCC用于表達的哺乳動物表達載體是pC1-neo(Promega)，其具有CMV立即早期啟動子、SV40多聚腺苷酸化以及嵌合的剪接信號。
實施例5用質粒構建體免疫Balb/C小鼠通過標準方法例如基因槍或肌肉內注射，將質粒構建體ORF2.1、sig1-2.1、sig2-2.1和sig3-2.1以及GST、sig1-GST、sig2-GST和sig3-GST中的每一種接種Balb/C小鼠證明sig1、sig2和sig3肽的活性，并利用例如特異性抗體同型方式、T細胞增殖反應、以及溶細胞性T細胞反應方法，比較接受每種疫苗的動物中的免疫應答。可以預料，此處所示實施例中在細胞培養物中觀察到的不同胞內加工方式，也會在接種DNA疫苗的小鼠細胞中發生，并將根據各個構建體的蛋白質加工，引起調節的免疫應答。可以通過將每個sig肽與其它目的抗原融合進行進一步測試，目的抗原包括而不限于流感病毒核蛋白(NP)和血細胞凝集素(HA)、丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒包膜和核心蛋白質、人免疫缺陷病毒包膜和gag蛋白質、以及源于人和動物的其它病毒、細菌、真菌和寄生蟲病原體的目的抗原、以及癌癥相關抗原。圖5為預期的每種疫苗構建體的不同免疫應答的示意圖。
總之，由核酸疫苗編碼的sig1、sig2和sig3以及源于HEV PORF2的相關肽，與單獨抗原或具有胞內均一性加工和定位模式的肽-抗原融合蛋白質(例如泛素-抗原融合蛋白質)相比，由于其不均一性的胞內加工和定位模式，將可應用于調節和增強對融合蛋白質抗原的免疫應答。
實施例6對融合異源蛋白質的HEV信號肽的免疫應答在0、4和8周肌內(IM)注射溶于鹽水中的100μgDNA，將ORF2.1系列質粒構建體給予大鼠，并利用ORF2.1 ELISA(Anderson等人，1999)測量抗體反應(表1、圖6、圖7)。編碼單獨ORF2.1或融合有泛素-A76的質粒未能激發任何可檢測的抗體，而Sig1-ORF2.1在2/2只大鼠中誘導強烈的抗體反應。最有趣的是，Sig3-ORF2.1在1/2只大鼠中誘導強烈的抗體反應。此外，大部分蛋白質(轉運的部分)在4h內降解，這很可能有利于MHC-I途徑呈遞和CTL反應的誘導。
通過針對ORF2蛋白質的不同片段的Western免疫印跡檢測大鼠中的抗體反應(Li等人，1997；Riddell等人，2000)，可以揭示對線性和構象性表位的反應性(圖7)。值得注意的是，Sig1-和Sig3-ORF2.1均誘導針對HEV ORF2.1構象性表位的抗體(Riddel等人，2000)，其被認為是對于DNA疫苗的廣泛效用重要的特性。還應注意，Western免疫印跡中SIG3-ORF2.1誘導的抗體反應性水平高于SIG1-ORF2.1，大概是由于呈遞給B細胞的是完整(構象性)和降解(線性)的抗原的混合物。
這些實驗因此證明與DNA疫苗編碼的未修飾蛋白質相比，Sig1和Sig3的融合可促進增強的抗體反應，并伴隨著一部分融合Sig3的蛋白質快速降解，這將導致CTL反應和抗體反應兩者的平衡，其將繼而改善編碼抗原例如感染物或腫瘤的抗原的DNA疫苗效果。
