專利名稱：一種培育轉基因雜交水稻的方法
一種培育轉基因雜交水稻的方法技術領域
本發明屬于轉基因生物安全技術領域，涉及一種培育轉基因雜交水稻的方法，特別涉及一種培育安全轉基因雜交水稻的方法。
背景技術：
雜種優勢是自然界普遍存在的現象。雜交育種就是通過不同品種間的雜交，在雜交后代的分離群體中篩選集合雙親優良性狀的個體并最終形成品種。但由于長期定向選擇，種內可用的優異基因逐漸減少，通過常規雜交育種方法選育能夠滿足人們需求的優良品種正面臨很大的挑戰，于是育種家們開始尋求將豐富的生物資源庫中的優異基因用于雜交育種的新方法和新途徑。
植物轉基因技術的迅猛發展，為育種家們提供了培育優質雜交種的新方法。利用轉基因技術培育雜交種，不但可以實現I個或多個目標基因的定向轉移，而且能打破有利基因和不利基因的連鎖，縮短育種進程。但轉基因飄流及其可能引起的環境后果等轉基因安全性問題越來越受到人們的關注，已成為限制轉基因雜交種應用的瓶頸問題之一。因此，探尋培育安全的轉基因雜交種的新方法勢在必行。
蛋白內含肽(Intein)是一類介導翻譯后蛋白剪接的內部蛋白元件，前體蛋白中Intein催化一系列反應，將其自身從前體蛋白中移去，并將兩側稱為Extein的蛋白片段以正常的肽鍵連接起來形成成熟蛋白，這個過程稱為蛋白剪接。蛋白剪接是一個非常快速的過程，Intein-Extein連接處的3個保守的氨基酸殘基直接參與蛋白的拼接反應,包括Intein N末端的Ser或Cys(基序A的第一個氨基酸),Intein C末端的Asn或Gln (基序G的最后一個氨基酸),C-extein起始端的Ser、Thr或Cys。Intein首先是在酵母中發現的。1990年Kane等[Kane PM, Yamashiro CT, Wolczyk DF, Neff N, Goebl M, Stevens TH(1990)Protein splicing converts the yeast TFPlgene product to the69_kD subunit ofthe vacuolar H(+)-adenosine triphosphatase.Science250:651 - 657]在研究酵母(Saccharomyces cerevisiae))液泡 H(+) 2ATPase 的 69kD 亞基基因 vmal 時，首次發現蛋白質的自我剪接現象。Intein普遍存在于三界生物系統(古細菌、真細菌和真核生物)中，目前在 InBase 庫中注冊的 intein 已有 580 多個(http: //www.neb.com/neb/inteins.html )。Intein 一般由128-1650個氨基酸殘基所組成，含有高度保守的基序A、B、F和G[NorenCJ, Wang J, Perler FB(2000)Dissecting the chemistry of protein splicing and itsapplications.Angew Chem Int Ed Engl39 (3): 450 - 466]。根據 Intein 是否含有居家核酸內切酶(homing endonuclease)結構域，可將其分為大Intein和小Intein,大Intein含有居家核酸內切酶結構域、N端和C端剪接域，其中居家核酸內切酶結構域不參與蛋白剪接，推測其功能是通過自導引的機制來促進Intein的轉移[Gimble FS, Thorner J(1992)Homing of a DNA endonuclease gene by meiotic gene conversion in Saccharomycescerevisiae.Nature357:301 - 306]。另外，根據N端和C端剪接域是否為共價連接，可將 Intein 分為 cis-splicing inteins 和 trans-splicing inteins [Wu H，Xu MQj LiuXQ(1998)Protein trans-splicing and functional min1-1nteins of a cyanobacterialDnaB Intein.Biochim Biophys Actal387:422 - 432]。發明內容
本發明的目的是提供一種培育轉基因雜交水稻的方法。
本發明所提供的培育轉基因雜交水稻的方法，具體包括如下步驟:
(I)將目的基因分成5’端序列和3’端序列兩部分；在所述目的基因的5’端序列的3’末端直接連接內含肽(intein)的N端剪接區的核苷酸序列，形成融合基因片段A ;在所述目的基因的3’端序列的5’末端直接連接內含肽(intein)的C端剪接區的核苷酸序列，形成融合基因片段B;
(2)為如下 I)或 II):
I)為如下 al)_a5):
al)將所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者中的一個導入水稻三系雜交體系中的恢復系，得到轉基因水稻恢復系；另一個導入所述水稻三系雜交體系中的保持系，得到轉基因水稻保持系；
a2)通過確定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻保持系基因組中的拷貝數(可采用Southern雜交檢測)及在染色體上的插入位點(可進行染色體定位分析)，得到滿足如下條件的所述轉基因水稻恢復系和所述轉基因水稻保持系，分別記作轉基因水稻恢復系-1和轉基因水稻保持系-1:
