專利名稱：硫酸慶大霉素的制備方法
技術領域：
本發明涉及抗生素發酵領域，具體涉及硫酸慶大霉素的制備方法。
背景技術：
硫酸慶大霉素為氨基糖苷類抗生素，對各種革蘭陰性細菌及革蘭陽性細菌都有良好抗菌作用，對各種腸桿菌科細菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬及銅綠假單胞菌等有良好抗菌作用，奈瑟菌屬和流感嗜血桿菌對該品中度敏感。對布魯菌屬、鼠疫桿菌、不動桿菌屬、胎兒彎曲菌也有一定作用。對葡萄球菌屬(包括金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌)中甲氧西林敏感菌株的約80%有良好抗菌作用，但甲氧西林耐藥株則對該品多數耐藥。對鏈球菌屬和肺炎鏈球菌的作用較差，腸球菌屬則對該品大多耐藥，硫酸慶大霉素與P內酰胺類合用時，多數可獲得協同抗菌作用。硫酸慶大霉素的作用機制是與細菌核糖體30S亞單位結合，抑制細菌蛋白質的合成，近年來革蘭陰性桿菌對慶大霉素耐藥株顯著增多。但使用現有慶大霉素生產配方進行發酵生產其產品雜質很高，很難符合《中國藥典》2010版的要求。
發明內容
本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種能夠解決硫酸慶大霉素傳統生產中存在的雜質高問題的硫酸慶大霉素的制備方法。為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:硫酸慶大霉素的制備方法，包括以下步驟:I)取慶大 霉素沙土孢子置于孢子斜面培養基上進行孢子培養，培養溫度為36°C，培養時間為10天，得到斜面培養后的慶大霉素孢子；2)將步驟I)中得到的斜面培養后的慶大霉素孢子進行搖瓶培養，搖瓶培養的孢子接入量為:孢子斜面挖取0.25cm2接入一個搖瓶，培養溫度為36°C，培養時間為42小時，得到慶大霉素搖瓶菌絲；3)將步驟2)得到的慶大霉素搖瓶菌絲置于種子培養基上進行種子培養，種子培養的接入量為:按種子培養基體積的千分之二接入搖瓶種子，培養溫度為36°C,培養時間為48小時，得到慶大霉素種子培養物；4)將步驟3)得到的慶大霉素種子培養物置于繁殖罐中進行擴大培養，擴大培養接入量為擴大培養基體積的20%，培養溫度為36°C，培養時間為42小時，得到慶大霉素繁殖培養物；5)將步驟4)得到的慶大霉素繁殖培養物置于發酵培養基上進行發酵，培養物的接入量為發酵培養基體積的20%，發酵溫度為34°C，發酵時間為120小時，得到慶大霉素發酵產物；6)將步驟5)得到的慶大霉素發酵產物進行酸化處理至pH值為2-3，得到慶大霉素酸化液；7)將步驟6)得到的慶大霉素酸化液進行中和處理，處理后得到pH值為6.8的慶大霉素溶液；8)將步驟7)得到的慶大霉素溶液以732樹脂進行吸附處理，得到吸附后慶大霉素溶液；9)將步驟8)得到的吸附后慶大霉素溶液上柱去除Ca2+、Mg2+、Cl'得到去除離子的慶大霉素溶液；10)將步驟9)得到的去除離子的慶大霉素溶液通過飽和樹脂后以質量百分含量為4.5%的氨水進行解析，得到慶大霉素解析液；11)將步驟10)得到的慶大霉素解析液以711樹脂進行脫色，得到慶大霉素脫色液；12)將步驟11)得到的慶大霉素脫色液以薄膜進行濃縮，得到慶大霉素濃縮液；13)將步驟12)得到的慶大霉素濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素；14)將步驟13)得到硫酸慶大霉素通過噴霧干燥制得硫酸慶大霉素成品。進一步的，上述的硫酸慶大霉素的制備方法，所述步驟I)中慶大霉素沙土孢子的制備方法為:a、沙土孢子培養基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%,硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1 %，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，瓊脂2.0%，余量為水；配制好的沙土孢子培養基在每個茄子瓶中分裝50ml，經溫熱滅菌后，斜放，凝固，溫熱滅菌條件為0.1MPa, 30分鐘；b、于超凈工作臺 上，在火焰保護下，用無菌接種棒挑取砂土孢子0.1g于茄子瓶斜面培養基內，先劃中線，而后從下而上往兩邊劃線，均勻鋪開，塞好棉塞；C、培養與保存:接種好的斜面包扎好后，37°C恒溫室架上培養10天，培養好的孢子斜面，4 °C冰箱儲存待用。進一步的，上述的硫酸慶大霉素的制備方法，所述步驟I)中，孢子斜面培養基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，瓊脂2.0%，余量為水。進一步的，上述的硫酸慶大霉素的制備方法，所述步驟2)中，搖瓶培養基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，瓊脂2.0%，余量為水。進一步的，上述的硫酸慶大霉素的制備方法，所述步驟3)中，種子培養基的配方按重量百分比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.5%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨
0.2%，二氯化鈷0.0005 %，余量為水。進一步的，上述的硫酸慶大霉素的制備方法，所述步驟4)中，擴大培養基的配方按重量百分比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.5%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨
0.2%，二氯化鈷0.0005 %，余量為水。進一步的，上述的硫酸慶大霉素的制備方法，所述步驟5)中，發酵培養基的配方按重量百分比計為:淀粉4.5 %，黃豆餅粉3.5 %，玉米粉1.0%，碳酸鈣0.7 %，蛋白胨
0.3%, 二氯化鈷0.0015%，硝酸鉀0.01份，硫酸銨0.1 %，泡敵0.01 %，余量為水。進一步的，上述的硫酸慶大霉素的制備方法，所述步驟6)中，酸化處理是以濃度30 %的鹽酸進行處理，調pH2 3 ;
所述步驟7)中，中和處理是以濃度40 %的氫氧化鈉進行處理，調pH6.8 ；所述步驟8)中，吸附處理所用的732樹脂為001X7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂；所述步驟9)中，去除Ca2+、Mg2+、Cr1的柱子為O Im高2m柱；所述步驟10)中，所述飽和樹脂是指每毫升樹脂吸附了 8萬單位慶大霉素得到的樹脂；所述步驟11)中，脫色處理所用的711樹脂為強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂；所述步驟12)中，濃縮量為500L/h，濃縮至原來的1/7 ；所述步驟13)中，硫酸的濃度為98%，調至pH5.3 ；所述步驟14)中，噴霧干燥的條件為進風溫度130°C，出風溫度85°C，噴速100L/h。本發明的有益效果為:本發明提供的硫酸慶大霉素的制備方法，能夠明顯降低硫酸慶大土霉素產品的雜質，符合《中國藥典》(2010版)的要求，且生產工藝簡單易操作。本發明與現有技術區別在于以下三點:孢子斜面培養基中硝酸鉀配比下降33% ；種子培養基中淀粉配比增加50% ;發酵培養基中玉米粉配比下降50%，碳酸鈣配比增加40%，蛋白胨配比增加50%，氯化鈷配比增加50%，硫酸銨配比增加50%。改進前生產的硫酸慶大霉素產品其產品總雜> 10%，西索米星>5%。本發明生產的硫酸慶大霉素產品其產品總雜< 5%，西索米星< 2%，小諾霉素(小諾米星)< 3%。具體驗證數據如表I和表2所示，表I為改進前生產硫酸慶大霉素的三批大罐的產品數據，表2為本發明生產硫酸慶大霉素的三批大罐的產品數據。表I
權利要求
1.硫酸慶大霉素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)取慶大霉素沙土孢子置于孢子斜面培養基上進行孢子培養，培養溫度為36°C，培養時間為10天，得到斜面培養后的慶大霉素孢子； 2)將步驟I)中得到的斜面培養后的慶大霉素孢子進行搖瓶培養，搖瓶培養的孢子接入量為:孢子斜面挖取0.25cm2接入一個搖瓶，培養溫度為36°C，培養時間為42小時，得到慶大霉素搖瓶菌絲； 3)將步驟2)得到的慶大霉素搖瓶菌絲置于種子培養基上進行種子培養，種子培養的接入量為:慶大霉素搖瓶菌絲按種子培養基體積的千分之二接入搖瓶種子，培養溫度為36°C，培養時間為48小時，得到慶大霉素種子培養物； 4)將步驟3)得到的慶大霉素種子培養物置于繁殖罐中進行擴大培養，慶大霉素種子培養物接入量為擴大培養基體積的20%，培養溫度為36°C，培養時間為42小時，得到慶大霉素繁殖培養物； 5)將步驟4)得到的慶大霉素繁殖培養物置于發酵培養基上進行發酵，慶大霉素繁殖培養物的接入量為發酵培養基體積的20%，發酵溫度為34°C，發酵時間為120小時，得到慶大霉素發酵產物； 6)將步驟5)得到的慶大霉素發酵產物進行酸化處理至pH值為2-3，得到慶大霉素酸化液； 7)將步驟6)得到的慶大霉素酸化液進行中和處理，處理后得到pH值為6.8的慶大霉素溶液； 8)將步驟7)得到 的慶大霉素溶液以732樹脂進行吸附處理，得到吸附后慶大霉素溶液； 9)將步驟8)得到的吸附后慶大霉素溶液上柱去除Ca2+、Mg2+、Cl—1，得到去除離子的慶大霉素溶液； 10)將步驟9)得到的去除離子的慶大霉素溶液通過飽和樹脂后以質量百分含量為4.5%的氨水進行解析，得到慶大霉素解析液； 11)將步驟10)得到的慶大霉素解析液以711樹脂進行脫色，得到慶大霉素脫色液； 12)將步驟11)得到的慶大霉素脫色液以薄膜進行濃縮，得到慶大霉素濃縮液； 13)將步驟12)得到的慶大霉素濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素； 14)將步驟13)得到硫酸慶大霉素通過噴霧干燥制得硫酸慶大霉素成品。
