一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法

專利名稱：一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法。
背景技術：
炭疽是嚴重威脅人類健康的烈性傳染病，其病原體為炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)。由于其高毒性，炭疽桿菌是一種潛在的生物武器，曾被帝國主義作為致死戰劑之一。目前，皮膚炭疽在我國各地還有散在發生，不應放松警惕。因此，發展快速、靈敏的炭疽桿菌檢測方法具有重要意義。卩遼菌體裂解酶(bacteriophagelysins)是卩遼菌體在感染宿主菌末期表達的蛋白質，它通過水解細菌細胞壁的肽聚糖使子代噬菌體釋放。Y噬菌體裂解酶(PlyG)能夠特異性地殺死炭疽桿菌，同時也能夠裂解蠟樣芽孢桿菌RSVFl菌株，且RSVFl菌株是唯一對PlyG敏感的蠟樣芽孢桿菌菌株。Miri Yemini等人就曾以RSVFl菌株為模型，研究了基于噬菌體的炭疽桿菌檢測方法。李曼等人也RSVFl菌株為模型進行了殺滅試驗的相關研究。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法。本發明提供了一種用于定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl的試劑盒，包括PlyG蛋白；所述試劑盒的用途為如下(a)或(b): (a)定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl ； (b)定量檢測炭疽芽孢桿菌。所述PlyG蛋白為如下(I)或(2):
(I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(2)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解酶活性的由序列I衍生的蛋白質。所述試劑盒還可包括Iuc蛋白。所述Iuc蛋白為如下(3)或(4):(3)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(4)將序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有熒光素酶活性的由序列3衍生的蛋白質。所述試劑盒還可包括D-熒光素。所述試劑盒還可包括Profile-13560 (10X) ATP微生物快速檢測系統。所述試劑盒還可包括記載有如下公式的載體:y=l.2587X-3.2879，x代表蠟樣芽孢桿菌RSVFl總數以10為底的對數值，y代表發光值以10為底的對數值。所述試劑盒還可包括記載有如下公式的載體:y=l.2587X-3.2879，x代表炭疽芽孢桿菌總數以10為底的對數值，y代表發光值以10為底的對數值。本發明還保護以上任一所述的試劑盒在定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl中的應用。應用以上所述試劑盒檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl時，每個反應可以采用50 μ I D-熒光素/熒光素酶混合溶液、50 μ I PlyG蛋白濃度為0.09mg/ml的PlyG蛋白稀釋液和50 μ I待測菌液。本發明還保護以上任一所述的試劑盒在定量檢測炭疽芽孢桿菌中的應用。應用以上所述試劑盒檢測炭疽芽孢桿菌時，每個反應可以采用50 μ I D-熒光素/熒光素酶混合溶液、50 μ I PlyG蛋白濃度為0.09mg/ml的PlyG蛋白稀釋液和50 μ I待測菌液。本發明還保護所述PlyG蛋白在制備定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl的試劑盒中的應用。本發明還保護所述PlyG蛋白在制備定量檢測炭疽芽孢桿菌的試劑盒中的應用。目前以ATP生物發光法定量檢測細菌的研究往往采用細胞裂解液來裂解細菌從而釋放ΑΤΡ，大多不具有特異性和專一性。本發明以噬菌體裂解酶(PlyG)和熒光素酶(Iuciferase)為關鍵工具，以蠟樣芽孢桿菌RSVFl為模型，建立了熒光發光值與細菌數量之間的線性關系且二者相關性顯著(R2=0.9898)。本發明所建立的方法具備靈敏度高、特異性強、檢測快速等優點，為特異性定量檢測炭疽桿菌的研究及試劑盒開發奠定了基礎。對特異定量檢測炭疽桿菌的研究提供了有力的理論支持。