所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻保持系基因組中均以單拷貝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻保持系基因組中所位于的染色體編號相同；
a3)篩選(如抗生素壓力篩選)獲得轉基因水稻恢復系-1純合系和轉基因水稻保持系-1純合系；
a4)將步驟a3)所得的轉基因水稻保持系-1純合系與所述水稻三系雜交體系中的不育系雜交，獲得含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的轉基因水稻不育系；
a5)將步驟a3)所得的轉基因水稻恢復系_1純合系與步驟a4)所得的轉基因水稻不育系雜交，獲得同時含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的轉基因雜交水稻;
II)為如下 bl)_b4):
bl)將所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者中的一個導入水稻兩系雜交體系中的恢復系，得到轉基因水稻恢復系；另一個導入所述水稻兩系雜交體系中的不育系，得到轉基因水稻不育系；
b2)通過確定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻不育系基因組中的拷貝數(可采用Southern雜交檢測)及在染色體上的插入位點(可進行染色體定位分析)，得到 滿足如下條件的所述轉基因水稻恢復系和所述轉基因水稻不育系，分別記作轉基因水稻恢復系-1和轉基因水稻不育系-1:
所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻不育系基因組中均以單拷貝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻不育系基因組中所位于的染色體編號相同；
b3)篩選(如抗生素壓力篩選)獲得轉基因水稻恢復系-1純合系和轉基因水稻不育系-1純合系；
b4)將步驟a3)所得的轉基因水稻恢復系_1純合系與轉基因水稻不育系_1純合系雜交，獲得同時含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的轉基因雜交水稻。
在本發明的一個實施例中，具體是將所述融合基因片段A導入所述水稻三系雜交體系中的恢復系，得到轉基因水稻恢復系；將所述融合基因片段B導入所述水稻三系雜交體系中的保持系，得到轉基因水稻保持系。
在本發明中，所述內含肽具體為來自于集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)的DnaE內含肽。
在蛋白水平上，所述DnaE內含肽的N端剪接區的氨基酸序列具體為序列表中序列I。所述DnaE內含肽的C端剪接區的氨基酸序列為序列表中序列2。
在基因水平上，所述DnaE內含肽的N端剪接區的核苷酸序列具體為序列表中序列3。所述DnaE內含肽的C端剪接區的核苷酸序列為序列表中序列4。
在本發明中，所述目的基因具體為具有草甘膦抗性的G2-aroA基因；所述G2-aroA基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
進一步,所述G2_aroA基因的所述5’端序列為序列5的第1_885位；所述G2_aroA基因的所述3’端序列為序列5的第886-1335位。
在本發明的一個實施例中，所述水稻三系雜交體系中的恢復系具體為水稻品種中恢8006 ;所述水稻三系雜交體系中的保持系具體為水稻品種內香2B ;所述水稻三系雜交體系中的不育系具體為水稻品種內香2A。
在本發明中，所述方法步驟al)或bl)中，將所述融合基因片段A或所述融合基因片段B導入所述水稻三系雜交體系中的恢復系或所述水稻三系雜交體系中的保持系，具體是通過導入含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的重組表達載體實現的；
進一步，含有所述融合片段A的所述重組表達載體具體為在植物表達載體PCAMBIA1300的多克隆位點(如Hind III和EcoR I之間)處自上游到下游依次插入ubi啟動子、葉綠體導肽、融合 基因片段A、nos終止子后所得的重組質粒；含有所述融合片段B的所述重組表達載體具體為在植物表達載體PCAMBIA1300的多克隆位點(如Hind III和EcoRI之間)處自上游到下游依次插入ubi啟動子、葉綠體導肽、融合基因片段B、nos終止子后所得的重組質粒。
其中，所述ubi啟動子的核苷酸序列為序列表中序列6所示；所述葉綠體導肽的核苷酸序列為序列表中序列7所示；所述nos終止子的核苷酸序列為序列表中序列8所示。
本發明具有如下優點:本發明采用兩個基因片段分別導入三系雜交體系的恢復系和保持系，或兩系雜交體系的恢復系和不育系中，這樣在雜交時，親本A和親本B的花粉雖仍可隨風傳播，但其花粉中只帶有單個基因片段，即使飄流至其它非轉基因作物或近緣種，也不會產生有功能的完整目的蛋白。雜種Fl的花粉雖仍可隨風傳播，但兩個基因片段隨花粉同時飄流出去的頻率很低，使得基因飄流頻率可降低到閾值允許范圍內，從而達到培育安全轉基因雜交種的目的。
