專利名稱：一種異常威克漢姆酵母菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵技術領域，特別涉及一種異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus)菌種HJY-006及其在白酒生產中的應用。
背景技術：
中國白酒香味物質種類繁多，包括醇、醛、酮、酸、酯、縮醛、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物、醚類、內酯類等化合物達數百種之多(莊名揚，釀酒，2007.34(2): 109 一113)。中國白酒風味物質的形成，是微生物代謝的產物，同時也是原料中基本組分及非基本組分，在各類生物酶的直接或間接催化下的生物合成、非酶促化學反應和熱降解反應等多種因素共同作用結果。白酒的風味與釀造微生物及釀造工藝也有直接關系。釀造基酒質量的聞低對廣品的最終質量的好壞起決定性的作用。白酒釀造中的生香酵母又稱產酯酵母，主要屬于產膜酵母和假絲酵母，大多為異型漢遜酵母及少數小圓型酵母屬，是白酒和黃酒發酵產香的重要菌種(熊子書，釀酒科技，2002.5:19 — 21)。濃香型白酒以己酸乙酯為主的復合香，是由梭狀芽抱桿菌，俗稱己酸菌的作用，產于泥質發酵老窖或人工培養泥窖中，發酵周期長；清香型白酒以醋酸乙酯為主體香，在小曲、鼓曲或液態法白酒中添加生香酵母，在發酵過程中生成醋酸及其乙酯。酒精發酵過程中酯的產生量與特殊的酵母菌種種類有密切關系。白酒發酵要求釀酒菌劑具有產酯率高、產酒精率高并耐高溫。重量和質量相同的原料使用不同的釀酒菌劑，形成不同的酒精產量和酯含量。好的釀酒菌劑使同樣的原料酒精產量高、富含酯類，并使白酒純香。但傳統大曲雖然產酯率高，產酒率卻較低，特別是大曲構成成份復雜，使白酒質量不穩定。我國是白酒生產大國，隨著菌種篩選、誘變等技術的成熟，我國各地區先后篩選出了上千種產酯量較高的菌株或菌種。中國專利CN201210039242.2中公開了一株高產酯東方伊薩酵母菌Z19，該菌種液體發酵乙酸乙酯產量達27mg/100mL，酒精度為5.98% (v/v)；中國專利CN201110094875.9中公開了一株高產酯釀酒酵母基因工程菌，該菌種續渣發酵乙酸乙酯產量高達74.8mg/100mL，酒精度為7.1% (v/v);但釀造出的老白干口感不協調、不
理相白酒的風味特點取決于香味成分含量和量比關系，香味成分的來源和含量多少，取決于發酵工藝以及有益微生物參予代謝產物的不同。而老白干酒巧妙的運用了大曲中的霉菌、酵母菌、細菌等有益微生物，這決定了老白干酒的典型特征:不同于清香型白酒，有清香型酒的清、凈、爽的特點,但又比清香型酒醇厚,香味更大。由于生香酵母的重要意義，雖然目前已經篩選得到產酯量較高的菌株，人們還是希望通過改進篩選或誘變等方法得到產酯量和產酒精量適宜且配比最佳、香氣成分更協調的生香酵母，尤其在老白干生產中具有重要的意義，這也是本領域研究人員的長期追求
發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種產酯量、產酒精量配比最佳，香氣成分更協調，適合老白干生產的完全代表老白干酒的典型風格的生香酵母。本發明生香酵母菌株是從河北衡水老白干酒業股份有限公司的大曲中分離得到的異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus)新菌株,該菌株已經于2012年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號，(郵編100101),分類命名為異常威克漢姆酵母(wickerhamomycesanomalus)，保藏編號為 CGMCC N0.6983。本發明異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus)HJY_006通過下述方法篩選得到:1、取I 2克酒曲(由河北衡水老白干酒業股份有限公司提供)到裝有50ml麥芽汁的三角瓶中，于30°C搖床(200r/min)培養48小時，再取Iml接種到麥芽汁試管中培養，經過3次的轉接培養即可。