2.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中慶大霉素沙土孢子的制備方法為: a、慶大霉素沙土孢子培養基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，瓊脂2.0%，余量為水；配制好的慶大霉素沙土孢子培養基在每個茄子瓶中分裝50ml，經溫熱滅菌后，斜放，凝固，溫熱滅菌條件為0.1MPa, 30分鐘； b、于超凈工作臺上，在火焰保護下，用無菌接種棒挑取砂土孢子0.1g于茄子瓶斜面培養基內，先劃中線，而后從下而上往兩邊劃線，均勻鋪開，塞好棉塞； C、培養與保存:接種好的斜面包扎好后，37°C恒溫室架上培養10天，培養好的孢子斜面，4°C冰箱儲存待用。
3.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中，孢子斜面培養基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，瓊脂2.0%，余量為水。
4.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，搖瓶培養基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%,磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，瓊脂2.0%，余量為水。
5.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中，種子培養基的配方按重量百分比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.5%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05 %，蛋白胨0.2 %，二氯化鈷0.0005 %，余量為水。
6.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中，擴大培養基的配方按重量百分 比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.5%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷0.0005%，余量為水。
7.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素的制備方法，其特征在于，所述步驟5)中，發酵培養基的配方按重量百分比計為:淀粉4.5 %，黃豆餅粉3.5 %，玉米粉1.0%，碳酸鈣0.7%，蛋白胨0.3%，二氯化鈷0.0015%，硝酸鉀0.01%，硫酸銨0.1%，泡敵0.01%，余量為水。
8.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素的制備方法，其特征在于， 所述步驟6)中，酸化處理是以濃度30%的鹽酸進行處理，調pH2 3 ; 所述步驟7)中，中和處理是以濃度40%的氫氧化鈉進行處理，調pH6.8 ； 所述步驟8)中，吸附處理所用的732樹脂為001X7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂； 所述步驟9)中，去除Ca2+、Mg2+、Cr1的柱子為①Im高2m柱； 所述步驟10)中，所述飽和樹脂是指每毫升樹脂吸附了 8萬單位慶大霉素得到的樹月旨; 所述步驟11)中，脫色處理所用的711樹脂為強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂； 所述步驟12)中，濃縮量為500L/h，濃縮至原來的1/7 ； 所述步驟13)中，硫酸的濃度為98%，調至pH5.3 ； 所述步驟14)中，噴霧干燥的條件為進風溫度130°C，出風溫度85°C，噴速100L/h。
全文摘要
本發明公開了硫酸慶大霉素的制備方法，改進了生產過程中所用到的孢子斜面培養基、種子培養基和發酵培養基的組分用量。本發明的有益效果為本發明提供的硫酸慶大霉素的制備方法，能夠明顯降低硫酸慶大土霉素產品的雜質，符合《中國藥典》的要求，且生產工藝簡單易操作。改進前生產的硫酸慶大霉素產品其產品總雜＞10％，西索米星＞5％。本發明生產的硫酸慶大霉素產品其產品總雜＜5％，西索米星＜2％，小諾霉素(小諾米星)＜3％。
文檔編號C12P19/48GK103160552SQ20131009947
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月24日 優先權日2013年2月24日
發明者王玉紅, 葛祥斌 申請人:煙臺只楚藥業有限公司