圖1為重組表達載體基因表達框示意圖。其中，A為含有融合基因片段A的重組表達載體pEnln ；B為含有融合基因片段B的重組表達載體pIcEc。A、B中UbiP均表示玉米多聚泛素蛋白基因Ubiqutin啟動子；CTS均表示菊花Rubisco小亞基的葉綠體信號肽；NosT均表示胭脂堿合成酶基因Nos的終止子；35SP均表示花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子；hptll均表示潮霉素磷酸轉移酶基因，提供潮霉素抗性；PolyA Signal均表示多聚腺苷酸加尾信號；RB均表示T-DNA右邊界；LB均表示T-DNA。
圖2為不同類型轉基因水稻的PCR檢測結果。其中，A為轉基因水稻中恢8006/pEnln ；B為轉基因水稻內香2B/pIcEc。A和B中，泳道M均為TranslOObp DNA分子量標準；泳道1-15 (或16)均為陽性待測轉基因水稻。
圖3為不同類型轉基因水稻的Southern檢測結果。其中，B’為轉基因水稻內香2B/pIcEc。具體的，I:Ec-l/EcoRI ；2:Ec-l/XhoI ；3:Ec-5/EcoRI ；4:Ec-5/XhoI ；5:Ec_28/EcoRI ；6:Ec-28/XhoI ；7:Ec-8/EcoRI ；8:Ec-8/XhoI ；9:轉基因水稻內香 2B/pCAMBIA1300/EcoRI (陰性對照)；10:pIcEc (陽性對照)。D，為轉基因水稻中恢8006/pEnIn。具體的，1:En-l/EcoRI ；2:En_l/XhoI ；3:En-6/EcoRI ；4:En_6/XhoI ；5:En-9/EcoRI ；6:En_9/XhoI ；7:En-12/EcoRI ；8:En_12/XhoI ；9:En-34/EcoRI ；10:En_34/XhoI ; 11:轉基因水稻中恢8006/pCAMBIA1300/EcoRI (陰性對照)；12:pEnIn (陽性對照)。
圖4為T1代轉基因雜交種的草甘膦抗性篩選結果。其中左圖為T1代轉基因雜交種，右圖為轉基因水稻中恢8006/pEnIn。
圖5為T1代轉基因雜交種的PCR檢測結果。具體的，泳道I為DNA分子量標準Trans5K DNA Marker ;泳道2為T1代轉基因雜交種擴增融合基因片段EnIn ;泳道3為中恢8006/pCAMBIA1300擴增融合基因片段EnIn ;泳道4為以水代替模板擴增融合基因片段EnIn ;泳道5為T1代轉基因雜交種擴增融合基因片段IeEe ;泳道6為內香2B/pCAMBIA1300擴增融合基因片段;泳道7為水代替模板擴增融合基因片段1忑。。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例中未詳細說明的操作步驟參照《分子克隆實驗指南》第三版相應部分(J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，科學出版社)或參閱所用試劑盒的說明書。
植物表達載體pCAMBIA1300:購自澳大利亞CAMBIA公司。
植物表達載體pBI121:上海希匹吉生物技術有限公司，貨號CPC087
水稻恢復系中恢8006:記載在“曹立勇，沈希宏，占小登等.雜交水稻新品種國稻6號的選育及栽培技術.糧食作物，2008 (3):55-56”一文，公眾可從中國農業科學院生物技術研究所獲得。
水稻不育系內香2A及其保持系內香2B:記載在“任鄄勝，李仕貴，肖培村等.水稻線粒體基因atp6啟動子突變導致的一種細胞質雄性不育型.西南農業學報，2009 (22):544-549” 一文，公眾可從中國農業科學院生物技術研究所獲得。
玉米品種鄭單958:購自北京德農種業有限公司。
Impactvectorl.4 質粒:購自 Wageningen UR (荷蘭)。
pMD19-T質粒:購自六合通經貿有限公司(產品目錄號:D102A)。
所用培養基配方如下表:
權利要求
1.一種培育轉基因雜交水稻的方法，包括如下步驟: (1)將目的基因分成5’端序列和3’端序列兩部分；在所述目的基因的5’端序列的3’末端直接連接內含肽的N端剪接區的核苷酸序列，形成融合基因片段A ;在所述目的基因的3’端序列的5’末端直接連接內含肽的C端剪接區的核苷酸序列，形成融合基因片段B ; (2)為如下I)或II):1)為如下al) -a5): al)將所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者中的一個導入水稻三系雜交體系中的恢復系，得到轉基因水稻恢復系；另一個導入所述水稻三系雜交體系中的保持系，得到轉基因水稻保持系； a2)通過確定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻保持系基因組中的拷貝數及在染色體上的插入位點，得到滿足如下條件的所述轉基因水稻恢復系和所述轉基因水稻保持系，分別記作轉基因水稻恢復系-1和轉基因水稻保持系-1: 