麥芽汁制備:取大麥芽一定量，粉碎，加4倍于麥芽量的水,在55 60°C水浴中保溫糖化，不斷攪拌，經3 4h后，至糖化液與碘液反應不顯藍色為止。煮沸后過濾，將濾液稀釋至5° Β ,加入一定量乳酸,于115°C滅菌20min備用。固體培養基加2%瓊脂。2、取上述方法培養的酵母液，按10倍梯度逐級稀釋到10_7，取稀釋度為10_4、10_5、10_6、10_7各0.2ml的溶液，分別涂布于5° Be麥芽汁培養基平板，30°C培養48小時。3、挑取平板上長出的典型酵母單菌落進行描述性記錄，并同時制片鏡檢，從中挑出乳白色，表面濕潤、有光澤，圓形，邊緣整齊，隆起，不透明菌落，然后選擇不同類型的酵母菌落分別接于麥芽汁固體斜面培 養基上，于30°C培養48小時。4、取不同類型的酵母菌株，分別于30°C麥芽汁培養基培養7天，測定各發酵液中酯含量、酒精含量，篩選產酯、產酒精含量最高的菌株。5、26SrRNA基因序列測定挑取一環菌體于10 μ L滅菌水中，99°C、IOmin變性，離心取上清液做模板，使用試劑盒 TaKaRa Fungi Identification PCRKit(CodeN0.D317)，進行 PCR 擴增目的片段，反應結束后取5ul進行3%瓊脂糖凝膠電泳,使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0 (Code N0.DV805A)切膠回收目的片段，以Seq Forward為引物進行DNA測序。測序結果在GeneBank中利用Blast程序進行比對。采用特異性引物擴增后，獲得的26SrDNA序列在GeneBank的比對結果顯示，HJY-OO6 與異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus) (GU138438..1)的 26SrRNA 基因的相似性達到99%。結合菌體形態特征的鑒定結果，將菌株HJY-006確定為異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus)。本發明還提供了含有上述異常威克漢姆酵母(HJY-006)的酒曲。 本發明還提供了上述異常威克漢姆酵母(HJY-006 )新菌株和含有上述異常威克漢姆酵母(HJY-006)的酒曲在白酒生產中的應用。異常威克漢姆酵母(HJY-006)的優良特性:異常威克漢姆酵母(HJY-006)的最佳發酵培養基是高粱汁培養基，該菌株酒化力的最佳發酵工藝參數為:溫度29°C，培養時間59h，接種量5%和pH6.5，發酵液的酒精度為2.8%(v/v)。其產乙酸乙酯的最佳工藝參數為:溫度28°C，培養時間65h，接種量5%和PH4.5，其乙酸乙酯含量達到50.2mg/100mL。有益效果異常威克漢姆酵母(HJY-006)既產酒精又產酯，既能有一定的酒精產量，又能很好地滿足白酒對酯香的要求，兼具了酒精酵母和產酯酵母的雙重特性，成為老白干釀造過程不可缺少的特征性功能菌。其代謝特性對于老白干酒的典型風格特點的形成具有重要意義。
:圖1是HJY-006在顯微鏡下的菌體細胞形態圖2是HJY-006在培養皿內的菌落形態圖3是HJY-006發酵液中溫度與酒精含量的關系圖4是HJY-006發酵液中培養基與酒精含量的關系圖5是HJY-006發酵液中接種量與酒精含量的關系圖6是HJY-006發酵液中培養時間與酒精含量的關系
具體實施方式
:下面通過具體的實施方案敘述本發明的一種異常威克`漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus)菌種HJY-006。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。實施例1本發明生香酵母菌株是從河北衡水老白干酒業股份有限公司的大曲中分離得到的異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus)新菌株，該菌株已經于2012年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號，(郵編100101),分類命名為異常威克漢姆酵母(wickerhamomycesanomalus) HJY-006，保藏編號為 CGMCC No6983。