圖1 為 PCR 擴增得到的 PlyG、Iuc 基因片段；M:BM2000DNA Marker ；1 =PlyG 基因片段；2:luc基因片段。圖2為重組質粒pET22b_PlyG和重組質粒pET_luc的雙酶切鑒定結果；Ml:BM2000DNA Marker ；1: 重組質粒pET22b_PlyG的雙酶切鑒定結果；2:重組質粒pET22b_luc的雙酶切鑒定結果；M2:1kb Ladder DNA Marker。圖3為SDS-PAGE檢測裂解酶與熒光素酶的表達純化結果；Ml:蛋白質Marker (低)；M2:蛋白質Marker (寬)；1:將質粒pET22b (+)導入大腸桿菌BL21 (DE3)得到的對照菌進行步驟4得到的上清液；2:重組菌甲步驟4得到的上清液；3:純化后的PlyG蛋白液；4:重組菌乙步驟4得到的上清液；5:純化后的Iuc蛋白液。圖4為裂解酶的酶活性檢測。圖5為以平板計數的細菌總數的對數值[Ig(Cfu)]為X軸，以發光值的對數值[Ig(RLU)]為Y軸，制作的X、Y散點圖描繪關系曲線。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。裂解酶(又稱PlyG蛋白)如序列表的序列I所示，其cDNA的開放閱讀框如序列表的序列2所示。熒光素酶(又稱Iuc蛋白)如序列表的序列3所示，其cDNA的開放閱讀框如序列表的序列4所示。限制性內切酶Nde1、EcoRI_HF和T4DNA連接酶購自NEB公司。2XTransTaq HiFiPCR SuperMixII購自北京全式金生物技術有限公司；膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司；DNA Marker、Protein Marker和質粒提取試劑盒均購自北京博邁德生物技術有限公司。BHI(Brain Heart Infusion)培養基購自美國BD醫療器械有限公司。蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus) RSVFl =ATCC編號為4342 ;參考文獻:A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis, RaymondSchuch,Daniel Nelson&Vincent A.Fischetti， NATURE|V0L418|22AU⑶ST2002， www.nature, com/nature,884-889。質粒pET22b(+):購自 Novagen 公司，產品編號:69744-3。大腸桿菌BL21 (DE3):北京全式金生物技術公司。突光素酶檢測試劑盒:購自Promega公司，產品目錄號:E1500。D-突光素(Beetle Luciferin, Potassium Salt):購自 Promega 公司，產品目錄號為 E1601。Profile-13560 (10X) ATP微生物快速檢測系統:購自北京浩正智信科技有限公司。實施例1、裂解酶和熒光素酶的制備一、重組質粒的構建1、重組質粒pET22b_PlyG的 構建 (I)合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子，將合成的雙鏈DNA分子作為模板，用PlyG-F和PlyG-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1的泳道I。PI yG-F: 5，-GGAATTCCATATG |CATCACCATCACCATCAC[ ATGGAAATCCAA-3，；PIyG-R: 5，~CGGAATTCTTATTTAACTTCATACCACCAACCTTT~3，。PlyG-F中，下劃線標注限制性內切酶NdeI的酶切識別序列，方框標注His_tag的編碼序列；PlyG-R中，下劃線標注限制性內切酶EcoRI的酶切識別序列。PCR 擴增程序:94°C預變性 5min ；94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C 45sec, 35 個循環；72°C延伸 7min ;4°C恒溫。(2)用限制性內切酶NdeI和EcoRI雙酶切步驟(I)的PCR擴增產物，回收酶切產物。(3)用限制性內切酶NdeI和EcoRI雙酶切質粒pET22b (+)，回收約5400bp的載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質粒pET22b-PlyG0重組質粒pET22b_PlyG的酶切鑒定電泳圖(NdeI和EcoRI雙酶切)見圖2的泳道1，可以觀察到約5400bp和約740bp的DNA片段。根據測序結果，對重組質粒pET22b-PlyG進行結構描述如下:在質粒pET22b (+)的NdeI和EcoRI酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。2、重組質粒pET22b_luc的構建(I)合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子，將合成的雙鏈DNA分子作為模板，用Iuc-F和Iuc-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1的泳道2。