實施例7HEV信號肽靶向系統的廣泛應用在pCI-neo中制備DNA疫苗構建體來編碼Sig1和Sig3與下列抗原的融合體(i)HCV核心/E1/E2；(ii)HCV核心；(iii)HCV E1/E2；(iv)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；(v)流感核蛋白(NP)；(vi)流感血細胞凝集素(HA)。利用PCR從現有質粒擴增每種蛋白質的編碼序列，在各種情況下，還構建表達相應的全長(天然)蛋白質以及與泛素-A76的C端融合的全長蛋白質(對照，靶向MHC-I)的質粒。用每種質粒轉染Cos細胞，通過脈沖追蹤放射性標記、細胞分級分離、western免疫印跡以及免疫沉淀分析靶蛋白質的命運，以證明是否可以賦予各種靶抗原以HEV Sig1和Sig3的靶向作用。
每組6只小鼠，在0和4周每只通過肌內注射100μg載體(pCI-neo質粒，陰性對照)、或編碼形式為(a)全長蛋白質(對照)；(b)Ub-A76-蛋白質(對照)；(c)Sig1-蛋白質；(d)Sig3-蛋白質的靶抗原GST、ORF2.1、HBsAg、NP和HA之一的載體進行免疫。對應的蛋白質疫苗作為附加的對照。
在0、4、8和12周收集血液，在12周采集組織(淋巴結、脾)。通過ELISA確定全部以及同型特異性IgG反應，分別表示體液免疫應答的大小以及傾向Th1/Th2反應的替代標志。HA和NP的分析包括(a)CTL活性和(b)ELISPOT和/或胞內細胞因子染色，以確定其頻率以及特異性T細胞的Th1/Th2傾向性。
為更嚴格試驗HEV Sig1或Sig3所致效能，利用流感感染的亞致死小鼠模型，檢測HA和NP的DNA疫苗構建體。如前所述免疫動物，并在12周通過鼻內接種亞致死劑量的輕度流感病毒株激發全部動物。五天后無痛處死小鼠，采集肺組織，通過噬斑分析測定病毒載荷。這些研究將證實，HEV Sig序列的混合型靶向作用導致增強的免疫應答。參考文獻1.Anderson，D.，et al.(1999)J.Virolgical Methods 81131-1422.Gurunathan，S.et.al.(2000)Ann Rev Immunol.18927-74.3.Forns，X.，S.U.et.al.(1999).Vaccine.171992-2002.4.von Heijne G.et al(1989)Protein Eng.，25315.Khromykh，A.A.，et al.(1997).J Virol.711497-505.6.Li，F.，et al.(1997)J.Virological Methods 52289-3007.Riddell，M.，et al.(2000)J.Virol.748011-80178.Rodriguez F.，et.al.(1997).J Virol.718497-503.9.Rodriguez，F.，et.al.(1998)J Virol.725174-81.10.Torresi，J.，F.et.al.(1999).J Gen Virol.801185-8.11.Varnavski，A.N.et al.(1999)Virology.255366-75.12.Varnavski，A.N.et al.(2000).J Virol.744394-403.13.WolffJ.A.et.al.(1990)Science.2471465-8.