本發明異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus)HJY_006通過下述方法篩選得到:1、取I 2克酒曲(由河北衡水老白干酒業股份有限公司提供)到50ml麥芽汁三角瓶中，于30°C搖床(200r/min)培養48小時，再取Iml接種到麥芽汁試管中培養，經過3次的轉接培養即可。麥芽汁制備:取大麥芽一定量，粉碎，加4倍于麥芽量的水,在55 60°C水浴中保溫糖化，不斷攪拌，經3 4h后，至糖化液與碘液反應不顯藍色為止。煮沸后過濾，將濾液稀釋至5° Β ,加入一定量乳酸,于115°C滅菌20min備用。固體培養基加2%瓊脂。2、取上述方法培養的酵母液，按10倍梯度稀釋到10'取稀釋度為lO'lO'lO—6、10_7各0.2ml的溶液，分別涂布于5° Be麥芽汁培養基平板，30°C培養48小時。3、挑取平板上長出的典型酵母單菌落進行描述性記錄，并同時制片鏡檢，從中挑出乳白色，表面濕潤、有光澤，圓形，邊緣整齊，隆起，不透明菌落，然后選擇不同類型的酵母菌落分別接于麥芽汁固體斜面培養基上，于30°C培養48小時。4、取不同類型的酵母菌株，分別于30°C麥芽汁培養基培養7天，測定各發酵液中酯含量、酒精含量，篩選產酯、產酒精含量最高的菌株。5、26SrRNA基因序列測定挑取一環菌體于10 μ L滅菌水中，99°C、IOmin變性，離心取上清液做模板，使用試劑盒 TaKaRa Fungi Identification PCR Kit (Code N0.D317)，進行 PCR 擴增目的片段，取5ul進行3%瓊脂糖凝膠電泳,使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0 (Code N0.DV805A)切膠回收目白勺片段，以SeqForward為引物進行DNA測序。測序結果在GeneBank中利用Blast程序進行比對。采用特異性引物擴增后，獲得的26SrDNA序列在GeneBank的比對結果顯示，HJY-OO6 與異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus) (GU138438..1)的 26SrRNA 基因的相似性達到99%。結合菌體形態特征的鑒定結果，將菌株HJY-006確定為異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus)。本發明還提供了含有上述異常威克漢姆酵母(HJY-006)的酒曲。本發明還提供了上述異常威克漢姆酵母(HJY-006 )新菌株和含有上述異常威克漢姆酵母(HJY-006)的酒曲在老白干酒發酵生香中的應用。實施例2:異常威克漢姆酵母HJY-006在液態條件下產酒精產酯實驗:
1、培養基制備:⑴麥芽粉培養基麥芽粉20g,蛋白胨Ig,萄萄糖20g,蒸懼水IOOOmL,pH調至6.0,121°C滅菌20min。固體培養基加2%瓊脂.
⑵大米麥芽培養基取粉碎后的麥芽和大米按質量比1:4混合后，加入5倍水，加耐高溫α —淀粉酶(酶活力:30000U/ml) 95°C液化60min，再加糖化酶(酶活力:50000U/ml) 64°C糖化3小時，過濾備用，糖度控制在12Brix，121°C滅菌30min。⑶純麥芽培養基取粉碎后的麥芽加4倍水，加耐高溫α —淀粉酶(酶活力:30000U/ml)95°C液化30min后，再加糖化酶(酶活力:50000U/ml)64°C糖化2.5小時，過濾備用，糖度控制在12Brix, 121。。滅菌 30min。⑷高粱汁培養基，取粉碎后的高粱加4倍水，加耐高溫α—淀粉酶(酶活力:30000U/ml)95°C液化50min，再加糖化酶(酶活力:50000U/ml)64°C糖化2.5小時，過濾備用，糖度控制在12Brix，121°C 滅菌 30min。(5)玉米汁培養基按GB/T20886-2007 的制備方法進行[1°1]。2、儀器設備