Iuc-F: 5，-GGAATTCCATATG |CATCACCATCACCATCAC( GGATCCATGGAA-3，；Iuc-R: 5’ -CGGAATTCTTACACGGCGATCTTTC-3’。Iuc-F中，下劃線標注限制性內切酶NdeI的酶切識別序列，方框標注His_tag的編碼序列；luc-R中，下劃線標注限制性內切酶EcoRI的酶切識別序列。PCR擴增程序:94°C預變性 5min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C IOOsec, 35 個循環；72°C 延伸 7min ;4°C 恒溫。(2)用限制性內切酶NdeI和E·coRI雙酶切步驟(I)的PCR擴增產物，回收酶切產物。(3)用限制性內切酶NdeI和EcoRI雙酶切質粒pET22b (+)，回收約5400bp的載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質粒pET22b_luc。重組質粒pET22b_luc的酶切鑒定電泳圖(NdeI和EcoRI雙酶切)見圖2的泳道2，可以觀察到約5400bp和約1700bp的DNA片段。根據測序結果，對重組質粒pET22b-luc進行結構描述如下:在質粒pET22b(+)的NdeI和EcoRI酶切位點之間插入了序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。二、裂解酶的制備和純化1、將重組質粒pET22b_PlyG導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌甲。2、挑取步驟I得到的重組菌甲的單克隆，接種至含有ΙΟΟμ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養基，37°C、200rpm振蕩培養至OD6tltlnm=0.6 ;加入IPTG (使其濃度為lmmol/L)，16°C、200rpm振蕩培養24h。3、取步驟2得到的培養體系，IOOOOg離心IOmin,收集菌體沉淀。4、用pH7.2的PBS緩沖液重懸步驟3得到的菌體，超聲波破碎處理(使用JY88-1IDN超聲波細胞粉碎機，選擇60%功率，即功率約為20kHz，處理總時間90min，周期為超聲時間5s,間隙時間8s), IOOOOg離心IOmin,收集上清液。5、將步驟4得到的上清液用0.45 μ m濾膜過濾后進行鎳柱純化。鎳柱預裝柱:上海生工生物工程有限公司，產品目錄號為BSP079-3。純化過程按照鎳柱預裝柱的說明書操作，具體如下:(I)打開開關，將柱內的乙醇沖洗干凈；(2)用5-10倍柱體積(I柱體積=5ml, Iml樹脂可結合6mg蛋白)的N1-Native-O緩沖液平衡柱子，控制流速在lml/min;(3)上樣步驟4得到的上清液，收集的液體再過柱一次，控制流速0.5-lml/min ；(4)用5倍柱體積的N1-Native-O緩沖液過柱，直至在0D=280nm檢測時沒有蛋白洗出；(5)用5-10倍柱體積的N1-Native-20緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在Iml/min ；(6)用5-10倍柱體積的N1-Native-50緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在Iml/min ；
(7)用5-10倍柱體積的N1-Native-1OO緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在lml/min ；(8)用5-10倍柱體積的N1-Native-250緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在lml/min ；(9)用5-10倍柱體積的N1-Native-500緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在lml/min ；(10)用5-10倍柱體積的N1-Native-O緩沖液平衡柱子，保存在30%的乙醇中；N1-Native-O 緩沖液、N1-Native-20 緩沖液、N1-Native-50 緩沖液、N1-Native-1OO緩沖液、N1-Native-250緩沖液和N1-Native-500緩沖液均為鎳柱預裝柱配套出售的組件。收集N1-Native-250緩沖液和N1-Native-500緩沖液過柱后的液體并合并，即為純化后的PlyG蛋白液。將質粒pET22b (+)代替重組質粒pET22b_PlyG進行以上步驟1、步驟2、步驟3、步驟4和步驟5，得到的液體作為對照溶液 。純化后的PlyG蛋白液的聚丙烯酰胺電泳圖見圖3的泳道3。