表2.DNA質粒編碼的HEV信號肽融合蛋白質的胞內加工和免疫原性概述構建體ER轉運 快速降解a分泌 抗體誘導bORF2.1 - + - -Sig1-ORF2.1 ++ - - ++++Sig2-ORF2.1 + + - ntSig3-ORF2.1 + + - ++UbA76-ORF2.1- + - -GST - - - ntSig1-GST+ - + ntSig2-GST+ + + ntSig3-GST+ + + ntUbA76-GST -+ nt nta4hr后靶蛋白質降解75％以上(即t1/2<2hr)。Sig2-和Sig3-蛋白質只有轉運部分降解。
b在0、4和8周肌內注射100μg DNA，每組2只大鼠，在12周測定ORF2.1-特異性Ab。
序列表<212>PRT<213>戊型肝炎病毒<400>1Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met1 5 10 15Leu Pro Ala Pro Pro Pro20<210>2<211>36<212>PRT<213>戊型肝炎病毒<400>2Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met1 5 10 15Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg20 25 30Arg Ser Gly Gly35<210>3<211>50<212>PRT<213>戊型肝炎病毒<400>3Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met1 5 10 15Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg20 25 30Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg Val Asp Ser35 40 45Gln Pro50<210>4<211>66<212>DNA<213>戊型肝炎病毒<400>4atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca60ccgccc66<210>5<211>108<212>DNA<213>戊型肝炎病毒<400>5atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca60ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggt 108<210>6<211>150<212>DNA<213>戊型肝炎病毒<400>6atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca60ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggttc cggcggtggt120ttctggggtg accgggttga ttctcagccc 150
權利要求
1.增強動物中對目的抗原性多肽免疫應答的方法，所述方法包括給予該動物有效量包含編碼包含加工組分和目的抗原性多肽的融合蛋白質的核酸構建體的組合物，其中當在宿主細胞中表達該核酸構建體時，所述加工組分提供對抗原性多肽的不均一性加工，并導致對該抗原性多肽的免疫應答增強。
2.權利要求1的方法，其中所述加工組分來源于戊型肝炎病毒PORF2蛋白質的N端區域。
3.權利要求1的方法，其中所述的編碼加工組分的核酸構建體編碼包含如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物的加工組分。
4.權利要求1的方法，其中所述加工組分包含基本上如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
5.權利要求1的方法，其中所述加工組分包含由基本上如SEQ IDNO5或SEQ ID NO6所述的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼的氨基酸序列。
6.增強動物中對病毒衣殼多肽的免疫應答的方法，所述方法包含給予所述動物有效量包含編碼包含加工組分和所述衣殼多肽的融合蛋白質的核酸構建體的組合物，其中所述加工組分由基本上如SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所述的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼，并對所述衣殼蛋白質提供不均一性加工，導致其免疫應答增強。
7.權利要求5的方法，其中所述加工組分由SEQ ID NO6所述的核苷酸序列編碼。
8.包含編碼加工肽的核苷酸序列的分離的核酸分子，當所述核酸分子在宿主細胞中表達為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質時，該加工肽可增強宿主對目的抗原性多肽的免疫應答。
9.包含編碼加工肽的核苷酸序列的分離的核酸分予，當所述核酸分子在宿主細胞中表達為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質時，該加工肽可提供對目的抗原性多肽的不均一性加工。
10.權利要求8或9中的分離的核酸分子，其中所述加工組分來源于戊型肝炎病毒PORF2蛋白質的N端區域。
11.權利要求8或9中的分離的核酸分子，其中所述加工組分由基本上如SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所述的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼。
12.根據權利要求8或9中的分離的核酸分子，其中所述加工組分包含基本上如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
13.分離的核酸構建體，其包含編碼融合蛋白質的核苷酸序列，該融合蛋白質包含加工組分和至少一個抗原性組分，所述加工組分包含基本上如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列，其中當在宿主細胞表達該核酸構建體時，所述加工組分提供對抗原性多肽成分的不均一性加工，并導致對該抗原性多肽的免疫應答增強。
14.權利要求8-12中任一項的核酸分子或權利要求13的構建體轉染的分離的細胞。
15.權利要求14的細胞，其中該細胞是抗原呈遞細胞。
16.包含權利要求8-13中任一項的核酸分子或構建體的核酸疫苗。
17.權利要求16的核酸疫苗，其中所述核酸疫苗包含病毒復制子。
全文摘要
本發明涉及增強對核酸疫苗的免疫應答的方法，其包含給予動物以編碼融合蛋白質的核酸構建體，該融合蛋白質包含加工組分和目的抗原性多肽，其中當在宿主細胞中表達該核酸構建體時，所述加工組分對該抗原性多肽提供不均一性加工，并導致免疫應答增強。該加工組分來源于戊型肝炎病毒PORF2的N端部分。
文檔編號A61P31/04GK1426472SQ01808764
公開日2003年6月25日 申請日期2001年3月30日 優先權日2000年3月31日
發明者李凡, D·A·安德森, D·F·J·波塞爾 申請人:麥克法蘭布奈特醫療研究與公共健康研究所有限公司