所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻保持系基因組中均以單拷貝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻保持系基因組中所位于的染色體編號相同； a3)篩選獲得轉基因水稻恢復系-1純合系和轉基因水稻保持系-1純合系；a4)將步驟a3)所得的轉基因水稻保持系-1純合系與所述水稻三系雜交體系中的不育系雜交，獲得含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的轉基因水稻不育系； a5)將步驟a3)所得的轉基因水稻恢復系-1純合系與步驟a4)所得的轉基因水稻不育系雜交，獲得同時含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的轉基因雜交水稻； II)為如下bl) -b4): bl)將所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者中的一個導入水稻兩系雜交體系中的恢復系，得到轉基因水稻恢復系；另一個導入所述水稻兩系雜交體系中的不育系，得到轉基因水稻不育系； b2)通過確定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻不育系基因組中的拷貝數及在染色體上的插入位點，得到滿足如下條件的所述轉基因水稻恢復系 和所述轉基因水稻不育系，分別記作轉基因水稻恢復系-1和轉基因水稻不育系-1: 所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻不育系基因組中均以單拷貝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，兩者在所述轉基因水稻恢復系或所述轉基因水稻不育系基因組中所位于的染色體編號相同； b3)篩選獲得轉基因水稻恢復系-1純合系和轉基因水稻不育系-1純合系；b4)將步驟a3)所得的轉基因水稻恢復系-1純合系與轉基因水稻不育系-1純合系雜交，獲得同時含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的轉基因雜交水稻。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述內含肽為來自于集胞藻6803的DnaE內含肽。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述DnaE內含肽的氨基酸序列為序列表中序列I。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述DnaE內含肽的所述N端剪接區的氨基酸序列為序列I ;所述DnaE內含肽的所述C端剪接區的氨基酸序列為序列2。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述DnaE內含肽的所述N端剪接區的核苷酸序列為序列3 ;所述DnaE內含肽的所述C端剪接區的核苷酸序列為序列4。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述目的基因為具有草甘膦抗性的G2-aroA基因；所述G2_aroA基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述G2-aroA基因的所述5’端序列為序列5的第1-885位；所述G2-aroA基因的所述3’端序列為序列5的第886-1335位。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述水稻三系雜交體系中的恢復系為水稻品種中恢8006 ;所述水稻二系雜交體系中的保持系為水稻品種內香2B ;所述水稻三系雜交體系中的不育系為水稻品種內香2A。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，步驟al)或bl)中，將所述融合基因片段A或所述融合基因片段B導入所述水稻三系雜交體系中的恢復系或所述水稻三系雜交體系中的保持系，是通過導入含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的重組表達載體實現的。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于:所述方法中，含有所述融合片段A的所述重組表達載體為在植 物表達載體pCAMBIA1300的多克隆位點處自上游到下游依次插入ubi啟動子、葉綠體導肽、所述融合基因片段A、nos終止子后得到的重組質粒；含有所述融合片段B的所述重組表達載體為在植物表達載體pCAMBIA1300的多克隆位點處自上游到下游依次插入ubi啟動子、葉綠體導肽、所述融合基因片段B、nos終止子后得到的重組質粒。
全文摘要
本發明公開了一種培育轉基因雜交水稻的方法。該方法包括如下步驟將目的基因拆成5’端和3’端兩部分，分別與Intein的N端和C端剪接區的序列連接，形成融合基因A和融合基因B，將兩融合基因分別導入三系雜交體系的保持系和恢復系，或者兩系雜交體系的不育系和恢復系，雜交后獲得雜交種，所得雜交種同時含兩個基因片段，在intein介導的蛋白剪接下，兩無活性的蛋白片段重新組裝成完整有活性的目標蛋白，賦予雜交種目標性狀。這樣兩親本中雖含有部分基因片段，但不具功能，不會產生轉基因飄流引起的環境安全問題，雜交種的花粉雖能擴散出去，但同時含兩個基因片段的概率大大降低，很大程度上降低了轉基因飄流頻率，且還能避免自留種，更好的保護知識產權。
文檔編號C12N15/82GK103160529SQ20131008520
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者王旭靜, 王志興, 賈士榮, 靳茜, 唐巧玲 申請人:中國農業科學院生物技術研究所