由圖3可見:重組菌甲步驟4得到的上清液中在相對分子量27kD處具有特異條帶，與已報道的PlyG蛋白大小一致，證明PlyG蛋白實現了可溶性表達；進行鎳柱純化后得到了電泳純的PlyG蛋白液。純化后的PlyG蛋白液中的蛋白濃度為0.9mg/ml。三、熒光素酶的制備和純化1、將重組質粒pET22b_luc導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌乙。用重組菌乙代替重組菌甲進行步驟二的2至5。得到純化后的Iuc蛋白液。純化后的Iuc蛋白液的聚丙烯酰胺電泳圖見圖3的泳道5。由圖3可見，重組菌甲步驟4得到的上清液中在相對分子量60kD處具有特異條帶，與已報道的Iuc蛋白大小一致，證明Iuc蛋白實現了可溶性表達，進行鎳柱純化后得到了電泳純的Iuc蛋白液。純化后的PlyG蛋白液中的蛋白濃度為0.3mg/ml。四、裂解酶的酶活性檢測1、用直徑為IOcm的培養皿制備裝有20ml固體BHI培養基的平板，將半固體BHI培養基于55°C加熱(55°C條件為純液體狀態)，取5ml半固體BHI培養基加入500微升對數期的蠟樣芽孢桿菌RSVFl菌液，混勻后均勻倒至固體BHI培養基平板上，室溫靜置lOmin，使其凝固。2、吸取1.5μ I步驟二制備的純化后的PlyG蛋白液，滴加于步驟I的BHI培養基平板的一個點；吸取1.5 μ I ρΗ7.2的PBS緩沖液，滴加于步驟I的BHI培養基平板的另一個點，30°C靜置30min，然后30°C倒置培養6h后拍照。照片見圖4。滴加純化后的PlyG蛋白液的區域出現透亮的圓形裂解斑，直徑約5mm。滴加PBS緩沖液的區域沒有裂解斑產生。五、熒光素酶的酶活性檢測1、用PH7.2的PBS緩沖液梯度稀釋步驟三得到的純化后的Iuc蛋白液。2、將10 μ I稀釋液與50 μ I熒光素酶檢測試劑盒中的檢測底物混合，置于熒光測定儀器(Profile-13560 (IOX) ATP微生物快速檢測系統)中測得相對發光單位(RLU)。進行三次重復實驗，以測得數值的平均值來表征熒光素酶的相對活性。純化后的Iuc蛋白液中，Iuc蛋白作為熒光素酶的比活力為3.3X1010RLU/mgo實施例2、制備不同濃度的蠟樣芽孢桿菌RSVFl菌液將蠟樣芽孢桿菌RSVFl的單菌落接種至3ml LB液體培養基，30°C、200rpm振蕩培養12小時，得到PO菌液。用LB液體培養基將PO菌液稀釋至10倍體積，即為Pl菌液。用LB液體培養基將PO菌液稀釋至20倍體積，即為P2菌液。用LB液體培養基將PO菌液稀釋至100倍體積，即為P3菌液。用LB液體培養基將PO菌液稀釋至200倍體積，即為P4菌液。用LB液體培養基將PO菌液稀釋至1000倍體積，即為P5菌液。用LB液體培養基將PO菌液稀釋至2000倍體積，即為P6菌液。用LB液體培養基將PO菌液稀釋至10000倍體積，即為P7菌液。 用LB液體培養基將PO菌液稀釋至20000倍體積，即為P8菌液。用LB液體培養基將PO菌液稀釋至100000倍體積，即為P9菌液。實施例3、平板計數法定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl將實施例2制備的PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液或P9菌液分別作為待測菌液進行如下步驟:吸取50 μ I待測菌液涂布于固體LB培養基平板，37°C倒置培養12小時；每種菌液設置三個重復處理，同時做空白對照。選取菌落數在30-300范圍內的稀釋度作為標準計算平均值，為平板計數結果。每個待測菌液做三組重復實驗，計算平均值為最終結果。PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液和P9菌液含有的蠟樣芽孢桿菌RSVFl的濃度見表I。實施例4、應用裂解酶和熒光素酶通過ATP發光法檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFlATP普遍存在于所有活的生物體中，當生物體死亡后，在細胞內酶的作用下，ATP很快被分解掉。所以通過測定樣品中的ATP濃度，即可推算出活菌數。熒光素酶以D-熒光素、A T P、O2為底物，將化學能轉化為光能，發出熒光。將實施例2制備的PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液或P9菌液分別作為待測菌液進行如下步驟:1、將D-熒光素、實施例1的步驟三制備的純化后的Iuc蛋白液和pH7.2的PBS緩沖液混合，使D-熒光素濃度為150mg/L, Iuc蛋白濃度為100mg/L,即為D-熒光素/熒光素