電子天平、生化培養箱、顯微鏡、高壓蒸汽滅菌器、蒸餾裝置和島津氣相色譜儀。3、酒精度的測定方法取成熟發酵液200mL加入到蒸餾瓶中，加入IOOmL蒸餾水，調pH在6.5左右，混勻后蒸餾，準確取出IOOmL蒸餾液，用酒精計測定酒精含量，同時測定溫度，轉換成20°C時的酒精度。4、香氣成分分析采用島津GC-14C氣相色譜儀對蒸餾后的溜出液進行測定，測定條件:大口徑毛細管柱，柱溫70°C，進樣器溫度250°C，檢測器溫度230°C。5、異常威克漢姆酵母HJY-006發酵單因素實驗通過對異常威克漢姆酵母HJY-006在不同溫度、不同培養基、不同接種量和不同發酵時間條件下，發酵產物的酒精度測定，確定其各自最佳溫度、培養基、接種量和發酵時間。(I)溫度對發酵力的影響由圖3可知，在23°C 28°C的范圍內，隨著溫度的升高，異常威克漢姆酵母HJY-006發酵液的酒精含量逐漸增大，在23°C時，發酵液的酒精含量最低，僅為1.29%vol，而在28°C時，發酵液的酒精含量最高，達到2.0%vol，相當于23°C時的
1.54倍。因此，該菌株的最佳發酵溫度為28°C。(2)培養基對發酵力的影響由圖4可以看出，在四種培養基中，酵母菌的生長存在一定的差異。玉米培養基中菌株HJY-006發酵液的酒精產量最低，僅為1.00%vol，高粱培養基中含量最高，達到2.10%vol，是玉米培養基的2.1倍`。因此，該菌株的最佳發酵培養基是高粱汁培養基。(3)接種量對發酵力的影響由圖5數據顯示，接種量在2%_5%的范圍內，隨著接種量的提高，發酵液的酒精含量逐漸增大，5%的接種量，發酵液酒精含量最高，達到1.9%vol。接種量繼續增大，酒精含量反而逐漸下降，在7%的接種量,酒精含量最低，僅為1.5%vol,相當于5%時酒精含量的77.4%。由此，5%是該菌株的最適宜的接種量。(4)培養時間對發酵力的影響由圖6可知，異常威克漢姆酵母HJY-006在36h_60h的范圍內，隨著發酵時間的延長，發酵液的酒精含量逐漸增大。在36h時，發酵液的酒精含量最低，僅為1.5%vol,當培養時間為60h時，發酵液的酒精含量最高，達到1.9%vol，是36h含量的1.3倍。因此，該菌株的最佳發酵時間是60h。6、異常威克漢姆酵母HJY-006發酵正交實驗表I異常威克漢姆酵母HJY-006L9 (34)正交實驗因素及水平
權利要求
1.一種異常威克漢姆酵母(wickerhamomyces anomalus) HJY-006，保藏編號為CGMCCN0.6983。
2.如權利要求1所述的一種異常威克漢姆酵母(wickerhamomycesanomalus)HJY-006，其特征在于，所述HJY-006的發酵培養基是高粱汁培養基，發酵工藝參數為:溫度29° C，培養時間59h，接種量5%和pH6.5。
3.如權利要求1所述的一種異常威克漢姆酵母(wickerhamomycesanomalus)HJY-006，其特征在于，所述HJY-006產乙酸乙酯的工藝參數為:溫度28° C，培養時間65h，接種量5%和ρΗ4.5。
4.含有權利要求1所述菌株的酒曲。
5.權利要求1-3任一所述的異常威克漢姆酵母(wickerhamomycesanomalus)HJY_006在白酒生產中的應用。
6.權利要求4所述的酒曲在白`酒生產中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種異常威克漢姆酵母HJY-006，已于2012年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo6983。該菌株酒化力的最佳發酵工藝參數為溫度29°C，培養時間59h，接種量5%和pH6.5，發酵液的酒精度為2.8%(v/v)。產乙酸乙酯的最佳工藝參數為溫度28°C，培養時間65h，接種量5%和pH4.5，乙酸乙酯含量達到50.2mg/100mL。該菌株既能有一定的酒精產量，又能很好地滿足白酒對酯香的要求，兼具了酒精酵母和產酯酵母的雙重特性，成為老白干釀造過程不可缺少的特征性功能菌。其代謝特性對于老白干酒的典型風格特點的形成具有重要意義。
文檔編號C12N1/16GK103184167SQ20131010239
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月27日 優先權日2013年3月27日
發明者張煜行, 張永增, 佟蘭欣, 劉彥龍, 程宗志 申請人:河北衡水老白干酒業股份有限公司