酶混合溶液。2、用pH7.2的PBS緩沖液將實施例1的步驟二制備的純化后的PlyG蛋白液稀釋至10倍體積，得到PlyG蛋白稀釋液。3、取50 μ I待測菌液，加入過濾比色杯中，比色杯下鋪一層濾紙，然后滴加4滴SRA試劑(非細菌細胞釋放液)，用壓力器對準比色杯頂端，按下壓力器把液體壓出至濾紙，再次滴加4滴SRA試劑，用壓力器對準比色杯頂端，按下壓力器把液體壓出至濾紙。4、將步驟3得到的比色杯放入3560 (10Χ)微光度計的抽屜中，加入50 μ I步驟2得到的PlyG蛋白稀釋液，放置2min以使細菌充分被裂解。5、吸取50 μ 1步驟1得到的D-熒光素/熒光素酶混合溶液加入到步驟4得到的比色杯中，吸排混勻3次，推回抽屜，記錄儀器讀數。過濾比色杯、SRA試劑和3560 (IOX)微光度計均為Profile-13560 (IOX) ATP微生物快速檢測系統的組件。每個待測菌液做三組重復實驗，計算平均值為最終結果。PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液或P9菌液檢出得到的發光值(RLU, relative light units)見表I。表I平板計數測得的待測菌液的細菌濃度與ATP發光法檢測所得的發光值
權利要求
1.用于定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl的試劑盒，包括PlyG蛋白；所述試劑盒的用途為如下(a)或(b): Ca)定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl ； (b)定量檢測炭疽芽孢桿菌； 所述PlyG蛋白為如下(I)或(2): (O由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (2)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解酶活性的由序列I衍生的蛋白質。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括Iuc蛋白； 所述Iuc蛋白為如下(3)或(4): (3)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (4)將序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有熒光素酶活性的由序列3衍生的蛋白質。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括D-熒光素。
4.如權利要求3所述的試劑 盒，其特征在于:所述試劑盒還包括Profile-13560(IOX)ATP微生物快速檢測系統。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括記載有如下公式的載體:y=l.2587x-3.2879，x代表蠟樣芽孢桿菌RSVFl總數以10為底的對數值，y代表發光值以10為底的對數值。
6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括記載有如下公式的載體:y=l.2587x-3.2879，x代表炭疽芽孢桿菌總數以10為底的對數值，y代表發光值以10為底的對數值。
7.權利要求1至5中任一所述的試劑盒在定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl中的應用。
8.權利要求1或2或3或4或6所述的試劑盒在定量檢測炭疽芽孢桿菌中的應用。
9.PlyG蛋白在制備定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl的試劑盒中的應用。
10.PlyG蛋白在制備定量檢測炭疽芽孢桿菌的試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法。本發明提供了一種用于定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVF1的試劑盒，包括PlyG蛋白；所述試劑盒的用途為如下(a)或(b)(a)定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVF1；(b)定量檢測炭疽芽孢桿菌。所述PlyG蛋白為如下(1)或(2)(1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(2)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解酶活性的由序列1衍生的蛋白質。本發明所建立的方法具備靈敏度高、特異性強、檢測快速等優點，為特異性定量檢測炭疽桿菌的研究及試劑盒開發奠定了基礎。對特異定量檢測炭疽桿菌的研究提供了有力的理論支持。
文檔編號C12Q1/06GK103146806SQ20131008526
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者張博, 米志強, 安小平, 張飛雄, 童貽剛 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所